正交试验优化哈蟆油蛋白双酶法水解工艺

董 颖，张 鹤，周光新，赵大庆*，赵 雨，丛德毓

（长春中医药大学，吉林 长春 130117）

摘 要：目的：考察双酶法制备哈蟆油蛋白的最佳工艺。方法：以哈蟆油为原料，采用柠檬酸浸提和水煎煮的方法提取哈蟆油蛋白，先后加入胃蛋白酶和碱性蛋白酶进行酶解，根据酶解后哈蟆油蛋白相对分子质量分布，应用单因素和正交试验确定哈蟆油蛋白酶解的最佳条件。结果：最佳酶解条件为胃蛋白酶与底物比（m/m）1∶2000、酶解时间2 h、碱性蛋白酶与底物比（m/m）1∶100、酶解时间6 h，酶解后哈蟆油蛋白相对分子质量小于5000所占的比例为94.85%，哈蟆油蛋白中蛋白质含量为49.85%。结论：胃蛋白酶与碱性蛋白酶结合使用可以有效地降低哈蟆油蛋白的相对分子质量，利于人体吸收。

关键词：哈蟆油蛋白；胃蛋白酶；碱性蛋白酶；双酶法

Optimization of Two-Step Enzymatic Hydrolysis of Oviductus Ranae Protein by Orthogonal Array Design

DONG Ying, ZHANG He, ZHOU Guang-xin, ZHAO Da-qing*, ZHAO Yu, CONG De-yu

(Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, China)

Abstract: Objective: To optimize the two-step enzymatic hydrolysis of Oviductus Ranae protein. Methods: Oviductus Ranae protein was extracted by soaking in citric acid, homogenizing Oviductus Ranae and then decoting the homogenate with water, and sequentially hydrolyzed with pepsin and alkaline protease. Various hydrolysis parameters were optimized by single factor and orthogonal array design methods to obtain maximum percentage of peptides with molecular weight less than 5000. Results: The optimum hydrolysis conditions were obtained as follows: pepsin hydrolysis at an enzyme/substrate ratio of 1:2000 (m/m) for 2 h followed by alkaline protease hydrolysis at an enzyme/substrate ratio of 1:100 (m/m) for 6 h. The percentage of peptides with molecular weight less than 5000 in the hydrolysate obtained under these conditions was as high as 94.85%, and the protein content of the hydrolysate was 49.85%. Conclusion: The combined use of pepsin and alkaline protease can effectively decompose Oviductus Ranae protein for better absorption by the body.

Key words: Oviductus Ranae protein; pepsin; alkaline protease; double enzyme method

中图分类号：R284.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）06-0036-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201406007

哈蟆油（Oviductus Ranae）是中国林蛙（Rana chensinensis）雌蛙的干燥输卵管[1]，又称“林蛙油”，是我国东北特产的名贵中药[2]，具有明显抗疲劳[3]、抗衰老[4]、抗氧化[5]、增强机体免疫力[6]、调节人体内分泌等多种保健作用[7]。哈蟆油中主要含有蛋白质、氨基酸、脂肪酸、磷脂、激素及微量元素等多种成分[8]，其中蛋白质约占总量的一半以上[9]。哈蟆油中黏蛋白属于高度糖基化的大分子糖蛋白[10-12]，相对分子质量在3×106～40×106之间[13]，遇水易膨胀，膨胀度大于55[1]，且黏稠度较大，既不利于人体消化吸收，也不利于加工生产[14]。目前，市场主要以哈蟆油粗加工产品为主[15]，哈蟆油中多数成分不易被人体吸收。哈蟆油采用柠檬酸浸提和热水提取过程中，黏蛋白经酸解和热解后，其相对分子质量有所降低，但仍在几十万至几百万，水溶性较差，需进一步采用蛋白酶进行酶解。本实验采用胃蛋白酶和碱性蛋白酶双酶法制备哈蟆油蛋白，可以明显降低哈蟆油蛋白的相对分子质量，使哈蟆油蛋白更易被人体消化和吸收，提高了哈蟆油的营养价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

