羧甲基化大粒车前子多糖的制备及其生物活性研究

江乐明，樊灿梅，聂少平，周华璐，李建宇，谢明勇*

(南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047)

摘 要：研究以氢氧化钠和一氯乙酸对大粒车前子多糖进行羧甲基化修饰的条件，同时采用体外树突状细胞模型评价了羧甲基化大粒车前子多糖的生物活性。在单因素试验基础上，通过正交试验进一步确定了最适修饰反应条件为NaOH溶液浓度4.5mol/L、一氯乙酸剂量2.835g、反应温度50℃。体外细胞实验研究表明：当羧甲基取代度在0.5～0.6范围内时，羧甲基化修饰能够显著增强大粒车前子多糖促进树突状细胞分泌细胞因子IL-12p70的功效。对大粒车前子多糖进行羧甲基修饰可提高其生物活性，为大粒车前子多糖羧甲基化衍生物的开发应用提供了理论依据。

关键词：大粒车前子；多糖；羧甲基化修饰；树突状细胞；生物活性

Preparation and Immunoregulatory Activity of Carboxymethyl Polysaccharide from the Seeds of Plantago asiatica L.

JIANG Le-ming，FAN Can-mei，NIE Shao-ping，ZHOU Hua-lu，LI Jian-yu，XIE Ming-yong*

(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Abstract：Polysaccharide derived from the seeds of Plantago asiatica L. (PLP) was carboxymethylated in aqueous alkaline medium of sodium hydroxide (NaOH) using monochloroacetic acid (MCA) as etherifying agent. The effects of reaction parameters such as NaOH concentration, the amount of added MCA, temperature and reaction time were investigated using single-factor and orthogonal array design. Temperature effect on the reaction was not significant. Caboxymethylated PLP (CM-PLP) with the highest degree of substitution (DS) was obtained in 4.5 mol/L aqueous NaOH with the addition of 2.835 g of MCA at 50 ℃. Meanwhile, CM-PLPs with high DS showed a significantly enhanced effect on IL-12p70 secretion by dendritic cells (DCs). This study indicates a new approach to exploit the resource of PLP.

Key words：Plantago asiatica L.；polysaccharide；carboxymethylation；dendritic cell；biological activity

中图分类号：TS201.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)22-0010-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201322003

车前属(Plantago)植物是一年或多年生草本，广泛分布于全世界，多被用作传统药材资源[1]。车前子是车前属Plantago asiatica L.或Plantago depressa Willd.的干燥成熟种子。我国药典记载车前子有“清热利尿通淋，渗湿止泻，明目，祛痰”的功效。车前子种皮外表细胞壁含有大量多糖类物质，是车前子中主要的有效成分[2]。车前子多糖具有润肠通便[3]、抗脂质过氧化[4]、抗补体[5]等多种功效。

通过化学、物理及生物学等方法对多糖的结构进行修饰改造可获得具有多样生物活性的多糖衍生物，这为多糖资源的开发提供了新的视角[6]。羧甲基化修饰是一种重要的化学修饰方法，其应用集中于淀粉[7]、纤维素[8]、壳聚糖[9]的衍生物，所涉领域包含了食品、合成洗涤剂、建筑等行业。近年来，将羧甲基化修饰用于改善多糖生物活性的研究也备受关注。周瑞等[10]对鸡腿菇多糖进行羧甲基化修饰后发现，其清除羟自由基和超氧阴离子自由基的能力显著提高；张秀军等[11]研究表明羧甲基茯苓多糖能促进小鼠脾淋巴细胞增殖、增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能。而对车前子多糖进行羧甲基化修饰并探究其活性变化的相关研究未见报道。

本实验研究氢氧化钠和一氯乙酸对大粒车前子多糖(polysaccharide from the seeds of Plantago asiatica L.，PLP)进行羧甲基化修饰的反应条件，同时考察羧甲基化大粒车前子多糖(caboxymethylated PLP，CM-PLP)对树突状细胞(dendritic cells，DCs)分泌细胞因子IL-12p70的影响，旨在为大粒车前子多糖羧甲基化衍生物的应用提供理论依据。羧甲基化反应机理如图1所示[12]。

