乳酸乳球菌对切达干酪成熟过程中质构和风味的影响

陈俊亮1,2,田 芬3,霍贵成2,*,张慧芸1

(1.河南科技大学食品与生物工程学院,河南 洛阳 471003;2.东北农业大学 乳品科学教育部重点实验室,

黑龙江 哈尔滨 150030;3.杭州娃哈哈集团有限公司研究院,浙江 杭州 310018)

 

要:利用从传统发酵乳制品分离获得的乳酸乳球菌乳脂亚种KLDS4.0326和乳酸乳球菌乳酸亚种KLDS4.0424生产切达干酪,并分析干酪成熟期间的蛋白水解情况、微观结构变化、质构参数变化以及风味物质分布。结果表明:随着成熟时间的延长,酪蛋白含量降低,并分解产生新的小肽;硬度和凝聚性随着成熟时间的延长而降低,而黏着性、弹性、咀嚼性则增大;干酪横断面的孔径逐渐变小,网状结构逐渐紧密,形成比较致密光滑的质地。实验组干酪共检测出59种风味物质,其中挥发性酸和羰基化合物是干酪特征风味的主要来源。

关键词:乳酸乳球菌;干酪;质构;风味物质

 

Effect of Lactococcus lactis on Texture and Flavor of Cheddar Cheese during Ripening

 

CHEN Jun-liang1,2,TIAN Fen3,HUO Gui-cheng2,*,ZHANG Hui-yun1

(1. College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China;

2. Key Laboratory of Dairy Science, Ministry of Education, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China;

3. Research Institute of Hangzhou Wahaha Group Co. Ltd., Hangzhou 310018, China)

 

Abstract:Lactococcus lactis KLDS4.0326 and KLDS4.0424 isolated from traditionally fermented dairy products were used to produce Cheddar cheese, and the proteolysis, microstructural change, texture parameter variation and flavor substance distribution were analyzed during cheese ripening. Our results showed a decrease in casein content and formation of some new small peptides as well as hardness and cohesion, but an increase in adhesion, elasticity and chewiness as well as maturation time. More compact cross-section of cheese was observed, thus forming a relatively dense and smooth texture. Fifty-nine kinds of flavor compounds were detected in the cheeses, among which the volatile acids and carbonyl compounds were the major source of the characteristic cheese flavor.

Key wordsLactococcus lactis;cheese;texture;flavor compounds

中图分类号:Q939.97 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2013)21-0163-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201321034

干酪中的微生物在其成熟过程中起着至关重要的作用,而作为微生物主要来源的发酵剂一直是国内外学者研究的热点[1-3]。蛋白质水解是干酪成熟过程中重要的生物化学反应之一,该反应主要由酶催化引起[4-5],这些酶主要来源于乳本身、凝乳酶、发酵剂、辅助发酵剂以及外源非发酵剂微生物[6-9]。已有研究者证实发酵剂类型比干酪的制作方法更能影响切达干酪风味的形成[10]。国内的研究表明,在干酪生产过程中通过使用筛选获得的发酵剂,能够增加干酪风味物质的种类,使干酪的风味和质地得到明显的改善[11]。

首先用乳酸乳球菌乳脂亚种KLDS4.0326和乳酸乳球菌乳酸亚种KLDS4.0424复配的发酵剂生产切达干酪,然后对干酪成熟期间蛋白水解程度、微观结构、质构参数以及风味物质分布进行分析,旨在为开发新型干酪发酵剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乳酸乳球菌乳脂亚种KLDS4.0326和乳酸乳球菌乳酸亚种KLDS4.0424[12] 乳品科学教育部重点实验室工业微生物菌种保藏中心(KLDS-DICC)保存;直投式干酪发酵剂CHOOZITTM RA21 LYD 50 DCU 丹尼斯克公司;小牛皱胃酶 科汉森公司。

1.2 仪器与设备

TA.XT-2i型质构仪 英国Stable Microsystem公司;Agillent 6890-5973气相色谱-质谱联用仪(色谱柱:DB-5 (60m×0.25mm,0.25μm)) 美国Agilent公司;
E-1010(Giko)型离子溅射镀膜仪、S-3400N扫描电子显微镜 日本日立公司;CHRIST ALPHA 1-4型冻干机 德国Marin Christ公司;ES-2030型冷冻干燥仪 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 实验处理

