益智仁总黄酮超声辅助提取工艺
优化及其抗氧化活性

郑 义1,2，邵 颖1,2，陈安徽1,2，张娜娜1

（1.徐州工程学院食品（生物）工程学院，江苏 徐州 221000；

2.江苏省食品资源开发与质量安全重点建设实验室，江苏 徐州 221000）

摘 要：为优化益智仁总黄酮的超声辅助提取工艺，通过单因素试验考察乙醇体积分数、液料比、超声时间和超声功率对总黄酮得率的影响，在单因素试验的基础上，通过Box-Behnken试验设计，获得益智仁总黄酮超声辅助提取的最佳工艺；以总抗氧化能力、清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）自由基能力、清除超氧阴离子自由基能力、螯合铁离子能力为指标，评价了益智仁总黄酮的抗氧化活性。结果表明：超声辅助提取益智仁总黄酮的最佳工艺条件为乙醇体积分数65%、液料比40∶1（mL/g）、超声时间35 min、超声功率360 W，在此条件下益智仁总黄酮得率为0.50%；益智仁总黄酮具有较好的抗氧化活性，总抗氧化能力、清除DPPH自由基能力、清除超氧阴离子自由基能力和螯合铁离子能力均与黄酮质量浓度表现出一定的量效关系；益智仁总黄酮清除DPPH自由基、清除超氧阴离子自由基和螯合铁离子能力的半数有效浓度（EC50）分别为（2.85±0.20）、（0.87±0.05）g/L和（2.45±0.30）g/L。

关键词：益智仁；总黄酮；超声辅助提取；抗氧化活性

Optimization of Ultrasonic-Assisted Extraction and Antioxidant Activities of Total Flavonoids from
Alpinia oxyphylla Fruits

ZHENG Yi1,2, SHAO Ying1,2, CHEN An-hui1,2, ZHANG Na-na1

(1. College of Food Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221000, China;

2. Jiangsu Key Construction Laboratory of Food Resource Development and Quality Safe, Xuzhou 221000, China)

Abstract: The ultrasonic-assisted extraction of total flavonoids from Alpinia oxyphylla fruits was optimized by response surface methodology. One-factor-at-a-time experiments were carried out to investigate the effects of ethanol concentration, solvent-to-solid ratio, ultrasonic treatment time and power on the extraction yield of total flavonoids. This was followed by mathematical modeling based on a Box-Behnken design and response surface analysis. Antioxidant activities of total flavonoids from Alpinia oxyphylla fruits were evaluated by in vitro antioxidant assays: total antioxidant capacity, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity, superoxide anion radical scavenging activity and ferrous ion chelating ability. The results showed that the optimal extraction parameters were determined as 65%, 40:1 (mL/g), 35 min and 360 W for ethanol concentration, solvent-to-solid ratio, ultrasonic treatment time and power, respectively. The yield of total flavonoids from Alpinia oxyphylla fruits could be up to 0.50% under these conditions. Total antioxidant capacity, DPPH radical scavenging activity, superoxide anion scavenging activity and ferrous ions chelating ability of total flavonoids from Alpinia oxyphylla fruits were concentration dependent. The median effective concentrations (EC50) for DPPH radical scavenging activity, superoxide anion scavenging activity and ferrous ion chelating ability were (2.85 ± 0.20), (0.87 ± 0.05) and (2.45 ± 0.30) g/L respectively.

Key words: Alpinia oxyphylla fruits; total flavonoids; ultrasonic-assisted extraction; antioxidant activity

中图分类号：R284.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）06-0044-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201406009

益智仁为姜科植物益智（Alpinia oxyphylla）的干燥成熟果实，为卫生部认定的药食同源的物品之一。益智仁含有丰富的碳水化合物、脂肪酸、蛋白质、维生素、微量元素等营养成分[1]。益智仁可用于治疗肾虚遗尿、小便频数、脾寒泄泻、腹中冷痛等症状[2]。现代药理学研究表明，益智仁还具有抗肿瘤、神经保护、免疫调节等药理活性[3-6]。黄酮类化合物是益智仁的主要活性物质之一[7]，目前已从益智仁中分离出多种黄酮类物质，如白杨素、杨芽黄素、伊砂黄素、山萘酚-4’-O-甲醚等[8-11]。然而有关益智仁黄酮类化合物的提取工艺及抗氧化活性评价鲜有报道。传统黄酮类物质的提取主要采用溶剂浸提法，存在耗时长、提取率低等缺点。超声提取是利用超声波产生的空化、振动等效应破碎原料细胞壁，加速细胞内有效成分的溶出、扩散，具有提取时间短、提取率高、不破坏有效成分等优点，该法已广泛应用于天然产物的提取中[12]。本研究采用超声辅助技术提取益智仁总黄酮，利用响应面法对提取工艺进行优化，采用多种方法评价益智仁总黄酮的抗氧化活性，旨在为开发以益智仁黄酮类化合物为主的药品及功能食品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

