葡萄籽原花青素对顺铂诱导人胚肾细胞
凋亡的拮抗作用

郭卓雨，高丽萍*，李 贞

（北京联合大学应用文理学院，生物活性物质与功能食品北京市重点实验室，北京 100191）

摘 要：目的：探讨葡萄籽原花青素（grape seed proanthocyanidin，GSPE）对顺铂（cis-diamminedichloroplatinum，CDDP）诱导人胚肾细胞HEK293凋亡及相关凋亡基因的影响，并探讨可能的机制。方法：体外培养正常HEK293细胞，噻唑蓝法测定GSPE、CDDP分别对HEK293细胞生长的影响以及GSPE对CDDP诱导HEK293细胞毒性的保护作用，流式细胞仪测定GSPE对CDDP所致HEK293细胞凋亡率的变化，Western blotting测定GSPE对CDDP所致HEK293细胞凋亡相关基因Bax、Bcl-2蛋白表达的影响。结果：GSPE对CDDP所致HEK293细胞毒性具有拮抗作用，可减轻CDDP所致HEK293细胞凋亡，减弱Bax表达、增强Bcl-2表达。结论：GSPE对CDDP所致HEK293细胞凋亡具有拮抗作用，其机制可能与GSPE降低促凋亡基因Bax，升高抗凋亡基因Bcl-2的表达有关。

关键词：葡萄籽原花青素；顺铂；人胚肾细胞HEK293；细胞凋亡

Protective Effect of Grape Seed Proanthocyanidin Extract against Cisplatin-Induced Apoptosis in

Human Embryonic Kidney Cells

GUO Zhuo-yu, GAO Li-ping*, LI Zhen

(Beijing Municipal Key Laboratory of Biological Active Substance and Functional Food, College of Applied Arts and Technology, Beijing Union University, Beijing 100191, China)

Abstract: Purpose: To explore the protective effect of grape seed proanthocyanidin extract (GSPE) against cisplatin (CDDP)-induced apoptosis in human embryo kidney (HEK) 293 cells and its possible mechanisms. Methods: The effects of CDDP and GSPE on the in vitro growth of HEK 293 cells and the effect of GSPE on CDDP-induced toxicity was evaluated by MTT assay. CDDP-induced apoptosis in HEK293 cells was analyzed by flow cytometry. Western blotting was applied to determine the expression of apoptotic gene Bax and anti-apoptosis gene Bcl-2. Results: GSPE was able to antagonize cisplatin-induced cytotoxicity in a concentration-dependent manner. Flow cytometry revealed that GSPE could lead to a decrease in apoptosis rate and pro-apoptotic Bax gene expression while anti-apoptotic gene Bcl-2 expression was enhanced.Conclusion: GSPE demonstrates a preventive effect on cisplatin-induced injury in HEK293 cells. The mechanism may be related to its capacity of enhancing anti-apoptotic gene Bcl-2 expression and inhibiting pro-apoptotic gene Bax expression.

Key words: grape seed proanthocyanidin extract; cisplatin; human embryo kidney (HEK) 293 cells; apoptosis

中图分类号：Q946.8 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2014)01-0234-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201401046

顺铂（cis-diamminedichloroplatinum，CDDP）是抵御各种肿瘤的重要化疗药物之一，但因高剂量使用对肾脏产生较大毒性使其临床使用受到限制。临床应用CDDP治疗肿瘤的患者常出现急性肾功能衰竭症状[1]，主要表现为肾小管上皮细胞生化和细胞功能紊乱，其中包括抑制蛋白合成、氧化应激、线粒体失功、细胞骨架重构、细胞间黏附的变化及小管上皮细胞凋亡等。目前，CDDP所致肾毒性其细胞和分子机制尚未完全清楚[2]。文献[3]记载，CDDP诱导的肾小管细胞凋亡在肾毒性中发挥重要作用。

葡萄籽原花青素（grape seed proanthocyanidin，GSPE）是具有生物类黄酮活性的一大类多酚化合物，是国际公认的最能有效清除体内自由基的天然多酚类物质[4]，由不同数量的黄烷-3-醇单元（即由（表）儿茶素、表棓儿茶素或表儿茶素没食子酸酯）缩合而成。研究表明，GSPE可诱导癌细胞凋亡[5-10]、促进正常细胞生长[11]、改善抗氧化指标[12]等。前期研究显示GSPE可显著抑制CDDP诱导人胚肾细胞氧化损伤作用，而对HEK293细胞凋亡的研究尚未见报道，因此本研究运用CDDP造模，通过测定GSPE对CDDP所致HEK293细胞凋亡及凋亡相关基因Bax、Bcl-2表达量的影响，探究GSPE对CDDP所致HEK293细胞凋亡的影响及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