实验组发酵剂组成为:乳酸乳球菌乳脂亚种KLDS4.0326和乳酸乳球菌乳酸亚种KLDS4.0424(两者复配比例为2:3);对照组发酵剂为:丹尼斯克公司直投式干酪发酵剂CHOOZITTM RA21 LYD 50 DCU。

1.3.2 切达干酪生产工艺流程

鲜牛乳→乳成分分析→过滤杀菌→冷却→添加氯化钙→接种发酵剂→产酸→添加凝乳酶→凝乳→切割凝块→切达化→凝块破碎和盐渍→成型→包装→成熟

1.3.3 干酪中蛋白质降解程度的测定

采用毛细管电泳分析法。流动缓冲液(50mmol/L)包含14.7mol/L H3PO4,6mol/L尿素溶液和0.05g/100mL羟丙基甲基纤维素(HPMC)调整pH值至2.5。上样缓冲溶液(pH 8.0)包含10mmol/L H3PO4,8mol/L尿素溶液和10mmol/L DTT。两种缓冲溶液使用前用0.22µm微孔膜过滤,所有分析用溶液均用去离子水配制。

取成熟0、4、8、12周的干酪pH 4.6-ISN部分溶解于上样缓冲溶液中,终质量浓度为10mg/mL,室温下放置1h后用0.22μm微孔膜过滤。用未涂层的熔融石英柱(60cm×50μm,检测窗口为石英柱长的50cm),样品在阳离子液中进行分离。样品注入压力0.5psi,进样时间5s,分离电压18.5kV,分离温度30℃,采用紫外检测器在214nm波长处进行检测,数据收集频率5Hz。每次进样前,将毛细管用0.1mol/L NaOH、去离子水、0.1mol/L HCl和流动缓冲溶液分别清洗3、5、3、5min。用32-Karat
软件进行毛细管电泳图的自动记录和数据分析。

1.3.4 成熟期间干酪质构测定

TPA测定干酪样品参数的设定:分别取成熟0、4、8、12周的干酪样品,室温下放置2h,利用TA.XT-2i型质构仪对干酪进行TPA分析。测量前探头下降速率为2mm/s;测试速率为5mm/s;测量后探头回程速率为2mm/s;下压变形为10mm;触发力为0.2N;探头类型为P/5。

1.3.5 成熟期间干酪微观结构分析

取样及固定:使用刀片从样品内部取适量的干酪,切成小片,表面保持平整,然后放入1~2倍的2.5%、pH6.8的戊二醛溶液中,并置于4℃冰箱中固定3h。

冷冻:使用液氮迅速冷冻样品,然后轻轻锤击冻结样品,使之自然断裂。

冲洗:用0.1mo/L的pH6.8磷酸缓冲液洗涤3次,每次10min。

脱水:分别用体积分数为50%、70%和90%的乙醇溶液进行脱水,每次12min;100%乙醇脱水2次,每次10min。

置换:100%乙醇;乙醇-叔丁醇(1:1,V/V);100%叔丁醇各一次,每次15min。

干燥:用ES-2030型冷冻干燥仪对样品干燥4h。

粘样:将样品观察面向上粘贴在扫描电镜样品台上。

镀膜:使用E-1010(Giko)型离子溅射镀膜仪在样品表面镀上一层1500nm厚的金属膜。

观察:将处理好的样品放入样品盒中,用扫描电镜观察菌体形态并拍照记录。

1.3.6 成熟期间干酪风味物质的分析

1.3.6.1 色谱分析条件

程序升温条件:初始温度60℃,保持3min;以6℃/min升温至150℃,保持5min;以4℃/min,升温至230℃,保持5min。分析总时间48min。色谱柱:DB-5 (60m×0.25mm,0.25μm);进样口:250℃离子源:230℃;四极杆:150℃;传输线:270℃;载气:He;进样模式:splitless;流速:1mL/min;电离方式:EI 70eV;质量扫描范围:40~500amu。

