响应面法优化甜菊苷残渣中有效
抗氧化物质提取工艺 

洪怡蓝，徐文斌，任晓静，陈 洁，奚印慈*

(上海海洋大学食品学院，上海 201306)

摘 要：以甜菊苷残渣为原料，在单因素试验的基础上，采用响应面试验设计，以DPPH自由基的清除能力和提取物中总酚得率为双响应值，对超声提取过程的影响因素即料液比、超声时间、超声功率，进行三因素三水平的试验设计，优化甜菊苷残渣中有效抗氧化物质的提取工艺。结果表明：甜菊苷残渣中有效抗氧化物质的提取工艺为料液比1:24.41(g/mL)、超声时间38.05min、超声功率164.62W，此时DPPH自由基清除率预测值为91.18%，总酚得率为16.49mg/g。结合实际操作，调整料液比1:24(g/mL)、超声时间38min、超声功率164W，并进行重复实验进行验证，平均DPPH自由基清除率为(90.47±1.43)%，总酚得率为(16.14±0.36)mg/g，接近预测值。

关键词：甜菊苷残渣；总酚；超声提取；响应面法

Optimization of Extraction Conditions of Antioxidant Components from Stevia Residue after Stevioside Extraction by Response Surface Methdology by Response Surface Methodology

HONG Yi-lan，XU Wen-bin，REN Xiao-jin，CHEN Jie，XI Yin-ci*

(College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

Abstract：The ultrasonic extraction of antioxidant components from Stevia residue after stevioside extraction was studied by single factor approach and response surface methodology. The extraction conditions were optimized with respect to material/liquid ratio, ultrasonication duration and ultrasonic power using a three-variable, three-level experimental design. In the optimization, DPPH radical scavenging capacity and the extraction yield of total polyphenols were used as response variables. The optimal extraction conditions of material/liquid ratio, ultrasonication duration and ultrasonic power were found to be 1:24.41 (g/mL), 38.05 min and 164.62 W, respectively. The predicted DPPH radical scavenging capacity and yield of total polyphenol under the optimized conditions were 91.18% and 16.49 mg/g, respectively. From the view of practical application, the modified extraction conditions were 1:24 (g/mL), 38 min and 164 W, under which repeated experiments showed an average DPPH radical scavenging efficiency of (90.47 ± 1.43)% and an average yield of total polyphenols of (16.14 ± 0.36) mg/g with good agreement with the predicted results.

Key words：Stevia residue after stevioside extraction；total polyphenols；ultrasonic extraction；response surface methodology

中图分类号：TS201.1 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)22-0081-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201322016

国内外对甜菊的研究主要集中在其糖苷的提取和应用上[1-2]，我国还有相关甜菊生物发酵制剂抗氧化活性的研究[3]，而对于甜菊中多酚类物质等抗氧化活性成分的探讨鲜有报道[4]。植物多酚是一种广泛存在于自然界中的多羟基酚类化合物的总称，主要集中在植物体的叶、皮、木、根等部位[5]。它具有良好的抗氧化、抗病毒、抗动脉硬化、抗诱变等作用[6-7]，还具有防治中风、冠心病等心脑血管疾病等多种生理功能。

近年来，我国在糖苷产品生产供应量上约占全球总产量的90%[8]，生产后剩余的大量甜菊苷残渣中富含的高效抗氧化活性成分[9]就未能得到很好的综合利用，造成极大的资源浪费的同时还严重污染了生态环境。

本研究以甜菊苷残渣作为原料，利用超声波产生的强烈振动、空化效应、粉碎作用等提取技术，破坏植物细胞壁，使细胞中的有效物质得以释放，有效提高提取效率[10]，并对其所含抗氧化活性成分进行研究。在单因素试验的基础上，采用响应面法分析，以甜菊苷残渣提取液对DPPH自由基的清除能力及提取物中总酚含量为双响应值，对料液比、超声时间、超声功率进行三因素三水平的试验设计，优化提取工艺，获得最优工艺条件，以期为甜菊苷残渣天然抗氧化有效物质的综合开发利用开辟新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甜菊苷残渣系选自生产糖苷后的残渣，由日本维科株式会社提供。

1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH，纯度≥85%) 德国Fluka公司；无水乙醇、焦性没食子酸、Folin-Ciocalteu试剂、无水碳酸钠均为分析纯 上海国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

ALC-210.4电子分析天平 上海精密仪器仪表有限公司；HSS-11-6电热恒温水浴锅 上海沪粤明科学仪器有限公司；SK5210HP超声波仪 上海科导超声仪器有限公司；80-5微电脑离心机 江苏国华电器有限公司；DZF-6050型真空干燥箱 上海精宏真空设备有限公司；RE-52AA旋转蒸发器 上海雅荣生化设备仪器有限公司；UV-3000PC型紫外分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 甜菊苷残渣中有效抗氧化物质的提取工艺