HEK293细胞由北京师范大学提供。

CDDP（注射用粉剂，批号H37021358，生理盐水配制，过滤除菌避光保存，用时用MEM培养基稀释至所需浓度） 齐鲁制药厂；葡萄籽原花青素提取物（纯度大于95%，HPLC级，其中二聚体56%、三聚体12%、四聚体6.6%、单体和其他大分子质量寡聚体20.4%。蒸馏水溶解，过滤除菌避光保存，用时用MEM培养基稀释至所需浓度） 天津尖峰天然产物研究开发有限公司；新生牛血清、MEM培养基 美国Gibco公司；胰蛋白酶、噻唑蓝 美国Sigma公司；兔抗β-actin、Bcl-2、Bax多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记二抗 Santa Cruz-中杉金桥生物技术公司；BCA蛋白测定试剂盒 南京建成生物工程研究所；细胞凋亡检测试剂盒 北京宝赛生物制品研究所；其他试剂均为分析纯。

酶标仪 美国Bio-Tek公司；FACS Calibar流式细胞仪 美国BD公司；电泳仪 美国Bio-Rad公司。

1.2 细胞培养

HEK293细胞，培养基为含双抗（100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素）及含10%新生牛血清的MEM培养基，于37℃、含5% CO2的培养箱中培养。待细胞生长至70%～80%时传代，隔1d换1次培养基，每2～3d传代1次并接种于新培养瓶。实验取指数生长期细胞进行。

1.3 细胞毒性实验

采用噻唑蓝比色法测定CDDP诱导HEK293细胞的毒性作用、GSPE对正常HEK293细胞生长的影响以及GSPE对CDDP所致HEK293细胞毒性作用的影响。

1.3.1 CDDP对HEK293细胞毒性模型的建立

将200μL（1×105个/mL）HEK293细胞接种至96孔板，待细胞生长至融合状态时，加入不同终质量浓度CDDP溶液（0、0.0047、0.0094、0.0188、0.0375、0.075、0.15、0.3、0.6、1.2mg/mL），于37℃、含5% CO2培养箱中培养24h。每组6个复孔。向上述96孔培养板中加入终质量浓度为0.5mg/mL噻唑蓝，于37℃、5% CO2孵育培养箱中培养4h，弃废液并加入二甲基亚砜（150μL/孔），混匀10min，酶标仪检测（测定波长570nm，参比波长630nm）吸光度。以不加CDDP组为空白对照，计算细胞存活率。

细胞存活率/%=

A1

A0

×100

式中：A1为实验组上清液的吸光度；A0为空白对照组上清液的吸光度。

1.3.2 GSPE对HEK293细胞生长的影响

将200μL（1×105个/mL）HEK293细胞接种至96孔板，待细胞生长至融合状态时，加入不同终质量浓度GSPE（0、0.001、0.002、0.004、0.008、0.016、0.032、0.064、0.128、0.256、0.512、1.024、2.048、4.096、8.192、16.384mg/mL），于37℃、含5% CO2的孵育培养箱中培养24h，噻唑蓝比色法测定其吸光度（测定波长570nm，参比波长630nm），计算GSPE对HEK293细胞生长存活率影响。每组6个复孔。

1.3.3 GSPE对CDDP所致HEK293细胞毒性的保护作用

将200μL（1×105个/mL）HEK293细胞接种至96孔板，待细胞生长至融合状态时，将细胞分组为：空白对照组（仅用含10%新生牛血清的MEM进行培养）；CDDP模型组（终质量浓度0.015mg/mL）；CDDP+GSPE组：加0.015mg/mL CDDP前30min加入不同终质量浓度的GSPE（终质量浓度分别为0.008、0.016、0.032、0.064、0.128、0.256、0.512、1.024mg/mL）。于37℃、含5% CO2孵育培养箱中培养24h，噻唑蓝比色法测定其吸光度，计算GSPE对CDDP所致HEK293细胞存活率变化。每组6个复孔。

1.4 GSPE对CDDP所致HEK293细胞凋亡的测定

按1.2节所述方法对细胞进行培养，至细胞生长至融合状态后，将所培养细胞分为：空白对照组（仅用含10%新生牛血清的MEM进行培养）；CDDP模型组（CDDP终质量浓度0.015mg/mL）；0.015mg/mL CDDP＋0.512mg/mL GSPE组；0.015mg/mL CDDP＋1.024mg/mL GSPE组，GSPE处理组在加入CDDP前30min加入，药物组加药时其他相应组加入同体积生理盐水或双蒸水。将各组细胞于37℃、含5% CO2孵育培养箱中培养24h进行细胞凋亡实验。