图 1 多糖羧甲基化修饰反应机理

Fig.1 Reaction mechanism for polysaccharide carboxymethylation

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大粒车前子产自江西吉安。经水提醇沉法提取大粒车前子粗多糖，再采用Sevag试剂脱除其中蛋白质后，冷冻干燥制得大粒车前子多糖[13]；Balb/c小鼠(雌雄随机) 南昌大学动物饲养中心。

一氯乙酸(MCA)、NaOH、浓盐酸、冰醋酸、甲醇等试剂均为分析纯；RPMI 1640基础培养基 北京索莱宝生物科技公司；胎牛血清 美国Hyclone公司；重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)、重组小鼠白细胞介素(rmIL-4) 美国R&D system公司；小鼠IL-12p70 EILSA检测试剂盒 武汉博士德公司。

1.2 仪器与设备

RE-52AA旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；FD-101S集热式磁力加热搅拌器 江苏晓阳电子仪器厂；TDL-5-A飞鸽牌离心机 上海安亭科学仪器厂；ALPHA 1-2LD冷冻干燥机 德国Christ公司；Varioskan Flash全波长多功能酶标仪 美国Thermo公司；NICOLET-5700傅里叶红外光谱仪 美国尼高力仪器公司。

1.3 方法

1.3.1 大粒车前子多糖羧甲基化修饰

称取100mg PLP溶解于NaOH溶液中，室温条件下搅拌碱化30min。然后加入MCA，水浴加热反应2h。反应完毕，冷却至室温后加入冰醋酸中和pH值至7.0。收集样品溶液，蒸馏水透析72h，旋转蒸发浓缩至20mL左右后，冷冻干燥得CM-PLP。

1.3.2 羧甲基取代度(degree of substitution，DS)测定

将CM-PLP浸泡在0.2mol/L HCl溶液(80%甲醇溶液配制)中，质量浓度为5mg/mL。搅拌4h，期间每小时更换新鲜HCl溶液。将酸洗后的多糖用80%甲醇溶液洗涤3～4次，至无Cl−。冷冻干燥，即得酸洗羧甲基化大粒车前子多糖[14]。

将酸洗羧甲基化大粒车前子多糖样品约20mg加入10mL容量瓶，加入0.01mol/L NaOH标准溶液9mL，40℃水浴至溶液透明后，冷却至室温，用0.01mol/L NaOH标准溶液定容至刻度线。用0.01mol/L HCl标准溶液反滴定过剩NaOH溶液，至酚酞指示剂的红色刚刚退去。取代度测定前，参照GB/T 601—2002《化学试剂：标准滴定溶液的制备》方法，标定NaOH标准溶液、HCl标准溶液浓度分别为0.009710、0.009172mol/L。DS按下式计算[15]：

A = 1000×(V0×C0－V1×C1)/mCM-PLP

DS = 0.132A/(1－0.058A)

式中：A为每克样品消耗NaOH物质的量/mmol；V0为加入NaOH溶液的体积/mL；C0为NaOH溶液浓度/(mol/L)；V1为消耗HCl溶液的体积/mL；C1为HCl溶液浓度/(mol/L)；mCM-PLP为羧甲基化大粒车前子多糖的质量/mg。

1.3.3 树突状细胞体外诱导培养

颈椎脱臼处死Balb/c小鼠，于无菌超净工作台中取出股骨、胫骨。剪开两端骨骺，用RPMI-1640基础培养基冲出并收集骨髓细胞。采用含有rmGM-CSF(20ng/mL)、rmIL-4(10ng/mL)、胎牛血清(10%，V/V)的完全培养基培养骨髓细胞，隔天半量换液。培养至第5天，收集悬浮细胞及半贴壁细胞，即为未成熟树突状细胞。

1.3.4 酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)法检测树突状细胞分泌IL-12p70量

将未成熟树突状细胞以1.5×106个/mL密度接种至6孔板中，2mL/孔。分别加入取代度为0.40(CM-PLP Ⅰ)、0.44(CM-PLP Ⅱ)、0.50(CM-PLP Ⅲ)、0.55(CM-PLP Ⅳ)、0.62(CM-PLP Ⅳ)的羧甲基化大粒车前子多糖(100μg/mL)，继续刺激培养48h。离心收集各组细胞培养上清液，采用ELISA试剂盒检测其中IL-12p70的含量。实验同时设置RPMI1640完全培养基空白对照组，和LPS(1μg/mL)阳性对照组。

