黑灵芝多糖对Ⅱ型糖尿病大鼠肝脏氧化
应激损伤的保护作用

林素丽，朱科学，宋 丹，聂少平*，谢明勇

(南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047)

摘 要：目的：研究黑灵芝多糖对Ⅱ型糖尿病大鼠肝脏氧化应激损伤的保护作用。方法：高脂高糖结合小剂量链脲佐菌素(STZ)诱导Ⅱ型糖尿病大鼠动物模型，挑选成模的糖尿病大鼠，随机分为3组(每组8只)：糖尿病对照组、黑灵芝多糖组(100mg/(kg•d))，N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)组(100mg/(kg•d))。给药4周后，检测并分析各组大鼠肝功能指标、肝脏器官指数和肝糖原含量以及肝脏抗氧化指标，并利用RT-PCR法测定肝脏组织Bax、Bcl-2 mRNA的表达。结果：黑灵芝多糖(100mg/(kg•d))能够使Ⅱ型糖尿病大鼠肝脏指数显著降低，肝糖原含量显著增加，肝功能指标谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)趋于正常，超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性显著增加，丙二醛(MDA)含量显著降低。此外，黑灵芝多糖还能促进Bcl-2蛋白的表达，抑制Bax蛋白的表达。结论：黑灵芝多糖(100mg/(kg•d))对Ⅱ型糖尿病大鼠肝脏氧化应激损伤具有保护作用。

关键词：黑灵芝多糖；氧化应激；Ⅱ型糖尿病；抗氧化；Bax；Bcl-2

Protective Effect of Polysaccharide from Ganoderma atrum against Oxidative Stress-induced
Liver Injury in Type Ⅱ Diabetic Rats

LIN Su-li，ZHU Ke-xue，SONG Dan，NIE Shao-ping*，XIE Ming-yong

(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Abstract：Objective: To explore the protective effect of polysaccharide from Ganoderma atrum against oxidative stress-induced liver injury in type Ⅱdiabetic rats. Methods: An animal model of type Ⅱ diabetes was developed by feeding high fat diet to rats coupled with an injection of STZ at low dose (30 mg/(kg•d)). Type Ⅱ diabetic rats were randomly divided into three groups: diabetic control group, polysaccharide-treated (100 mg/(kg•d)) diabetic group and NAC (N-acetyl-L-cysteine, 100 mg/(kg•d))-treated diabetic group. Eight normal rats fed on standard normal chow diet served as a non-diabetic control group. At the end of 4 weeks experimental period, liver function (ALT and AST), liver index, liver glycogen and antioxidant enzyme activities (SOD, GSH-Px and CAT) as well as lipid peroxidation (MDA) were measured. Bax and Bcl-2 mRNA expression levels were analyzed by RT-PCR. Results: Ganoderma atrum polysaccharide significantly improved liver function and liver index, and also increased glycogen content and antioxidant enzyme activities as well as decreased MDA content in liver of diabetic rats. Moreover, Bcl-2 expression was promoted whereas Bax expression was inhibited. Conclusion: Polysaccharide from Ganoderma atrum (100 mg/(kg•d)) may improve the liver function of type Ⅱ diabetic rats through antioxidant effect.

Key words：polysaccharide from Ganoderma atrum；oxidative stress；type Ⅱ diabetes；antioxidant；Bax；Bcl-2

中图分类号：R575.5 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)21-0302-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201321060

肝脏是机体内平衡糖、脂代谢的主要器官，糖尿病肝损伤是一种常见的糖尿病慢性并发症，持续高血糖及脂代谢紊乱是导致肝损伤的主要诱因。黑灵芝多糖是黑灵芝的主要活性物质之一[1]，近几年，研究发现黑灵芝多糖能抑制S180荷瘤小鼠的肿瘤生长，具有抗肿瘤活性[2]；通过激活PI3K/Akt/MAPK/NF-κB信号通路发挥免疫调节活性[3]；抑制自由基产生，增强体内抗氧化酶的活性，减少过氧化脂质的生成，通过提高机体抗氧化能力来延缓衰老[4-5]。本实验室前期研究还表明，黑灵芝多糖对高脂高糖结合小剂量链脲佐菌素(STZ)诱导的Ⅱ型糖尿病大鼠具有明显的降血糖、降血脂、增加胰岛素敏感性作用[6]。

