大粒车前子多糖酸水解产物的分析

胡海涛，王远兴*，张 娟，邓 静

（南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047）

摘 要：经水提、醇沉、Sevag除蛋白后得到精制大粒车前子多糖（Plantago asiatica L. polysaccharide，PLP），采用0.3 mol/L三氟乙酸对PLP进行部分酸水解。建立超高效液相色谱-蒸发光散射检测器技术筛选较优水解条件的方法，同时运用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用法分析产物。结果表明：车前子多糖除蛋白后多糖含量为68.56%。在水解温度90 ℃、水解时间1.5h条件下，能够得到比较多的水解产物，经超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用分析鉴定，水解产物中含有单糖、二糖至低聚六糖，并且存在戊糖和己糖相互连接的片段，但并未发现多个己糖相互连接的片段。

关键词：大粒车前子；部分酸水解；超高效液相色谱-蒸发光散射检测器；超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用

Product Analysis of Plantago asiatica L. Polysaccharide by Acid Hydrolysis

HU Hai-tao, WANG Yuan-xing*, ZHANG Juan, DENG Jing

(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Abstract: Polysaccharides were isolated from seeds of Plantago asiatica L. by water extraction and ethanol precipitation, and subjected to protein removal by Sevag method, and then the polysaccharide sample was hydrolyzed with 0.3 mol/L TFA by partial acid hydrolysis for different durations. An ultra performance liquid chromatography coupled with evaporative light scattering detection (UPLC-ELSD) method was established for establishing better hydrolysis conditions, and ultra performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q-TOF-MS) was used for product analysis of samples under the optimal hydrolysis conditions. Results showed that the content of polysaccharides in the deproteinized sample was 68.56%. The optimal hydrolysis conditions were found to be hydrolysis with 0.3 mol/L TFA at 90 ℃ for 1.5 h. The hydrolysate obtained under these conditions contained more degradation products like monosaccharides and oligosaccharides, as identified by UPLC-Q-TOF-MS. Simultaneously, some pentose and hexose interconnected pieces in branch chains were also detected. However, multiple hexose connected pieces were not observed.

Key words: Plantago asiatica L.; partial acid hydrolysis; ultra performance liquid chromatography-evaporative light-scattering detector; ultra performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight-mass spectrometry

中图分类号：TS207.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）06-0060-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201406012

车前子为车前科植物车前（Plantago asiatica L.）或平车前（Plantago depressa Willd.）的干燥成熟种子[1]，被我国卫生部列为保健食品原料，也是我国传统中医用药之一，具有清热利尿、渗湿通淋、明目祛痰的功能[2]，车前子种皮外表细胞壁含有10%～30%黏液质，是一种亲水性胶体，属多糖类物质，是车前子中主要的有效成分，常被称为车前子多糖或车前子胶[3]，据研究车前子多糖是一种部分发酵性膳食纤维，具有整肠通便[4]、降低血脂[5]、抗菌[6]等功能。

本实验室对产自江西吉安的大粒车前子多糖进行了大量研究，例如，运用二次响应面法优化了车前子多糖提取工艺，获得最佳提取工艺条件[7]，建立了一种准确测定车前子多糖的方法[8]，该多糖的主链是由β-1,4-木糖糖基相互连接，支链有β-末端-木糖糖基、α-末端-阿拉伯糖糖基、1,2,5-阿拉伯糖糖基、1,2-鼠李糖糖基等[9-10]，具有缓泻[11]、抗氧化[12]、增强免疫[13-14]等功能。

多糖糖谱技术是将多糖进行水解后，结合色谱分析技术来研究其内部特征，Guan等[15]应用该技术成功的将9种不同的传统中药分离开来，随后又应用到石斛[16]和虫草[17]的研究当中，将8个不同产地的石斛和12个样本的虫草有效的分离开来，同时Xie Jing[18]、Wu Dingtao[19]等采用酶解、部分酸水解的方式有效的辨别出了多产地的灵芝资源，该技术有助于多糖的质量控制，然而车前子多糖在这方面却未见详细的报道。