2 结果与分析

2.1 大粒车前子多糖羧甲基化分子修饰单因素试验

2.1.1 NaOH溶液浓度对大粒车前子多糖羧甲基化修饰的影响

图 2 NaOH溶液浓度对大粒车前子多糖羧甲基化修饰的影响

Fig.2 Effect of NaOH concentration on PLP carboxymethylation

将100mg PLP分别溶解于20mL浓度分别为1、3、5、7、9mol/L的NaOH溶液中，加入1.89g MCA，50℃水浴反应2h。如图2所示，当NaOH浓度在1～5mol/L范围内，随着其浓度升高羧甲基取代度不断增大，并在5mol/L取得最大取代度(0.37±0.008)。

2.1.2 MCA剂量对大粒车前子多糖羧甲基化修饰的影响

图 3 MCA剂量对大粒车前子多糖羧甲基化修饰的影响

Fig.3 Effect of the amount of added MCA on PLP carboxymethylation

将100mg PLP溶解于20mL浓度为5mol/L的NaOH溶液中，分别加入0.95、1.42、1.89、2.37、2.84g MCA，50℃水浴反应2h。如图3所示，MCA质量为0.95g和1.42g时，其羧甲基取代度分别为(0.24±0.009)、(0.26±0.010)；当MCA质量为1.89g时，取代度显著增大至(0.43±0.012)；当MCA质量为2.37g时，取代度达到最大，为(0.46±0.013)。

2.1.3 反应温度对大粒车前子多糖羧甲基化修饰的影响

图 4 反应温度对大粒车前子多糖羧甲基化修饰的影响

Fig.4 Effect of reaction temperature on PLP carboxymethylation

将100mg PLP溶解于20mL浓度为5mol/L的NaOH溶液中，加入1.89g MCA，分别于20、30、40、50、60℃水浴反应2h。如图4所示，反应温度在20～50℃范围内，取代度随着温度的升高而不断增大，而当温度高于50℃时，取代度开始下降。

2.1.4 反应时间对大粒车前子多糖羧甲基化修饰的影响

将100mg PLP溶解于20mL浓度为5mol/L的NaOH溶液中，加入1.89g MCA，于50℃水浴分别反应1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h。如图5所示，反应时间在1.0～3.0h范围内，取代度未发生显著性变化，说明车前子多糖羧甲基化修饰反应迅速，至1h时已经基本反应完毕。

图 5 反应时间对大粒车前子多糖羧甲基化修饰的影响

Fig.5 Effect of reaction time on PLP carboxymethylation

2.2 羧甲基化大粒车前子多糖红外光谱分析

图 6 羧甲基化大粒车前子多糖红外光谱图

Fig.6 Infrared spectroscopic analysis of CM-PLPs

分别将PLP、CM-PLP和溴化钾研磨压片后，红外光谱仪进行测定。如图6所示，在3400cm-1波数附近的宽吸收峰是O—H的伸缩振动；3000～2800cm-1波数处的吸收峰是糖类C—H的伸缩振动；1735cm-1波数附近的吸收峰是羧基C=O伸缩振动；890cm-1波数附近的吸收峰是吡喃糖β型C—H弯曲振动的特征吸收峰。与PLP相比较，CM-PLP在1735cm-1波数附近的吸收峰增强，这说明大粒车前子多糖羧甲基化修饰成功。

2.3 大粒车前子多糖羧甲基化修饰正交试验

表 1 大粒车前子多糖羧甲基化修饰正交试验设计及结果

Table 1 Orthogonal array design and results for the optimization of PLP carboxymethylation

为进一步探究大粒车前子多糖最佳羧甲基化修饰条件，根据单因素试验的结果，设计三因素三水平正交试验，正交试验设计及结果如表1所示。结果表明，对大粒车前子多糖羧甲基化修饰反应影响最大的因素是MCA剂量，其次是NaOH溶液浓度、再次为反应温度。最佳修饰条件为NaOH溶液浓度4.5mol/L、MCA剂量2.835g、反应温度50℃。采用该条件进行验证实验，制得取代度为0.62±0.013的羧甲基化车前子多糖，与正交试验结果相一致。