同时，前期的研究结果发现黑灵芝多糖可以通过升高线粒体膜电位、降低细胞色素C蛋白质表达和氧化应激状态，发挥其生物活性功能[2,7]。N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)是一种巯基抗氧化物质，是细胞内还原型谷胱甘肽的前体，对维持细胞内谷胱甘肽的正常水平发挥重要作用。本研究利用高脂高糖结合小剂量STZ诱导Ⅱ型糖尿病大鼠动物模型并选用NAC作为对照，拟进一步通过氧化应激通路探讨黑灵芝多糖对Ⅱ型糖尿病大鼠肝脏氧化应激损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑灵芝多糖(由HPLC检测，纯度＞99.8%) 本实验制备[8]。

STZ 美国Sigma公司；N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC) 北京索莱宝科技有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒、过氧化氢酶(CAT)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒 南京建成生物工程研究所；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 动物

Wistar大鼠，雄性，体质量180～200g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号：SCXK(沪)2007-0005。

1.3 仪器与设备

DimensionRXLMAX 型全自动生化分析仪 德灵诊断产品有限公司；Thermo Scientific Varioskan Flash全波长多功能酶标仪 美国Thermo Scientific公司。

1.4 方法

1.4.1 Ⅱ型糖尿病大鼠动物模型的建立、分组及给药

根据文献[6,9-10]方法建立Ⅱ型糖尿病大鼠动物模型：48只Wistar大鼠适应性喂养1周后，正常对照组喂普通饲料(按提供的热卡计算，12%脂肪、60%碳水化合物和28%蛋白质)，实验组喂高脂高糖饲料(按提供的热卡计算，40%脂肪、42%碳水化合物和18%蛋白)，8周后禁食12h，实验组大鼠按体质量尾静脉注射30mg/kg STZ生理盐水溶液，正常对照组注射同等剂量生理盐水。1周后禁食过夜(12h)，尾静脉取血，连续2次空腹血糖值≥11.1mmol/L即为Ⅱ型糖尿病大鼠模型。

挑选成模的糖尿病大鼠，随机分为3组(每组8只)：糖尿病对照组、黑灵芝多糖组(100mg/(kg•d))[11]、NAC组(100mg/(kg•d))[12]。其中，正常对照组和糖尿病对照组每天灌胃等量的溶剂，每日灌胃1次，连续灌胃4周。

1.4.2 肝功能指标检测

给药结束后，称取动物体质量并用10g/100mL水合氯醛麻醉，解剖，心脏刺穿采血，分离血清，检测谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)活性。

1.4.3 肝脏指数及肝糖原含量测定

摘取肝脏，10%预冷的生理盐水漂洗，滤纸吸干，称质量，计算肝脏质量指数(肝脏指数)，－70℃保存。

肝糖原含量严格按照肌糖元及肝糖元测定试剂盒说明书进行实验操作。

1.4.4 肝脏抗氧化指标检测

制备10g/100mL组织匀浆，离心取上清液，按照试剂盒操作说明，测定SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量。

1.4.5 RT-PCR测定肝脏组织Bax、Bcl-2 mRNA的表达

Trizol RNA抽提试剂提取肝脏中总RNA，检测
A260nm/A280nm在1.8～2.0，表示提取总RNA纯度良好。以提取的总RNA为模板，按照反转录试剂盒说明反转录出cDNA。PCR扩增引物序列见表1，扩增产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，以GAPDH基因表达量为内参照，比较分析Bax mRNA、Bcl-2 mRNA基因的表达水平[13]。