哈蟆油：由吉林省白山市北亚药业提供，经长春中医药大学中药鉴定教研室李宜平教授鉴定为中国林蛙Rana chensinensis雌蛙的干燥输卵管；胃蛋白酶、碱性蛋白酶 北京鼎国生物技术有限责任公司；凝胶色谱柱标准相对分子质量试剂（相对分子质量依次：6500、13700、29000、43000、75 000、158000、440000、669000） GE Healthcare公司；NaH2PO4•2H2O、Na2HPO4•2H2O、Na2SO4 美国Fluka公司；其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

1100型高效液相色谱仪 美国Aglient公司；TSKgelG2 000SW（XL）凝胶色谱柱 日本Tosoh公司；Uvmini-1240紫外分光光度计 岛津仪器有限公司；PL230电子天平、PHS-25数显酸度计 梅特勒-托利多仪器有限公司；WFO烘箱 上海爱郎仪器有限公司；LL3000冻干机 瑞典Jouna Nordic公司。

1.3 方法

1.3.1 哈蟆油原料预处理

哈蟆油去除筋膜等杂质后，置于阴凉处晾干，粉碎成细粉，－20℃冰箱保存。

1.3.2 哈蟆油总蛋白的提取

称取1.0 g哈蟆油细粉，按料液比（g/mL）1∶100加入pH4.5的柠檬酸溶液100 mL，浸泡36 h，匀浆后加入2 000 mL蒸馏水，煎煮2 h，冷却至室温，用10mmol/L HCl溶液调pH 2.89，定容至200 mL，哈蟆油蛋白质量浓度为5 mg/mL，备用。

1.3.3 胃蛋白酶和碱性蛋白酶的酶解条件

取5 mg/mL的哈蟆油蛋白提取液，首先加入适量的0.1 mg/mL胃蛋白酶溶液，放入烘箱中37 ℃加热酶解，酶解后样品煮沸15 min，使酶失活，放至室温，然后用10mmol/L NaOH溶液调节pH 9.0～10.0，再继续加入适量的1 mg/mL碱性蛋白酶溶液，烘箱中55 ℃进行二次酶解，酶解后样品煮沸15min，使酶失活，放至室温，调节pH 6.8～7.2，取样400 µL，0.22 µm滤膜过滤，备用。

1.3.4 哈蟆油蛋白相对分子质量测定

采用高效液相凝胶色谱法，根据酶解后哈蟆油蛋白相对分子质量分布情况进行评价。

相对分子质量小于5 000所占的比例/%=相对分子质量小于5 000所占的峰面积/总峰面积×100

1.3.5 高效凝胶色谱条件

流动相为0.08 mol/L NaH2PO4•2H2O、0.08 mol/L Na2HPO4•2H2O、0.08 mol/L Na2SO4，pH6.8；流速为1 mL/min；进样量为20 μL；检测波长为270 nm。

1.3.6 哈蟆油蛋白中蛋白质含量测定

采用紫外分光光度法测定哈蟆油蛋白中蛋白质含量[16]。制作氮含量(x，μg/mL）与吸光度（y）的标准曲线方程，回归方程为y=0.0698x－0.0022，R2=0.9991，依据回归方程计算出样品中的含氮量，根据含氮量乘以蛋白质换算系数得出哈蟆油蛋白中蛋白质质量。

哈蟆油蛋白中蛋白质含量/%=哈蟆油蛋白中蛋白质量/
哈蟆油蛋白质量×100

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 胃蛋白酶加酶量的确定

取10 mL哈蟆油蛋白溶液（5 mg/mL）5 份，选取胃蛋白酶与底物比（m/m，下同）分别为1∶500、1∶1000、1∶2 000、1∶5 000、1∶10000加胃蛋白酶溶液，37 ℃酶解3 h。然后再选取碱性蛋白酶与底物比（m/m，下同）为1∶250加碱性蛋白酶溶液，55 ℃酶解4 h，考察胃蛋白酶不同酶量对哈蟆油蛋白相对分子质量分布的影响。