1.3.6.2 SPME 条件

固相微萃取头:PDMS/DVB (65μm);萃取头解析时间:1min。

1.3.6.3 样品处理

取样品30g,水浴温度65℃,萃取头吸附时间40min。

1.4 统计分析

实验数据为3组实验样品的平均值,数据处理采用SPSS13.0软件进行方差分析(ANOVA),检验差异显著性。

2 结果与分析

2.1 干酪成熟过程中蛋白质的降解程度

利用毛细管区带电泳对干酪成熟过程中pH4.6-ISN部分的变化进行分析。以未成熟干酪样品的电泳图谱作为对照(图1A),分别对成熟4、8、12周的切达干酪样品进行毛细管电泳,分析干酪成熟过程中的蛋白质降解情况随时间的变化情况。在成熟4周时,通过分析在214nm波长处检测pH4.6-ISN部分的蛋白质、多肽和小肽的分布情况(图1B),可知干酪中的蛋白质降解程度较低,这可能与乳酸菌生长环境改变而导致其增殖缓慢有关。成熟8周时(图1C),酪蛋白部分水解程度很大,酪蛋白含量显著降低,形成很多的小肽,这些肽由于荷质比的不同依次显示在电泳图中;继续成熟至12周时(图1D),发现不同迁移时间的特征峰,随着成熟时间的延长发生迁移,这种现象说明分解产生了与酪蛋白不同的新物质。

471331.jpg 

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A~D.成熟0、4、8、12周的切达干酪样品。

图 1 切达干酪成熟中pH4.6-ISN部分毛细管区带电泳图

Fig.1 Capillary zone electrophoresis of pH4.6-ISN from cheddar cheese during ripening

2.2 成熟期间干酪的质构分析

干酪的质构特征与干酪的组成、成熟度、结构以及分子间的拉伸力有关,也是表征干酪成熟变化的重要指标[13]。随着干酪的不断成熟,干酪的黏度、弹性、凝聚性、黏着性、咀嚼性、硬度均可能发生变化。通过测定成熟0、4、8、12周的干酪样品,实验组和对照组干酪的质构变化情况见表1,两组干酪的测定参数变化趋势一致,硬度和凝聚性随着成熟时间的延长而降低,而黏着性、弹性、咀嚼性则随着成熟时间的延长而增大。

干酪的成熟过程中质构的变化会经历两个阶段。第一个阶段是干酪成熟中早期,这时干酪质构将会发生显著变化。在该阶段,血纤维蛋白溶酶、内源性凝乳酶、外源性凝乳酶以及微生物蛋白酶协同发挥作用,酪蛋白是唯一的连续固态相,组成干酪微观结构的酪蛋白网络结构发生分解,形成光滑均匀的橡胶态未成熟干酪。第二阶段是成熟后期,质构进一步发生变化但相对缓慢,在此阶段αs1-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白缓慢发生降解[14]。

表 1 KLDS4.0326和KLDS4.0424干酪的TPA质地参数值

Table 1 TPA parameters of cheddar cheeses KLDS4.0326 and KLDS4.0424

组别

周数

黏度/(g•s)

弹性

凝聚性

黏着性/g

咀嚼性/g

硬度/N

实验组

0

-377.268±7.470

0.246±0.063

0.211±0.023

111.460±2.366

33.871±8.748

7.377±0.683

4

-432.910±5.438

0.296±0.048

0.213±0.034

117.566±2.133

35.533±2.889

6.762±0.288

8

-455.074±6.319

0.302±0.008

0.184±0.007

120.013±6.373

34.323±2.170

5.756±0.412

12

-594.755±9.972

0.311±0.014

0.163±0.030

126.194±2.046

36.802±7.391

4.580±0.262

 

 

 

 

 

 

 

 

对照组

0

-409.049±1.708

0.239±0.004

0.187±0.030

120.951±3.208

30.823±0.406

8.774±0.113

4

-464.568±9.342

0.257±0.022

0.179±0.019

121.092±1.427

31.103±6.940

7.974±0.336

8

-571.180±2.033

0.261±0.012

0.173±0.014

152.092±1.757

35.668±6.054

5.708±0.499

12

-859.753±2.947

0.283±0.044

0.161±0.029

169.339±2.297

44.698±3.035

4.810±0.225

 

 

凝聚性表示测试样品经过第一次压缩变形后所表现出来的对第二次压缩的相对抵抗能力,反映咀嚼干酪时干扰抵抗受损并紧密黏连保持完整的性质,反映干酪内部结合力的大小。由表1可知,实验组干酪的凝聚性总体趋势是在不断下降的;Pastorino等[15]研究表明干酪的内部结合力会随着时间的增加而降低,这时由于干酪在成熟的过程中,蛋白质间相互作用发生改变,干酪内部化学键不再保持原有的完整性,在质构仪外力的作用下容易发生永久性变形凝聚性下降,对照组干酪的凝聚性也呈现下降趋势。