表 1 引物序列

Table 1 Primer sequences

1.5 统计学分析

组间差异采用统计软件SPSS Statistics 17.0作单因素ANOVA处理，数据以

±s表示，以P＜0.05判断为具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 黑灵芝多糖对Ⅱ型糖尿病大鼠肝脏指数以及肝糖原含量的影响

由表2可知，与正常对照组相比，高脂高糖结合小剂量STZ处理大鼠肝脏指数显著提高，黑灵芝多糖处理后能够显著降低肝脏指数(P＜0.05)，其效果较NAC更优。给药4周后测大鼠肝糖原含量发现，黑灵芝多糖能有效的促进糖原合成，与糖尿病对照组比较，有极显著差异(P＜0.01)。

表 2 黑灵芝多糖对Ⅱ型糖尿病大鼠肝脏指数以及肝糖原含量的影响
(

x

±s, n=8)

Table 2 Effect of polysaccharide from Ganoderma atrum on liver index and liver glycogen content of type Ⅱ diabetic rats (

x

±s, n=8)

注：*.与糖尿病对照组相比，有显著性差异(P＜0.05)；**.与糖尿病对照组相比，有极显著性差异(P＜0.01)。

2.2 黑灵芝多糖对Ⅱ型糖尿病大鼠肝功能指标的影响

*.与糖尿病对照组相比，有显著性差异(P＜0.05)；**.与糖尿病对照组相比，有极显著性差异(P＜0.01)。下同。

图 1 黑灵芝多糖对Ⅱ型糖尿病大鼠肝功能指标的影响

Fig.1 Effect of polysaccharide from Ganoderma atrum on liver function of type Ⅱ diabetic rats

由图1可知，高脂高糖结合小剂量STZ处理大鼠肝脏后，大鼠肝功能指标AST、ALT含量相比正常对照组有明显升高。而经黑灵芝多糖处理后，AST、ALT含量均有显著降低(P＜0.05或P＜0.01)，其效果比NAC组更为明显。

2.3 黑灵芝多糖对Ⅱ型糖尿病大鼠肝脏SOD、GSH-Px、CAT活性及MDA含量的影响

由图2可知，与正常对照组相比，高脂高糖结合小剂量STZ处理后的大鼠肝脏SOD、GSH-Px、CAT活性均有显著降低，MDA含量显著升高。而经黑灵芝多糖处理后，大鼠肝脏SOD、GSH-Px、CAT活性增强(P＜0.05或P＜0.01)，MDA含量显著降低(P＜0.01)。与NAC组相比，具有更好效果。

图 2 黑灵芝多糖对Ⅱ型糖尿病大鼠肝脏抗氧化作用的影响

Fig.2 Effect of polysaccharide from Ganoderma atrum on antioxidant enzyme activities (SOD, GSH-Px, and CAT) and MDA content in the liver of type Ⅱ diabetic rats

2.4 黑灵芝多糖对Ⅱ型糖尿病大鼠肝脏Bax、Bcl-2 mRNA表达的影响

图 3 黑灵芝多糖对Ⅱ型糖尿病大鼠肝脏Bax、Bcl-2 mRNA表达的影响

Fig.3 Effect of polysaccharide from Ganoderma atrum on Bax and
Bcl-2 mRNA expression levels in the liver of type Ⅱ diabetic rats

由图3可知，与正常对照组相比，经高脂高糖结合小剂量STZ处理后的大鼠肝脏Bcl-2表达显著减少，Bax表达显著增加；经黑灵芝多糖处理后，Bcl-2表达增加，Bax表达减少，相对于NAC组具有更好的效果，而mRNA表达在各种处理下均无显著变化。