益智仁产地海南；芦丁标准品（批号：100080-200707） 中国食品药品检定研究院；总抗氧化能力测定试剂盒 南京建成生物工程研究所；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）、菲咯嗪、氯化硝基四氮唑蓝（nitroblue tetrazolium，NBT）、核黄素、蛋氨酸 美国Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

TU-1810紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；BILON92-IID型超声波细胞破碎机 西安德派生物科技有限公司；R201L旋转蒸发器 上海申生科技有限公司；LGJ-10冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂；3K30高速冷冻离心机 美国Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 标准曲线的制作

采用亚硝酸钠-硝酸铝分光光度法[13]。称取干燥至恒质量的芦丁标准品25 mg，置于50 mL干燥烧杯中，加适量60%（V/V）的乙醇溶液，微热溶解，转移至100 mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀，得芦丁标准溶液（0.25 g/L）。精密吸取芦丁标准溶液0、1、2、3、4、5、6 mL，分别置于7只25 mL容量瓶中，各加50 g/L亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，静置6 min，加100 g/L三氯化铝试液1 mL，摇匀，静置6 min，再加50 g/L的氢氧化钠溶液10 mL，60%（V/V）乙醇定容至刻度，摇匀，静置15 min。以试剂空白做参比，在510 nm波长处测定吸光度A。以芦丁质量浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线，其线性回归方程为A＝0.0118C＋0.0025，R2=0.9995。

1.3.2 益智仁总黄酮的提取

益智仁洗净，适当切片，60 ℃干燥，恒质量后粉碎，石油醚脱脂3次，基本除去益智仁粉中的油脂，过60目筛，即为益智仁脱脂干粉。称取一定量的益智仁脱脂干粉，加一定体积分数的乙醇溶液，在相应的功率下，超声波细胞破碎机中提取一定时间，抽滤后得总黄酮提取液。总黄酮提取液浓缩后冷冻干燥得益智仁总黄酮粗粉。总黄酮粗粉溶解于适量60%（V/V）乙醇，按1.3.1节方法测定总黄酮得率。

总黄酮得率/%=益智仁总黄酮质量/益智仁脱脂干粉质量×100 （1）

总黄酮纯度/%=益智仁总黄酮质量/益智仁总黄酮粗粉质量×100 （2）

1.3.3 单因素试验

设定乙醇体积分数60%、液料比20∶1（mL/g）、超声时间30 min、超声功率400 W，固定其他条件，分别考察乙醇体积分数（40%、50%、60%、70%、80%）、液料比（10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1，mL/g）、超声时间（10、20、30、40、50 min）、超声功率（200、250、300、350、400 W）对益智仁总黄酮得率的影响，每组试验重复3 次，取其平均值。

1.3.4 Box-Behnken试验设计

根据Box-Behnken试验设计原理，在单因素试验的基础上，以影响益智仁总黄酮得率的4 个因素：乙醇体积分数（x1）、液料比（x2）、超声时间（x3）和超声功率（x4）为自变量，以总黄酮得率（Y）为响应值，设计四因素三水平试验，试验因素水平表如表1所示。每组试验重复3 次，取其平均值。

表 1 Box-Behnken试验因素水平表

Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken experiments

1.3.5 抗氧化活性测定

1.3.5.1 总抗氧化能力测定

将益智仁总黄酮配成质量浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0 g/L的溶液，按照总抗氧化能力检测试剂盒说明书操作，在520 nm波长处检测吸光度。在37 ℃时，每分钟每毫升样品溶液使反应体系的吸光度每增加0.01时，定义为一个总抗氧化能力单位。以VC作为阳性对照。