图 1 胃蛋白酶不同加酶量对哈蟆油蛋白相对分子质量的影响

Fig.1 Effect of different doses of pepsin on the percentage of peptides with molecular weight less than 5 000 in hydrolysate

从图1可以看出，随着胃蛋白酶用量的增加，哈蟆油蛋白相对分子质量小于5 000所占比例逐渐增加，在酶与底物比1∶2 000以后，相对分子质量小于5 000所占比例变化较小，因此选择酶与底物比为1∶2 000。

2.1.2 胃蛋白酶酶解时间的确定

图 2 胃蛋白酶不同酶解时间对哈蟆油蛋白相对分子质量的影响

Fig.2 Effect of different pepsin hydrolysis durations on the percentage of peptides with molecular weight less than 5 000 in hydrolysate

取10 mL哈蟆油蛋白溶液（5 mg/mL）5 份，按胃蛋白酶与底物比1∶2 000加胃蛋白酶溶液，37 ℃分别酶解2、2.5、3、3.5、4 h。选取碱性蛋白酶与底物比为1∶250加碱性蛋白酶溶液，55 ℃酶解4 h，考察胃蛋白酶不同酶解时间对哈蟆油蛋白相对分子质量分布的影响。

由图2可以看出，随着胃蛋白酶酶解时间的延长，哈蟆油蛋白相对分子质量小于5 000所占比例的总体变化趋势相差较小，均在90%以上，表明胃蛋白酶酶解时间对哈蟆油蛋白酶解影响较小，因此确定胃蛋白酶酶解时间为2 h。

2.1.3 碱性蛋白酶酶量的确定

取10 mL哈蟆油蛋白溶液（5 mg/mL）5 份，按胃蛋白酶与底物1∶2 000加胃蛋白酶溶液，37 ℃酶解3 h。选取碱性蛋白酶与底物比为1∶100、1∶250、1∶500、1∶1000、1∶2 000加碱性蛋白酶溶液，55 ℃酶解4 h。考察碱性蛋白酶不同酶量对哈蟆油蛋白相对分子质量分布的影响。

图 3 碱性蛋白酶不同酶量对哈蟆油蛋白相对分子质量的影响

Fig.3 Effect of different doses of alkaline protease on the percentage of peptides with molecular weight less than 5 000 in hydrolysate

如图3所示，随着碱性蛋白酶酶量的增加，哈蟆油蛋白相对分子质量小于5 000所占比例显著增加，当碱性蛋白酶与底物比为1∶100时达到最大，为95.22%，表明碱性蛋白酶的用量对哈蟆油蛋白酶解影响较大，因此确定碱性蛋白酶与底物比为1∶100。

2.1.4 碱性蛋白酶酶解时间的确定

图 4 碱性蛋白酶不同酶解时间对哈蟆油蛋白相对分子质量的影响

Fig.4 Effect of different alkaline protease hydrolysis durations on the percentage of peptides with molecular weight less than 5 000 in hydrolysate

取10 mL哈蟆油蛋白溶液（5 mg/mL）5 份，按胃蛋白酶与底物1∶2 000加胃蛋白酶溶液，37 ℃酶解3 h。选取碱性蛋白酶与底物比1∶250加碱性蛋白酶溶液，55 ℃分别酶解2、3、4、5、6 h，考察碱性蛋白酶不同酶解时间对哈蟆油蛋白相对分子质量分布的影响。

如图4所示，哈蟆油蛋白相对分子质量小于5 000所占的比例随着碱性蛋白酶酶解时间的增加呈递增趋势，当酶解时间达到5 h以后，哈蟆油蛋白相对分子质量小于5 000所占比例的变化较小，因此选用碱性蛋白酶酶解时间为5 h。

2.2 正交试验结果

根据单因素试验结果，选择胃蛋白酶酶量（A）、胃蛋白酶酶解时间（B），碱性蛋白酶酶量（C）、碱性蛋白酶酶解时间（D）4 个因素，每个因素3 个水平，采用L9（34）正交试验表进行试验，以哈蟆油蛋白相对分子质量小于5 000所占比例为评价指标，对哈蟆油蛋白酶解条件进行优化。