3 讨 论

肝脏是人体内最大的消化腺，在血糖调节、糖异生作用、糖原的合成、分解与储存等方面起着非常重要的作用[14]。一旦肝脏发生病变，将会对机体的健康产生重大的影响。国内外研究表明糖尿病与肝脏疾病密切相关，糖尿病引起肝组织学和功能改变的病变称为糖尿病性肝损伤[15]。糖尿病引起的肝脏病变主要包括：脂肪肝、肝硬化、非特异性肝脏功能损伤、肝肿大、口服降血糖药物引起的肝脏病变5种[16]。糖尿病患者由于胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗，导致高血糖症状[17]；同时，糖尿病病人对糖的利用率降低，需要消耗大量的脂肪，而产生的游离脂肪进入线粒体后能诱发肝细胞发生氧化应激反应，直接损坏肝细胞，影响人体正常的新陈代谢作用[18]。本实验研究发现，糖尿病大鼠肝脏器官指数、肝功能指标AST、ALT含量均高于正常对照组，表明高脂高糖结合小剂量STZ诱导的Ⅱ型糖尿病大鼠肝脏发生了明显的糖尿病性肝损伤，而黑灵芝多糖对糖尿病大鼠肝损伤具有明显的改善作用。

前期的研究发现，高脂高糖结合小剂量STZ诱导的Ⅱ型糖尿病大鼠动物模型，伴有高血糖高血脂症状[6]。然而，长期高血糖高血脂导致糖尿病大鼠肝脏氧化应激损伤。SOD、CAT、GSH-Px活性以及MDA含量与肝损伤的病理过程均密切相关。SOD是体内重要的抗氧化酶，主要清除超氧化阴离子自由基等，是机体抵抗氧化损伤的保护屏障之一；CAT也是体内重要的自由基清除剂，可分解H2O2产生水；GSH-Px是一种低分子自由基、过氧化氢和脂质过氧化物清除剂；MDA是活性氧自由基对生物膜上不饱和脂肪酸氧化的产物，一般用MDA代表自由基产生的数量[19]。因此，检测组织中SOD、CAT、GSH-Px活性及MDA含量有助于了解组织过氧化损伤的程度[20]。本实验通过高脂高糖结合小剂量STZ诱导Ⅱ型糖尿病大鼠动物模型，分析发现Ⅱ型糖尿病大鼠肝脏组织中SOD、CAT和GSH-Px活力显著下降，MDA含量显著升高，表明糖尿病大鼠肝组织中抗氧化能力下降。当给予黑灵芝多糖处理后，SOD、CAT和GSH-Px活力均有显著上升，且MDA含量明显下降，其效果明显优于NAC处理组，这表明黑灵芝多糖具有抗氧化性保护作用。

肝脏组织抗氧化防御功能下降、脂质过氧化终产物形成增多，细胞色素C释放，容易诱发肝细胞凋亡进一步促进肝损伤的发生[21]。Bcl-2家族是细胞凋亡研究中最受重视的原癌基因之一，其中Bcl-2为凋亡抑制基因，可抑制由多种细胞毒素引起的细胞死亡。Bax是Bcl-2的同源类似物，为促进凋亡发生的基因[22]。本实验发现高脂高糖结合小剂量STZ处理后，大鼠肝脏中Bcl-2表达下调，Bax表达增强，表明长期高血糖会引起糖尿病大鼠肝脏氧化损伤，诱发细胞凋亡。黑灵芝多糖处理后，Bcl-2表达增强，Bax表达减弱，这表明黑灵芝多糖可能是通过调节Bcl-2、Bax表达量，缓解氧化应激诱发的肝脏损伤，发挥抑制细胞凋亡的作用。

综上所述，长期高血糖高血脂导致肝脏组织抗氧化防御功能下降，出现明显的氧化损伤和功能损伤。黑灵芝多糖处理后发现，Ⅱ型糖尿病大鼠肝脏指数显著降低，肝糖原含量显著增加，肝功能指标AST、ALT趋于正常，SOD、CAT、GSH-Px活性显著增加，MDA含量显著降低。此外，黑灵芝多糖能够通过调节Bcl-2、Bax表达量发挥抑制细胞凋亡的作用，表明黑灵芝多糖(100mg/(kg•d))对Ⅱ型糖尿病大鼠肝脏氧化应激损伤具有保护作用。

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