甜菊苷残渣→超声水浴萃取→萃取液进行DPPH自由基清除测定→提取液真空干燥→干物质总酚提取液的制备→总酚得率的测定

1.3.2 影响提取效果的单因素试验

甜菊苷残渣为原料样品，以其水提液的DPPH自由基清除率以及样品的总酚得率为考察对象，分别以料液比(甜菊苷残渣:蒸馏水，g/mL)、超声时间、超声功率3个因素进行单因素试验，考察各因素对DPPH自由基清除率、总酚得率的影响。单因素试验因素及水平见表1。

表 1 单因素试验因素与水平

Table 1 Coded levels for independent variables used in
one-factor-at-a-time design

1.3.3 DPPH自由基清除率的测定

DPPH自由基的无水乙醇溶液呈紫色，最大吸收波长为517nm。用无水乙醇配制成浓度为2×10-4mol/L的溶液，定量转入棕色容量瓶中，避光0～4℃冷藏保存，现配现用。取2×10-4mol/L DPPH溶液与等体积甜菊苷残渣提取液混合后摇匀，室温暗处放置30min，在波长517nm处用无水乙醇校准后测定该混合溶液的吸光度[11-12]。DPPH自由基清除率(Y，%)按式(1)计算：

(1)

式中：Ai为等体积DPPH溶液加甜菊苷残渣提取液的吸光度；Aj为等体积的无水乙醇加甜菊苷残渣提取液的吸光度；A0为等体积的DPPH溶液与无水乙醇的吸光度。

1.3.4 总酚得率的测定

总酚与Folin-Ciocalteu试剂发生特异性反应，反应产物对特定波长有最大的吸收，且吸光度与总酚的量在一定质量浓度范围内成线性关系。采用Folin-Ciocalteu法[13-14]，以没食子酸(gallic acid)为标准样品建立标准曲线。准确称取没食子酸标准样品0.0100g，用蒸馏水定容至100mL棕色容量瓶，即得质量浓度0.1mg/mL没食子酸标准溶液。取上述标液0.0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL于25mL棕色容量瓶加蒸馏水至6mL，加0.5mL的Folin-Ciocalteu溶液，充分摇匀后在3～8min内加20%的Na2CO3溶液1.5mL，充分混合后定容至刻度线，30℃避光放置30min后以0管为空白，在760nm波长处测定吸光度[15]。

超声水浴萃取液干物质的总酚提取液的制备[16-18]：将真空干燥后的干物质用70%乙醇进行超声波提取后3500r/min离心10min，取上清液即得甜菊苷残渣样品提取物的总酚提取液，提取液按上述方法测定吸光度，按式(2)计算总酚得率。

(2)

式中：F为总酚得率/(mg/g)；ρ为总酚质量浓度/(μg/L)；
V为提取液体积/mL；m为样品质量/g。

1.4 数据分析

根据单因素试验所得的结果，选取其中较佳条件，利用Design Expert 8.0软件进行工艺参数的优化组合，采用Box-Behnken响应面分析得到回归模型和优化的工艺参数。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的建立

以总酚含量(以没食子酸计)标准溶液的质量浓度ρ为横坐标，吸光度A为纵坐标建立标准曲线，线性回归方程为：A=0.1709ρ＋0.0216(R2=0.9984)。

2.2 单因素试验

2.2.1 料液比对DPPH自由基清除率与总酚得率的影响

表 2 料液比对DPPH自由基清除率与总酚得率的影响

Table 2 Effect of material/liquid ratio on DPPH radical scavenging rate and the yield of total phenols

超声时间30min、超声功率200W条件下，考察料液比依次为1:5、1:10、1:15、1:25、1:35、1:45(g/mL)时对DPPH自由基清除率与总酚得率的影响。由表2可知。料液比在1:5～1:25(g/mL)区间时，抗氧化活性物质随着提取液用量的增加而大量溶解，此时DPPH自由基的清除率及总酚得率也随之升高。当料液比为1:25(g/mL)时2者均达到最大值，之后随着提取液用量的增加而降低。随着提取液用量的增加，有效抗氧化物质总酚溶解度增加，且料液比为1:25(g/mL)得到最大值，随后随提取液用量的增加，有效抗氧化物质总酚的溶解度降低，呈现下降趋势。