1.4.1 Annexin V/PI双染色流式细胞仪检测GSPE对CDDP诱导HEK293细胞凋亡率

进行HEK293细胞药物处理并培养24h后，将各组细胞用0.25%胰蛋白酶消化液制成单细胞悬液，细胞计数后取5×105～1×106个细胞，于4℃磷酸盐缓冲溶液中冲洗。将细胞悬置于200μL结合缓冲液中，加入10μL Annexin V-FITC结合液重悬细胞并轻轻混匀，室温避光孵育15min后，再加入300μL结合缓冲液（总反应体积为500μL）和5μL碘化丙啶染色液（加入碘化丙啶前先将细胞悬液用200目筛网过滤），冰浴避光放置，进行流式细胞仪检测。每份样品检测1×104个细胞，实验重复3次，CellQuest软件分析细胞凋亡率，结果用平均凋亡率表示，并用SPSS 12.0统计学软件进行差异显著性分析。

1.4.2 Western blotting检测GSPE对CDDP诱导HEK293细胞中凋亡蛋白的表达

收集各实验组细胞蛋白（蛋白含量采用BCA测蛋白法测定），进行电泳、转膜、封闭、杂交和显影，分析HEK293细胞中相关蛋白表达。具体操作如下：收集蛋白样品，5×十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate，SDS）上样缓冲液混匀，100℃煮沸10min；各组取30μg样品蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和转膜。120V电泳90min（待溴酚蓝显现即可终止），100mA电转1h后取出膜，Tris-HCl缓冲溶液＋
吐温溶液（TBST）清洗，膜用含5%脱脂乳粉的封闭液10mL封闭1h，TBST洗3次，再与一抗Bcl-2（1∶1000）、Bax（1∶1000）、β-actin（1∶500），4℃孵育过夜。TBST洗膜3次，加入二抗（1∶10000），孵育、洗膜。ECL化学发光法反应后暗室中压片显影，以β-actin为内参，凝胶图像分析软件扫描，测定蛋白条带灰度值。HEK293细胞中蛋白表达强度用蛋白条带灰度与内参β-actin蛋白条带灰度比值表示[13]。

1.5 统计分析

实验所得数据采用SPSS 12.0软件进行统计分析，分别测定CDDP、GSPE对HEK293细胞的半数抑制质量浓度（IC50值，并应用单因素方差分析判定GSPE对CDDP诱导HEK293细胞凋亡以及凋亡相关基因的影响，显著性差异以P＜0.05或P＜0.01表示。

2 结果与分析

2.1 CDDP所致HEK293细胞毒性作用

b.与空白对照组相比，有极显著性差异（P＜0.01）。图2同。

图 1 CDDP所致HEK293细胞毒性作用

Fig.1 Toxic effect of cisplatin on HEK293 cells

如图1所示，随CDDP终质量浓度升高，HEK293细胞存活率不断降低，表明CDDP对HEK293细胞的抑制程度不断增大，且呈现出明显的剂量依赖关系，加入CDDP后培养24h后测得其对HEK293细胞的IC50值为（0.015±0.0003）mg/mL。

2.2 GSPE对HEK293细胞正常生长的影响

b.与空白对照组相比，有极显著性差异（P＜0.01）。

图 2 GSPE对HEK293细胞生长的影响

Fig.2 Effect of GSPE on the growth of HEK293 cells

如图2所示，随GSPE终质量浓度的升高，HEK293细胞存活率逐渐增高，在GSPE终质量浓度为0.064mg/mL时，HEK293细胞存活率达到最高，此后随GSPE质量浓度增加，HEK293细胞存活率逐渐降低。加入GSPE后培养24h后测得其对HEK293细胞的IC50值为（1.9165±0.04）mg/mL。

2.3 GSPE对CDDP所致HEK293细胞毒性的保护作用

a.与空白对照组相比，有极显著性差异（P＜0.01）；b.与CDDP模型组相比，有极显著性差异（P＜0.01）。下同。

图 3 GSPE对CDDP所致HEK293细胞毒性的保护作用

Fig.3 Protective effect of GSPE on cisplatin-induced cytotoxicity on HEK293 cells