根据单因素试验结果，确定正交试验的因素和水平见表1，正交试验结果见表2，方差分析结果见表3。

表 1 正交试验的因素水平表

Table 1 Factors and levels for orthogonal array design

表 2 正交试验设计及结果

Table 2 Orthogonal array design and results

表2表明，影响哈蟆油蛋白酶解的各因素主次顺序为C＞A＞D＞B；表3表明C因素（即碱性蛋白酶酶量）对哈蟆油蛋白酶解有显著影响（P＜0.05），而A、B、D因素影响较小（P＞0.05），因此优选出最佳工艺条件为A2B1C3D3，即胃蛋白酶与底物比为1∶2 000，胃蛋白酶酶解时间为2 h，碱性蛋白酶与底物比为1∶100，碱性蛋白酶酶解时间为6 h。

表 3 方差分析结果

Table 3 Analysis of variance for the experimental results of
orthogonal array design

注：F0.01 （1,2）=99；F0.05（1,2）=19。

2.3 验证实验

称取2.0 g左右哈蟆油3 份，按料液比1∶100加入pH 4.5的柠檬酸200 mL，浸泡36 h，匀浆后加入4L蒸馏水，煎煮2 h，冷却至室温，调节pH 2.0～3.0，按酶与底物比1∶2 000加入胃蛋白酶1.00mg，37 ℃酶解2 h，酶解后样品煮沸15 min，使酶失活，调节pH值至9.0～10.0，按酶与底物比1∶100加入碱性蛋白酶20.00mg，55 ℃酶解6 h，酶解后样品煮沸15 min，使酶失活，调pH 6.8～7.2，0.22 µm滤膜过滤，取样400 µL，注入高效液相色谱仪，记录保留时间和峰面积百分比，根据标准曲线估测哈蟆油蛋白相对分子质量大小。余下滤液冻干，取冻干粉按1.3.5节中蛋白质含量测定方法测定哈蟆油蛋白中蛋白质含量。

表 4 验证实验

Table 4 Results of experimental verification

从表4可以看出，酶解条件为胃蛋白酶与底物比1∶2 000、酶解时间2 h、碱性蛋白酶与底物比1∶100、酶解时间6 h时，哈蟆油蛋白相对分子质量小于5 000所占的比例平均为94.85%，哈蟆油蛋白中蛋白质含量为49.85%。

3 结 论

胃蛋白酶和碱性蛋白酶双酶法酶解哈蟆油蛋白，随着酶解时间的延长，哈蟆油蛋白水解物的黏度呈下降趋势[17]，这是由于哈蟆油中的黏蛋白被蛋白酶酶解成了小分子肽和低聚糖，破坏了侧链糖基的亲水性作用，使黏蛋白不能在分子周围束缚大量的水，打破了含水微环境保护屏障[18-19]，从而降低溶液的黏度，实验中，哈蟆油水提液只能浓缩到1 g/200 mL，而酶解液则能浓缩至1 g/25 mL，酶解液澄清度好，溶解性好，达到了良好的酶解效果，哈蟆油这种性质的改变，能够改善哈蟆油的流动性，使加工制备哈蟆油蛋白水解物产品更易进行。同时，水解液中90%以上哈蟆油蛋白相对分子质量小于5 000，存在大量分子质量大小不等的肽段，并且含有的多肽具有多种生物活性，据相关文献报道，哈蟆油非水溶性蛋白无耐缺氧作用，通过酶解法可以让哈蟆油耐缺氧功效从无到有[20]，哈蟆油酶解物不仅有效的维持了哈蟆油原药材具有的抗疲劳，降血脂功效，并且使耐缺氧和抗氧化等药理作用进一步增强，这为哈蟆油酶解工艺的合理性及产品开发提供了理论依据。