车前子多糖主要是含有木糖和阿拉伯糖，糖环结构分别为吡喃环和呋喃环形式[20]。一般而言，支链的糖苷键较主链糖苷键易于水解，呋喃糖较吡喃糖易于水解[21]。因此，本研究采用较低浓度的三氟乙酸水解车前子多糖溶液，结合超高效液相色谱-蒸发光散射检测（ultra performance liquid chromatography-evaporative light-scattering detector，UPLC-ELSD）以及超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用（ultra performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight-mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）的方式解析多糖水解产物，旨在获得更多水解产物的结构信息，为今后大粒车前子多糖糖谱的建立提供理论和数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大粒车前子 产地江西吉安；三氟乙酸、无水乙醇、无水甲醇、正丁醇、三氯甲烷（均为分析纯）、乙腈（色谱级） 美国Honeywell公司。

1.2 仪器与设备

6538系列四极杆-飞行时间串联质谱仪、1290 UPLC超高效液相色谱系统（配有蒸发光散射检测器） 美国Agilent公司；ALPHA1-2型冷冻干燥机 德国Martin Christ公司；TU-1900型双光束紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；EYELA N-1100旋转蒸发仪 上海爱朗仪器有限公司；KQ3200E型超声清洗器 昆山市超声仪器有限公司；AL 104型电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；超纯水仪 美国Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 多糖的提取

称取100g车前子，加入12倍量的蒸馏水于100 ℃提取，离心过滤、收集滤液，重复1次，合并滤液后减压浓缩至200 mL，加入乙醇至乙醇含量为80%（V/V），4 ℃静置过夜，离心得沉淀。将沉淀用蒸馏水溶解后，再用Sevag法脱除游离蛋白质，透析（自来水48h，蒸馏水24h），透析液真空浓缩后于4 ℃醇沉过夜，离心分离得到滤渣，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚各洗2次，冷冻干燥得车前子精制多糖（Plantago asiatica L. polysaccharide，PLP）。

1.3.2 多糖含量的测定

以木糖为标准对照物，采用苯酚-硫酸法[22]测定车前子多糖含量。

1.3.3 对照品UPLC-ELSD分析

精密称取葡萄糖、D-阿拉伯糖、蔗糖、麦芽糖、麦芽三糖、蔗果三糖、水苏糖、蔗果四糖、蔗果五糖9种标准品，用超纯水定容至10 mL的容量瓶中，得到混合标准溶液（葡萄糖0.9432 mg/mL、D-阿拉伯糖1.5648 mg/mL、
蔗糖1.1269 mg/mL、麦芽糖0.9756 mg/mL、麦芽三糖1.4296 mg/mL、水苏糖0.5812 mg/mL、蔗果三糖（GF2）1.1365 mg/mL、蔗果四糖（GF3）1.0823 mg/mL、蔗果五糖（GF4）0.8436 mg/mL），并对色谱条件进行选择和优化。

1.3.4 部分酸水解

称取30.0mg PLP，用0.3 mol/L三氟乙酸于90 ℃条件下分别水解1.5、2.5、3.5、4.5h，无水甲醇旋蒸，超纯水复溶，透析过夜，收集袋外液组分PLP-X（X代表不同水解时间），0.22μm滤膜过滤，用于UPLC-ELSD和UPLC-Q-TOF-MS分析。

1.3.5 色谱条件

色谱柱：Prevail Carbohydrate ES氨基色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：水（A）、乙腈（B）；梯度洗脱：0～15min，75% B；15～35min，75%～65% B；35～40min，65%～75% B；流速0.8 mL/min；柱温30 ℃；进样量10μL；ELSD的漂移管温度40 ℃；雾化温度45 ℃；载气氮气；流速1.3L/min。

1.3.6 质谱条件

电喷雾离子源；负离子检测模式；干燥气温度350 ℃；干燥气流速10L/min；雾化气压力40psi；毛细管出口电压120V；质量扫描范围m/z 100～3200。

2 结果与分析

2.1 多糖含量的测定

车前子多糖中木糖的含量较多，因此选用木糖标准品作其标准曲线，测得车前子多糖总糖含量为68.56%。

2.2 标照品的UPLC-ELSD分析及条件优化

1.阿拉伯糖；2.葡萄糖；3.蔗糖；4.麦芽糖；5.麦芽三糖；6.蔗果三糖；7.蔗果四糖；8.水苏糖；9.蔗果五糖。

图 1 9种标准品的UPLC-ELSD色谱图

Fig.1 UPLC-ELSD chromatogram of nine saccharide standards

从图1可以看出，单糖和双糖全部在0～15min分离开，三糖出现在15～20min，四糖出现在20～28min，五糖则在30min左右出现。

雾化气体流量和漂移管温度是影响目标峰响应值的2个重要因素，气体流量决定形成液滴的大小，漂移管温度决定蒸发量的大小[23]，本实验对气体流量和温度进行了优化，发现响应值并无明显的变化和规律，通过调整两者的设定值、观察基线的响应值、飘移值及信噪比变化情况，发现在当漂移管温度40 ℃、雾化温度45 ℃、载气流量1.3L/min条件下，色谱图基线平稳，信噪比较小，满足分析要求。