2.2.2 超声时间对DPPH自由基清除率与总酚得率的影响

表 3 超声时间对DPPH自由基清除率与提取物总酚得率的影响

Table 3 Effect of ultrasonic treatment duration on DPPH scavenging rate and the yield of total phenols

料液比1:25(g/mL)、超声功率200W条件下，超声时间依次为5、10、20、40、60、80min时对DPPH自由基清除率与总酚得率的影响。由表3可知。在5～40min的时间范围内，DPPH自由基清除率及提取物总酚得率随着超声时间的延长而升高，当超声时间达到40min时，提取物中的有效抗氧化物质得以最大程度释放，此时提取物DPPH自由基清除率达到最大值，提取物的总酚得率最高，40min之后提取物中有效抗氧化物质溶解量相对稳定，故DPPH自由基清除率及总酚得率的变化趋势呈现平缓。

2.2.3 超声功率对DPPH自由基清除率与总酚得率的影响

料液比1:25(g/mL)、超声时间40min条件下，超声功率依次为80、110、140、170、200W时对DPPH自由基清除率与总酚得率的影响。由表4可知。超声功率越高，DPPH自由基的清除率及总酚得率越高，由于超声波的作用破坏了原料植物的细胞壁，释放了细胞中的有效抗氧化物质，当超声功率达到170W时DPPH自由基清除率及提取物总酚得率均达到最高值，此后由于释放量的变化不大，趋势平缓。

表 4 超声功率对DPPH自由基清除率与提取物总酚得率的影响

Table 4 Effect of ultrasonic power on DPPH radical scavenging rate and the yield of total phenols

2.3 响应面试验设计优化工艺参数

2.3.1 试验因素和水平的选择

结合单因素试验的结果，采用Box-Behnken的设计原理，进行三因素三水平响应面设计优化工艺参数，即选取料液比、超声时间、超声功率3个因素作为自变量，以DPPH自由基清除率(Y1)和提取物总酚得率(Y2)作为双响应值进行试验的优化，试验因素和水平见表5。

表 5 试验因素水平及编码

Table 5 Factors and levels used in response surface methodology

2.3.2 响应面分析设计及结果

根据Design Expert 8.0软件对试验进行安排，试验结果分析见表6～8。

表 6 响应面分析方案及试验结果

Table 6 Program and experimental results of RSA

表 7 DPPH自由基清除率回归方程方差分析

Table 7 Analysis of variance for the regression equation for
DPPH radical scavenging rate

表 8 总酚得率回归方程方差分析

Table 8 Analysis of variance for the regression equation for the
yield of total phenols

对响应值及各因素进行拟合，得到关于DPPH自由基清除率和总酚得率的回归方程如下：

Y1=91.07＋0.078X1－0.011X2－0.97X3＋0.72X1X2＋0.42X1X3＋0.23X2X3－0.89X12－1.75X22－1.55X32

Y2=16.44＋0.040X1－0.053X2－0.30X3＋0.48X1X2＋0.21X1X3＋0.39X2X3－0.43X12 －0.32X22－0.81X32

从表7可知，超声功率(X3)对甜菊苷残渣样品的DPPH自由基清除率影响最大，其次是料液比(X1)，而超声时间(X2)的影响相对较小；从表8可知，超声功率(X3)对总酚得率的影响最大，其次是超声时间(X2)，而料液比(X1)对其的影响最小。两变量的模型p＜0.05，均达到显著水平，回归方程失拟检验p＞0.05，均差异不显著，说明所得的回归方程拟合比较好，可以用于甜菊苷残渣样品的DPPH自由基清除率及总酚得率的理论预测。

a.Y1=f(X1, X2)

b. Y1=f(X1, X3)

c.Y1=f(X2, X3)

图 1 各因素交互作用对DPPH自由基清除率的影响

Fig.1 Response surface and contour plots showing the interactive effects of extraction parameters on DPPH radical scavenging rate

a. Y2=f(X1, X2)

b.Y2=f(X1, X3)

c.Y2=f(X2, X3)

图 2 各因素交互作用对总酚得率的影响

Fig.2 Response surface and contour plots showing the interactive effects of extraction parameters on the yield of total polyphenols

由图1、2可知，响应面曲线越陡，相互作用的因素对甜菊苷残渣样品的DPPH自由基清除率或总酚得率的影响越显著，该结果与方差分析结果一致。通过回归方程可以得到最优的预测值，即料液比1:24.41(g/mL)、超声时间38.05min、超声功率164.62W，此时DPPH自由基清除率的理论值91.18%，总酚得率的理论值可达16.49mg/g。结合实际操作，优化工艺参数，即料液比1:24(g/mL)、超声时间38min、超声功率164W，并对最佳条件做了3次重复实验进行验证，平均DPPH自由基的清除率为(90.47±1.43)%，总酚得率为(16.14±0.36)mg/g，所得参数较为可靠。