（3）

式中：AU为测定管吸光度；AC为对照管吸光度；N为反应体系稀释倍数（反应液总体积/取样量）；n为样品测试前稀释倍数。

1.3.5.2 清除DPPH自由基能力测定

取不同质量浓度（0.5～7 g/L）的益智仁总黄酮，参考Wu Huichun等[14]的方法，在517 nm波长处检测吸光度。以VC作为阳性对照。

清除率/%＝（1－（Ai－Aj）/AC）×100 （4）

式中：AC为1.5 mL蒸馏水加1.5 mL含0.1 mmol/L DPPH的体积分数95%乙醇所测定的吸光度；Ai为1.5 mL样品液加1.5 mL含0.1 mmol/L DPPH的95%乙醇所测定的吸光度；Aj为1.5 mL样品液加1.5 mL 95%乙醇所测定的吸光度。

1.3.5.3 清除超氧阴离子自由基能力测定

配制不同质量浓度（0.1～10 g/L）的样品溶液，采用光照核黄素体系法[15]，在560 nm波长处检测吸光度，VC作为阳性对照。

清除率/%=（A0－AS）/A0×100 （5）

式中：A0为光照空白管吸光度；AS为样品管的吸光度。

1.3.5.4 铁离子螯合能力测定

铁离子鳌合能力的测定采用Decker等[16]的方法，略有改动。在2 mL不同质量浓度（0.5～10 g/L）的样品溶液中，加入0.02 mL 5 mmol/L 的FeCl2，再加0.2 mL 5mmol/L菲咯嗪，室温下静置10 min，加入等体积的蒸馏水，摇匀，于562nm波长下测量吸光度。EDTA作为阳性对照。

铁离子螯合率/%=（A0－AS）/A0×100 （6）

式中：A0为空白对照的吸光度；AS为样品或阳性对照的吸光度。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 乙醇体积分数对总黄酮得率的影响

显著性差异分析采用Duncan法，a、b、c、d、e不同字母表示差异显著（P＜0.05）。下同。

图 1 乙醇体积分数对总黄酮得率的影响

Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yield of total flavonoids

如图1所示，乙醇体积分数小于60%时，总黄酮得率随乙醇体积分数的增大而增大，当乙醇体积分数超过60%以后，总黄酮得率又急剧下降。乙醇体积分数为60%的总黄酮得率显著高于乙醇体积分数为50%、70%的得率（P＜0.05）。主要原因是不同体积分数的乙醇极性不同，随着乙醇体积分数的增大，脂溶性物质如色素、鞣质等溶出增多，影响了总黄酮的浸出[17]。故乙醇体积分数宜为60%。

2.1.2 液料比对总黄酮得率的影响

图 2 液料比对总黄酮得率的影响

Fig.2 Effect of solvent-to-solid ratio on the yield of total flavonoids

如图2所示，总黄酮得率随着乙醇用量的提高而增大，液料比达到40∶1（mL/g）后，总黄酮得率增加缓慢，液料比为40∶1和50∶1（mL/g）时的总黄酮得率差异不显著（P＞0.05）。液料比过大，将会导致后续操作能耗加大，从降低成本、节约能源的角度考虑，液料比宜在40∶1（mL/g）左右。

2.1.3 超声时间对总黄酮得率的影响

图 3 超声时间对总黄酮得率的影响

Fig.3 Effect of ultrasonic treatment time on the yield of total flavonoids

如图3所示，总黄酮得率在10～30 min的超声时间内呈显著增加的趋势，超声时间超过30 min后，总黄酮得率增幅缓慢，超声时间为30 min和40 min时的总黄酮得率差异不显著，超声时间为40 min和50 min时的总黄酮得率差异亦不显著。考虑到能耗，故选择30 min为超声时间较优值。

2.1.4 超声功率对总黄酮得率的影响

由图4可知，总黄酮得率随着超声功率的增大而增大，但超声功率在350 W以后，总黄酮得率增幅缓慢，350 W和400 W时的总黄酮得率差异不显著。这是由于胞内物质的提取包括扩散、渗透、溶解等过程，超声功率增大，空化作用增强，导致细胞破裂程度增大，有利于黄酮的溶出，但当扩散达到平衡时，再增大超声功率，得率几乎不再增大[18]，故选择350 W为超声功率较优值。