如图3所示，用终质量浓度为0.015mg/mL的CDDP孵育HEK293细胞24h建立毒性模型，不同终质量浓度GSPE拮抗细胞毒性，结果显示CDDP建立的HEK293细胞毒性模型其存活率随GSPE质量浓度升高而增高。其中GSPE质量浓度为0.512mg/mL时，其细胞存活率达最大值，而1.024mg/mL的GSPE其抑制作用略好于0.256mg/mL GSPE的抑制作用，表明一定质量浓度GSPE对CDDP所致HEK293细胞毒性具有保护作用。后续实验均选用添加0.512、1.024mg/mL的GSPE研究其保护作用。

2.4 GSPE对CDDP所致HEK293细胞凋亡的影响

2.4.1 流式细胞仪Annexin V/PI双染色法检测GSPE对CDDP所致HEK293细胞凋亡率的定量分析结果

图4为各实验组其Annexin V/PI双变量流式细胞仪散点图，表1为细胞凋亡率。结果显示，CDDP可造成HEK293细胞凋亡率升高（包括早期凋亡和中晚期凋亡），与空白对照组相比具有极显著性差异（P＜0.01）；而GSPE则可使CDDP所致HEK293细胞凋亡率升高的程度显著降低，其中终质量浓度为
0.512mg/mL的GSPE比1.024mg/mL的GSPE的抑制凋亡作用（包括早期凋亡和中晚期凋亡）更佳，表明终质量浓度为0.512mg/mL的GSPE对CDDP所致HEK293细胞凋亡具有更好的拮抗作用，提示GSPE可能参与调控CDDP诱导的HEK293细胞的凋亡。

a.空白对照组；b. CDDP模型组；c. 0.015mg/mL CDDP＋0.512mg/mL
GSPE组；d. 0.015mg/mL CDDP＋1.024mg/mL GSPE组。

图 4 GSPE对CDDP所致HEK293细胞凋亡率的影响

Fig.4 Effect of GSPE on CDDP-induced apoptosis rate of HEK293 cells

表 1 GSPE对CDDP所致HEK293细胞凋亡率的影响

Table 1 Effect of GSPE on cisplatin-induced apoptosis rate of HEK293 cells

注：*.与空白对照组比较，具有显著性差异（P＜0.05）；**.与空白对照组比较，具有极显著性差异（P＜0.01）；△.与CDDP模型组比较，具有显著性差异（P＜0.05）； △△.与CDDP模型组比较，具有极显著性差异（P＜0.01）。下同。

2.4.2 Western blotting检测GSPE对CDDP所致HEK293细胞凋亡蛋白的表达

图 5 GSPE对CDDP所致HEK293细胞Bax蛋白表达量影响

Fig.5 Effect of GSPE on cisplatin-induced Bax protein expression in HEK293 cells

图 6 GSPE对CDDP所致HEK293细胞Bcl-2蛋白表达量影响

Fig.6 Effect of GSPE on cisplatin-induced Bcl-2 protein expression in HEK293 cells

表 2 GSPE对CDDP诱导HEK293细胞凋亡基因表达灰度值的影响

Table 2 Effect of GSPE on CDDP-induced apoptosis gene expression in HEK293 cells

%

如图5、6和表2所示，CDDP模型组Bax、Bcl-2蛋白表达量较空白对照组具有显著性差异（P＜0.01）；0.015mg/mL CDDP＋0.512mg/mL GSPE组促凋亡基因Bax蛋白表达量较CDDP模型组明显降低，抑凋亡基因Bcl-2明显升高（P＜0.01），0.015mg/mL CDDP＋1.024mg/mL GSPE组促凋亡基因Bax蛋白表达量亦有降低，但其降低程度不及0.015mg/mL CDDP＋0.512mg/mL GSPE组，Bcl-2蛋白表达量升高幅度也低于0.015mg/mL CDDP＋0.512mg/mL GSPE组。实验结果表明，GSPE可通过阻抑CDDP所致HEK293细胞促凋亡基因Bax蛋白表达量的增加、抑凋亡基因Bcl-2表达量的减少从而减轻细胞凋亡，且GSPE终质量浓度为0.512mg/mL效果优于1.024mg/mL。