3 结 论

3.1 在单因素试验的基础上，采用响应面分析法优化了各参数，并结合实际操作确定了甜菊苷残渣抗氧化活性物质提取的最优工艺条件：料液比1:24(g/mL)、超声时间38min、超声功率164W，在该条件下所得提取液对DPPH自由基的清除率可达(90.47±1.43)%，总酚得率达(16.14±0.36)mg/g。说明响应面试验设计分析能较好地对试验的工艺参数进行优化。

3.2 实验结果表明，对甜菊苷残渣样品的DPPH自由基清除率影响最大的是超声功率，其次是料液比，而超声时间的影响相对较小；对总酚得率影响最大的因素是超声功率，其次是超声时间，影响最小的则是料液比。

3.3 优化超声技术萃取甜菊苷残渣抗氧化活性物质的提取工艺提取效果好，其提取物抗氧化性能较强。若能对其中的有效抗氧化成分进行分离纯化，不仅能够提高废弃物的综合利用，降低环境污染，而且为其成为应用于医药、食品工业等领域的新型天然抗氧化剂提供了理论依据。

参考文献：

[1] Kim l S, Yang M, Lee O H, et al. The antioxidant activity and the bioactive compound content of Stevia rebaudiana water extracts[J]. LWT-Food Science and Technology, 2011, 44(5): 1328-1332.

[2] 常丽娟. 甜菊糖甙化学分析法研究概况[J]. 国外医学: 卫生学分册, 2007, 34(3): 197-200.

[3] 于慧, 王锡昌, 奚印慈, 等. 甜叶菊生物发酵制剂抗氧化成分的分离纯化和结构鉴定[J]. 食品与发酵工业, 2010, 36(10): 46-49.

[4] 奚印慈, 山口敏康, 佐藤实, 等. ステビアの抗酸化性: 甜叶菊的抗酸化性[J]. 日本食品科学工学会誌, 1998, 45(5): 310-316.

[5] 赵扬帆, 郑宝东. 植物多酚类物质及其功能学研究进展[J]. 福建轻纺, 2006(11): 107-110.

[6] Reed J. Cranberry flavonoids, atherosclerosis and cardiovascular health[J]. Food Science and Nutrition, 2002, 42(Suppl 3): 16.

[7] Ross J A, Kasum C M. Dietry flavonoids: bioavailability, metabolic effects, and safety[J]. Annual Review of Nutrition, 2002, 22: 19-34.

[8] 卢占军, 刘先春, 易龙, 等. 利用甜叶菊渣为主要原料制备发酵饲料的研究[J]. 饲料工业, 2011, 32(13): 58-61.

[9] 于慧, 王锡昌, 奚印慈. 甜叶菊废弃物制得生物制剂的抗氧化活性研究[J]. 食品科学, 2008, 29(8): 65-69.

[10] 严伟, 李淑芬, 田松江. 超声波协助提取技术[J]. 化工进展, 2002, 21(9): 649-652.

[11] Cotellen N, Bernier J L, Catteau J P, et al. Antioxidant properties of hydroxyl flavones[J]. Free Radical Biology Medicine, 1996, 20(1): 35-43.

[12] 白红进, 周忠波, 杜红梅, 等. 黑果枸杞叶片甲醇提取物清除自由基活性研究[J]. 时珍国医国药, 2008, 19(2): 326-327.

[13] Amarowicz R, Pegg R B, Rahimi-Moghaddam P, et al. Free-radical scavenging capacity and antioxidant activity of selected plant species from the Canadian prairies[J]. Food Chemistry, 2004, 84(4): 551-562.

[14] 徐辉艳, 孙晓东, 张佩君, 等. 红枣汁中总酚含量的福林法测定[J]. 食品研究与开发, 2009, 30(3): 126-128.

[15] 曹艳萍, 代宏哲, 曹炜, 等. Folin-Ciocaileu比色法测定红枣总酚[J]. 安徽农业科学, 2008, 36(4): 1299; 1302.

[16] 中国国家标准化管理委员会. GB/T 8313—2008 茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法[S]. 北京: 中国标准出版社, 2008.

[17] 杨亚丽. 响应曲面法优化普那菊苣总酚提取工艺[J]. 西北林学院学报, 2009, 24(2): 118-120.

[18] 郭喜宝, 杨红玉, 刘利国. 紫锥菊有效成分提取工艺研究[J]. 西北药学杂志, 2011, 26(4): 245-247.