2.3 水解条件的优化

A. 1.5 h；B. 2.5h；C. 3.5h；D. 4.5h。

图 2 不同酸水解时间时车前子多糖的UPLC-ELSD色谱图

Fig.2 UPLC-ELSD chromatograms of Plantago asiatica L. polysaccharide hydrolyzed for different periods of time

由图2可知，在0～10min之间，每张谱图中都有2个比较明显的色谱峰，对比标准品谱图（图1），该峰出现在单糖区域之内，在戊糖和己糖的出峰位置，可知水解产物中有大量的单糖；随着水解时间的延长，多糖水解出的低聚糖逐渐减少；水解到2.5h时，峰2、3、5、6、8消失；水解到3.5h时，峰4、7消失；当水解到4.5h时，水解产物几乎全部为单糖，可以得出随着水解时间的延长，水解产物中的低聚糖逐渐裂解成单糖；当多糖水解至1.5h时，能够水解出一系列的低聚糖，比较明显产物如峰1、4、7，可能为二聚糖、四聚糖和五聚糖，峰2、3、5、6、8由于水解出的量较少，在色谱图上并不是十分明显。为了更加深入了解水解产物信息，将PLP-1.5进行UPLC-Q-TOF-MS分析。

2.4 UPLC-Q-TOF-MS产物分析

采用上述质谱条件对PLP-1.5进行测定，所得总离子流图如图3所示，部分组分的质谱图见图4，各物质对应的峰号、保留时间、主要碎片信息和水解产物见表1。

图 3 PLP-1.5的总离子流图

Fig.3 Total ion chromatograms of PLP-1.5

表 1 各水解产物的保留时间和主要离子碎片

Table 1 Retention times and major ion fragments of hydrolysis products in a negative ion mode

如图3和表1所示，车前子多糖水解后产生一系列的单糖和低聚糖，水解产物中戊糖和己糖所产生的离子碎片与文献报道一致[24]，戊二糖等其他低聚糖离子碎片为[M－H]－、[M＋Cl]－、[M＋COOH]－所结合的特征离子。单糖产物中戊糖比例很高，符合有关文献[25]的报道；同时阿拉伯糖比木糖更易水解，推测戊糖中可能含有阿拉伯糖和木糖；低聚糖多以戊糖与戊糖相连接，这与此前推测的一级结构相符合[9-10]，可能是由阿拉伯糖糖基与木糖糖基相互连接在一起；m/z 311.1007[M－H]－、347[M＋Cl]－、357.1067[M＋COOH]­－表明1个戊糖和1个己糖相互连接并脱去1个H2O所形成的低聚二糖，表明多糖的内部结构存在着这样的重复片段，同时并未检测出己糖相互连接所形成的碎片，推测在多糖支链上并不存在几个己糖相互连接的片段。

A. 8.65min；B. 12.04min；C. 13.23min；D. 27.31min。

图 4 不同保留时间色谱组分的质谱图

Fig.4 Mass spectra of different chromatographic fractions with various retention time

3 结 论

本研究建立了UPLC-ELSD法快速、准确分离9种单糖及低聚糖标品的方法，适用于多种单糖和低聚糖的检测。运用所建立的UPLC-ELSD方法对多糖水解条件进行了筛选，采用0.3 mol/L三氟乙酸、水解温度90 ℃、水解时间1.5h条件，能够得到较多的产物，为大粒车前子多糖糖谱的建立提供了方法支持。

采用超UPLC-Q-TOF-MS技术分析水解产物，确定水解产物中有己糖、戊糖、戊二糖至低聚戊六糖，同时存在戊糖与己糖相互连接的片段，但并没有发现己糖相互连接大分子片段。由于多糖结构的复杂性，仍需对产物做更进一步的研究。

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