3 讨 论

CDDP所致细胞毒性最终可引起细胞坏死，包括凋亡和胀亡。凋亡是由基因介导的主动性细胞死亡，是一个有许多分子参与的复杂而有序的过程。研究表明，CDDP所致肾毒性机制主要由CDDP诱导肾小管上皮细胞凋亡所致[14-16]。Lieberthal等[17]研究证实，CDDP可引起原代培养的肾小管上皮细胞死亡（包括凋亡和坏死），死亡的形式取决于CDDP的浓度；Park等[18]研究发现，低浓度CDDP（8～100μmol/L）以时间和剂量依赖的方式诱导细胞凋亡；Okuda等[19]发现30μmol/L的CDDP诱导LLC-PKl凋亡，并使碱性磷酸酶、γ-谷氨酰胺转移酶活性降低。因此认为凋亡在CDDP肾毒性中发挥着重要的作用，减少肾小管上皮细胞凋亡是减轻CDDP肾毒性的一个重要的措施。

细胞在发生凋亡的过程中，因胞浆及胞核内染色质发生浓缩，细胞核会发生裂解从而产生凋亡小体。细胞是否发生凋亡与某些凋亡相关基因的激活表达密切相关，Bcl-2、Bax等基因都参与CDDP所致细胞凋亡过程。研究显示[19]，CDDP通过引起细胞氧化损伤，诱发细胞毒性，激活各种前凋亡分子包括Caspase 3、Caspase 9、Bax以及Fas系统，启动线粒体途径和死亡受体途径而引起细胞凋亡。Bcl-2家族是对Caspases激活进行调控的一类重要蛋白因子，根据功能分为两类：一类是抑制细胞凋亡的蛋白，如Bcl-2、Bcl-XL；另一类是促进细胞凋亡的蛋白，如Bax等。Bcl-2属原癌基因，编码26×103的线粒体膜蛋白，是最重要的凋亡抑制基因[20]。Bax是Bcl-2相关基因家族成员，可与Bcl-2形成异源性二聚体复合物，对Bcl-2的抗凋亡起抑制作用。促凋亡基因Bax与抗凋亡基因Bcl-2的比值是调节细胞凋亡的关键[21]，Bax/Bcl-2比值增加促进细胞凋亡。研究发现CDDP可引起剂量依赖性前凋亡分子Bax的激活。另有研究者发现CDDP先诱导Bax分子的激活，再使线粒体膜的通透性增加，细胞色素c从线粒体释放，激活Caspase 9，从而启动线粒体介导的凋亡[22]。在诱导凋亡作用下，Bax构象发生改变，疏水部分暴露，使其从胞浆转移至线粒体，Bax寡聚化在线粒体外膜上形成小孔，使细胞色素c释放，后者激活Caspase，从而诱发凋亡。Bcl-2通过阻止Bax从胞浆到线粒体转移而拮抗Bax的功能，从而抑制细胞凋亡[23-25]。

GSPE具有抗肿瘤、抗氧化、抗辐射、抗炎、保护心血管系统、抗衰老、抗疲劳、抗过敏、改善视觉、增强学习记忆等广泛的药理学作用。体外及动物体内实验也表明，GSPE本身不具有毒性[21]。本实验室前期已研究证明GSPE可通过调节机体抗氧化系统拮抗CDDP对HEK293细胞的氧化损伤作用，本研究则从细胞凋亡角度进一步探究GSPE对CDDP所致HEK293细胞毒性作用的影响。实验采用流式细胞仪检测HKE293细胞凋亡并运用Western blotting观察凋亡相关基因表达。结果显示，CDDP处理后，HEK293细胞早、中晚期凋亡率均显著增加；同时，CDDP诱导HEK293细胞凋亡，使得Bcl-2基因表达明显降低，Bax基因表达明显增加，表明Bcl-2、Bax基因是参与CDDP诱导HEK293细胞凋亡的重要原因。此外，也表明细胞凋亡在CDDP诱发HEK293细胞毒性过程中起重要作用。

GSPE拮抗因CDDP诱导的细胞凋亡其确切的分子机制目前仍不明确。其中一个可能的解释即为GSPE对凋亡相关基因表达的影响。因此，本研究测定并证明了CDDP诱导HEK293细胞凋亡以及GSPE拮抗凋亡的作用，显示GSPE是通过对凋亡相关基因的调控来而拮抗细胞凋亡。实验结果表明，一定终质量浓度GSPE与CDDP共同孵育可降低HEK293细胞凋亡率，增强抗凋亡基因Bcl-2基因表达量、抑制促凋亡基因Bax表达，表明GSPE对CDDP所致HEK293细胞凋亡具有拮抗作用，其作用机理与GSPE增加抗凋亡基因Bcl-2表达、增强细胞稳定性及抵御CDDP侵害的能力、降低促凋亡基因Bax表达，减轻细胞凋亡等方面保护细胞有关。

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