2.4 羧甲基化大粒车前子多糖对树突状细胞分泌IL-12p70的影响

**.与PLP组相比，差异显著，P＜0.01。

图 7 羧甲基化大粒车前子多糖对树突状细胞分泌IL-12p70的影响

Fig.7 Effect of CM-PLPs on IL-12p70 secretion by DCs

如图7所示，CM-PLPⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组IL-12p70的分泌量分别为(54.93±2.39)、(58.54±4.19)、(70.145±4.62)、(65.028±6.62)、(72.376±6.89)pg/mL。与空白组(17.26pg/mL±
3.45pg/mL)相比，各组药物刺激均能显著刺激DCs分泌IL-12p70。与PLP组(50.882pg/mL±5.05pg/mL)
相比，CM-PLP Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组对DCs的IL-12p70分泌量影响显著增加。

3 讨论与结论

多糖结构的多样性是其丰富生物活性的基础。合适的分子修饰可以改善多糖的生物活性，是多糖构效关系研究和多糖类药物研制的重要手段[16]。多糖的化学修饰方法有很多[17]，例如硫酸酯化、烷基化、乙酰化等，而羧甲基化具有制备过程简单、试剂成本低及生成物无毒性等优点，已成为一种较常用的修饰方法。

通过羧甲基化修饰可增加多糖的水溶性而提高其生物活性，王雁等[18]研究表明，虎奶多糖进行羧甲基化修饰后，其水溶性由不溶解增大到30g/L，并表现出显著的抑制线粒体氧化损伤的功能；通过羧甲基化修饰改变多糖活性作用位点也是可能的机制之一，焦中高等[19]研究表明，红枣多糖经羧甲基化修饰后，其对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用显著增强，而对α-淀粉酶的抑制作用显著降低。同时需要注意，羧甲基化修饰对多糖活性的改善也可能有负面影响，张华等[20]将黑木耳多糖进行羧甲基化修饰后，发现其抑制HepG2肝癌细胞的能力降低。这些研究显示，对多糖进行羧甲基化修饰具有广阔的应用前景，但修饰多糖的作用机制和临床应用有待更深入的研究。

大粒车前子多糖的羧甲基化修饰反应主要包括2个阶段：首先，多糖与NaOH溶液作用形成醇盐，此阶段增大NaOH溶液浓度，可以使多糖生成更多醇盐而促进修饰反应；然后，醇盐与醚化试剂MCA发生亲核取代反应，因而增加MCA剂量的也利于提高修饰取代度。单因素试验表明，MCA剂量低于1.42g时取代度增幅不大，而大于2.37g时取代度却又迅速下降，这是因为NaOH会消耗部分MCA，而若过多加入MCA又会使反应体系pH值下降而影响反应的进行。反应温度也是羧甲基化修饰反应的重要条件之一，不同来源的多糖因其结构特性差异而反应温度范围选择不同[21]。升高温度能增强分子运动促进亲核取代的反应，但也加剧了MCA水解副反应，可能降低醚化试剂利用率。本实验通过单因素试验和正交试验确定大粒车前子多糖羧甲基化修饰最佳反应条件为：NaOH溶液浓度 4.5mol/L、MCA 剂量2.835g、反应温度50℃。

本实验进一步检测了CM-PLP刺激DCs分泌细胞因子的能力。DCs是专职抗原递呈细胞，是机体免疫应答启动的枢纽[22]。成熟的DCs表面表达着大量MHC分子、共刺激分子，这些表面分子与T细胞受体(TCR)相互作用启动免疫应答[23]。而幼稚T细胞的分化却由树突状细胞分泌的细胞因子主导，其中IL-12和IFN-γ能够诱导Th1型极化，而TGF-β、IL-6、IL-1、IL-21和IL-23促进IL-17细胞的产生[24]。现有研究表明，诱导DCs成熟是PLP发挥免疫调节作用的可能机制之一[25]。本研究发现，在取代度为0.5～0.6范围内，CM-PLP具有更强的刺激树突状细胞分泌IL-12p70的能力，说明羧甲基化修饰能够显著增强PLP诱导DCs成熟的能力。

综上所述，对大粒车前子多糖进行羧甲基化修饰可提高其免疫调节生物活性，是大粒车前子多糖功能性产品开发的可行途径。

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