采用胃蛋白酶和碱性蛋白酶双酶法制备哈蟆油蛋白多肽，制备工艺稳定，哈蟆油蛋白提取率可达到80%以上，所得产品蛋白含量约为50%，产品营养价值高，既能满足人体对多肽的需要，又能加快哈蟆油产品深加工的发展，适合大规模生产。本实验对哈蟆油蛋白的酶解工艺进行了研究，优选出最佳酶解工艺条件为胃蛋白酶与底物比1∶2 000、胃蛋白酶酶解时间2 h、碱性蛋白酶与底物比1∶100、碱性蛋白酶酶解时间6 h，酶解得到哈蟆蛋白质相对分子质量小于5 000所占的比例可达到94.85%，哈蟆油蛋白中蛋白质含量为49.85%。本实验为进一步开发哈蟆油蛋白产品提供了参考依据。

参考文献：

[1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典: 一部[M]. 北京: 中国医药科技出版社, 2010: 239.

[2] 刘郁, 刘连新. 林蛙油的成分及药理研究进展[J]. 海峡药学, 2007, 19(12): 1-3.

[3] 毛焕新, 尤秀新, 程光惠, 等. 林蛙油软胶囊抗疲劳作用的试验研究[J]. 华南预防医学, 2005, 31(6): 40-41.

[4] 曹玲, 李艳梅. 简述哈蟆油的药理研究进展[J]. 黑龙江医药, 2002, 15(5): 384.

[5] 吴运明, 赵雨, 王思明, 等. 蛤蟆油水溶性总蛋白对小鼠耐缺氧及抗氧化能力的影响[J]. 食品科技, 2012, 37(4): 47-50.

[6] 衣春光, 李玉云, 张炜煜. 哈蟆油的免疫调节作用及其微球的制备工艺[J]. 吉林大学学报, 2011, 37(4): 665-669.

[7] 杨士慧, 赵雨, 张梅, 等. 哈蟆油非水溶性成分酶解物药理活性研究[J]. 食品科技, 2012, 37(4): 44-46.

[8] 包玉晓. 林蛙油化学成分的研究进展[J]. 畜牧兽医杂志, 2009, 28(3): 37-38.

[9] 李洪波, 刘玉翠. 名贵药材哈蟆油化学成分的现代研究进展[J]. 承德医学院学报, 2006, 23(3): 290-292.

[10] BU Xiaodong, LI Nan, TIAN Xiaoqiang, et al. Altered expression of MUC2 and MUC5AC in progression of colorectal carcinoma[J]. World Journal of Gastroenterology, 2010, 16(32): 4089-4094.

[11] JI Yuan, TAN Yunshan, XU Jianfang, et al. Mucins in the diagnosis and differential diagnosis of pancreatic cystic neoplasms: report of 40 cases[J]. Chinese Medical Journal, 2006, 119(9): 765-768.

[12] ZHANG Mei, LI Yuntong, YAO Baojin, et al. Transcriptome sequencing and de novo analysis for Oviductus Ranae of Rana chensinensis using illumina RNA-Seq technology[J]. Journal of Genetics and Genomics, 2013, 40(3): 137-140.

[13] 张梅. 哈蟆油酶解物制备工艺及药理活性研究[D]. 长春: 长春中医药大学, 2011.

[14] 张梅, 赵雨, 李芸彤, 等. 影响哈蟆油黏度的主要因素探究[J]. 食品科技, 2010, 35(12): 93-95.

[15] 王萍, 杨春瑜, 殷丽君. 林蛙油的成分及开发利用前景[J]. 国土与自然资源研究, 1999(2): 69-73.

[16] GB 5009. 5—2010 食品中蛋白质的测定[S].

[17] 王冰, 叶怀义. 木瓜蛋白酶作用于林蛙油蛋白质水解功能特性的研究[J]. 食品科学, 2004, 25(5): 62-65.

[18] SINGH P K, HOLLINGSWORTH M A. Cell surface-associated mucins in signal transduction[J]. Trends in Cell Biology, 2006, 16(9): 467-476.

[19] HATTRUP C L, GENDLER S J. Structure and function of the cell surface (tethered) mucins[J]. Annual Review of Physiology, 2008, 70: 431-457.

[20] 张梅, 赵雨, 杨士慧, 等. 哈蟆油酶解前后耐缺氧活性比较研究[J]. 江苏中医药, 2011, 43(6): 87-88.