图 4 超声功率对总黄酮得率的影响

Fig.4 Effect of ultrasonic power on the yield of total flavonoids

2.2 Box-Behnken试验

2.2.1 回归模型的建立与检验

表 2 Box-Behnken试验设计及结果

Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

对表2试验数据用多元回归拟合后，得到总黄酮得率（Y）与乙醇体积分数（x1）、液料比（x2）、超声时间（x3）和超声功率（x4）的回归方程：Y=0.474＋0.0317x1＋
0.025x2＋0.0242x3＋0.0342x4－0.01x1x2＋0.075x1x3－0.0375x2x3＋0.0375x2x4－0.025x3x4－0.0487x12－0.0912x22－0.1049x32－0.0749x42。

对该回归方程进行方差分析，结果见表3。

表 3 回归模型方差分析

Table 3 Analysis of variance for the regression model

该模型达到极显著水平（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），决定系数R2为0.9532，校正决定系数R2Adj为0.9063，信噪比RSN为14.95，可知该回归方程拟合度和可信度均很高，故可用于设计范围内的预测。

对表3回归模型系数的显著性分析可见，一次项的回归系数均达到极显著水平；平方项的回归系数均极显著；交互项中x1x3的回归系数达到极显著水平，x2x3和x2x4的回归系数达到显著水平，表明乙醇体积分数与超声时间、液料比与超声时间、液料比与超声功率的交互作用对总黄酮得率有显著影响。

2.2.2 两因素间的交互效应分析

为考察两因素间交互效应对总黄酮得率的影响，可固定其他因素为零水平，绘制响应面。由表3可知，乙醇体积分数与超声时间、液料比与超声时间、液料比与超声功率的交互作用对总黄酮得率有显著影响，其响应面分别如图5所示。响应面坡度越陡峭，表明总黄酮得率对于该因素的改变越敏感。由图5A可知，当乙醇体积分数处于较低水平时，随着超声时间的延长，总黄酮得率呈现出先缓慢上升后下降的趋势；当乙醇体积分数处于较高水平时，随着超声时间的延长，总黄酮得率呈现出先上升后缓慢下降的趋势。由图5B可知，当液料比处于较低水平时，随着超声时间的延长，总黄酮得率先急剧上升后缓慢下降；当液料比处于较高水平时，随着超声时间的延长，总黄酮得率呈现出先增加后缓慢下降的趋势。图5C中总黄酮得率的变化趋势与图5B类似。从图5可以得出，要达到最佳提取效果，提取条件应控制在乙醇体积分数65%左右，液料比40∶1（mL/g）左右，超声时间30～35 min，超声功率350～375 W。

A.乙醇体积分数与超声时间

B.液料比与超声时间

C.液料比与超声功率

图 5 两因素交互效应对总黄酮得率的影响

Fig.5 Interactive effects of four extraction parameters on the yield of total flavonoids

2.2.3 最佳条件优化及验证结果

通过对2.2.1节的回归方程求二阶偏导，得到最佳提取工艺条件为乙醇体积分数65.78%、液料比40.99∶1（mL/g）、超声时间33.41 min、超声功率365.46 W，在此条件下益智仁总黄酮得率理论值为0.49%。考虑实际操作情况，将最佳提取工艺修正为乙醇体积分数65%、液料比40∶1（mL/g）、超声时间35 min、超声功率360 W。在此修正条件下，实测总黄酮得率为0.50%，与理论值基本一致，益智仁总黄酮纯度为52.16%，表明该工艺对于指导生产实践具有一定的借鉴意义。

2.3 益智仁总黄酮的抗氧化活性

2.3.1 总抗氧化能力

抗氧化物质能使Fe3+还原成Fe2+，后者可与菲啉类物质形成稳固的配合物，通过比色可测出其抗氧化能力的高低[19]。益智仁总黄酮的总抗氧化能力如图6所示，在0.1～1.0 g/L的质量浓度范围内，益智仁总黄酮的总抗氧化能力随质量浓度增大而提高，质量浓度为0.1 g/L时，总抗氧化能力为（20.26±2.00）U/mL，质量浓度为1 g/L时，总抗氧化能力达到了（187.43±6.00）U/mL，在测定的质量浓度范围内，益智仁总黄酮的总抗氧化能力不及VC。

图 6 益智仁总黄酮的总抗氧化能力

Fig.6 Total antioxidant capacity of total flavonoids from
Alpinia oxyphylla fruits

2.3.2 清除DPPH自由基能力

DPPH法是评价抗氧化活性的常用方法，抗氧化物质可直接作用于DPPH自由基，使其颜色变浅，根据分光光度计可测定物质的抗氧化活性[20]。益智仁总黄酮对DPPH自由基的清除作用如图7所示。

图 7 益智仁总黄酮对DPPH自由基的清除作用

Fig.7 Scavenging effect of total flavonoids from Alpinia oxyphylla fruits against DPPH free radicals

由图7可知，在测定的质量浓度范围，益智仁总黄酮对DPPH自由基的清除能力呈现出剂量依赖性。质量浓度为1 g/L时，清除率为（20.35±1.00）%，质量浓度为3 g/L时，清除率为（48.97±2.00）%，质量浓度为6 g/L时，清除率达到了（92.96±3.00）%。益智仁总黄酮清除DPPH自由基的能力在低质量浓度时不如VC，但高质量浓度时与VC相当。

半数有效浓度（median effective concentration，EC50）是指清除率为50%时的样品质量浓度，如某种物质的EC50低于10 g/L，则表明其具有很好的抗氧化活性[9]。采用Logit回归计算出益智仁总黄酮及VC的EC50分别为（2.85±0.2）、（0.09±0.001）g/L。益智仁总黄酮清除DPPH自由基的EC50远小于10 g/L，由此可见益智仁总黄酮具有明显清除DPPH自由基的能力。

2.3.3 清除超氧阴离子自由基能力

图 8 益智仁总黄酮对超氧阴离子自由基的清除作用

Fig.8 Scavenging effect of total flavonoids from Alpinia oxyphylla fruits against superoxide anion free radicals

在测量的质量浓度范围内，益智仁总黄酮对超氧阴离子自由基的清除作用随着质量浓度的增加先增加，接着趋于平稳。当质量浓度为0.5 g/L时，清除率为（42.22±0.80）%；当质量浓度为2 g/L时，清除率为（67.75±2.00）%，当质量浓度为5 g/L时，清除率达到了（93.28±1.00）%；在测量的质量浓度范围内，益智仁总黄酮对超氧阴离子自由基的清除作用强于VC。益智仁总黄酮与VC对超氧阴离子自由基清除作用的EC50分别为（0.87±0.05）、（1.21±0.10）g/L。

2.3.4 铁离子螯合能力

图 9 益智仁总黄酮对铁离子的螯合作用

Fig.9 Ferrous ion chelating ability of total flavonoids from Alpinia oxyphylla fruits

在质量浓度为0.5～10 g/L的范围内，益智仁总黄酮对铁离子的螯合能力呈现出剂量依赖性。质量浓度为1 g/L时，螯合率为（20.50±0.70）%；质量浓度为6 g/L时，螯合率达到了（91.02±2.00）%；质量浓度为10 g/L时，螯合率96.48%。阳性对照EDTA在质量浓度为1 g/L时，螯合率已达到（86.92±1.00）%。益智仁总黄酮与EDTA对铁离子螯合能力的EC50分别为（2.45±0.30）、（0.12±0.02）g/L。

3 结 论

本研究建立了超声辅助提取益智仁总黄酮的最佳工艺条件，即乙醇体积分数65%、液料比40∶1（mL/g）、超声时间35 min、超声功率360 W，在此条件下总黄酮得率为0.50%。表明该模型具有较好的预测性能，对于指导生产实践具有一定借鉴意义。

在测定的质量浓度范围，益智仁总黄酮的总抗氧化能力、清除DPPH自由基能力、清除超氧阴离子自由基和螯合铁离子能力均随质量浓度的增加而增大。益智仁总黄酮清除DPPH自由基、清除超氧阴离子自由基和螯合铁离子能力的EC50分别为（2.85±0.20）、（0.87±0.05）、（2.45±0.30）g/L。益智仁总黄酮表现出较好的抗氧化活性，可作为潜在天然抗氧化剂应用于药品及功能食品中，而有关益智仁总黄酮的结构鉴定及动物模型实验有待进一步研究。

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