硬度是硬质干酪质构分析的主要参数。在干酪的成熟过程中,由于蛋白质水解程度的增加,产生大量水溶性物质,酪蛋白原来的网状结构被破坏,干酪体系变得松散,硬度随着下降。一般情况下认为干酪组织状态和质地和初始状态发生改变的重要导致原因是αs1-酪蛋白的分解。Lindberg等[7]提出酪蛋白胶束模型,其认为干酪αs1-酪蛋白能与两个或者更多的酪蛋白分子(αs1-酪蛋白、β-酪蛋白)强烈的作用,形成一个蛋白网络,但是在干酪的成熟过程中αs1-酪蛋白分子与凝乳酶或蛋白酶作用,失去联系蛋白质网络结构的能力[16-18];除此之外,由于pH值的升高,钙从酪蛋白胶束网络中溶解出来,网络结构遭到破坏,从而使干酪结构变得松散,导致干酪硬度下降[19-20]。

2.3 成熟期间干酪微观结构观察

cjl-t2a.tif

A

cjl-t2b.tif

B

 

cjl-t2c.tif

C

cjl-t2d.tif

D

 

A~D.成熟0、4、8、12周的切达干酪样品。

图 2 切达干酪成熟期间微观结构的扫描电镜观察(×1500)

Fig.2 SEM observation of the microstructure of cheddar cheeses during ripening (×1500)

对成熟4、8、12周的切达干酪样品与未成熟干酪样品比较(图2A)进行扫描电镜观察,干酪的微观结构随时间的变化如图2所示。干酪随着成熟时间的增加,干酪横断面的孔径逐渐变小,在成熟4周时,开始表现出连续性,形成的凝胶的蛋白质分布均匀一致,形成的间隙空间更小(图2B)。从第8周开始,干酪的微观结构发生明显的变化,网状结构逐渐紧密,空隙随着成熟时间的增加,逐渐变小,同时蛋白质水解程度增强,酪蛋白胶束聚集体被降解,从而形成更加均匀的网状结构(图2C)。成熟12周后,干酪的微观结构明显变化,形成比较致密光滑的结构(图2D)。

2.4 成熟期间干酪风味物质的变化

添加发酵剂的目的之一是赋予乳制品良好的风味,产生的风味物质包括由于蛋白质及脂肪分解所产生的低级代谢产物,主要有非挥发性酸、挥发酸、拨基化合物及其他物质。这些风味物质的含量和种类决定着产品的适口性。不同的菌株因代谢途径不同,产生不同的风味物质。本实验中分别使用KLDS4.0326和KLDS4.0424混合发酵剂制作干酪作为实验组,以及丹尼斯克公司发酵剂CHOOZITTM RA21 LYD 50 DCU制作的切达干酪作为对照组,在10℃条件下成熟3个月,采用GC-MS分别对两组干酪的挥发性风味物质进行分析,结果如图3、4和表2、3所示。

由图3、4可知,实验组和对照组的GC-MS图谱具有近似的轮廓,风味物质主要有非挥发性酸、挥发酸、羰基化合物及其他物质。其中实验组共检测出59种风味物质,而对照组检测出67种成分,根据图谱分析可知,挥发性酸和羰基化合物是特征风味的主要来源。

484589.jpg 

图 3 实验组干酪GC-MS风味物质分析图谱

Fig.3 GC-MS analysis of cheese flavor compounds

484612.jpg 

图 4 对照组干酪GC-MS风味物质分析图谱

Fig.4 GC-MS analysis of cheese flavor compounds in the control group

表 2 实验组干酪样品中主要风味物质成分

Table 2 Major cheese flavor compounds

编号

保留时间/min

峰面积百分比/%

物质名称

1

4.24

6.76

乙醇(ethanol)

2

5.86

3.05

二苯基硅二醇(dimethyl silanediol)

3

6.27

3.84

3-羟基-2-丁酮(3-hydroxy-2-butanone)

4

7.46

1.65

丁酸(butanoic acid)

5

12.69

11.43

己酸(hexanoic acid)

6

17.89

23.02

辛酸(octanoic acid)

7

18.54

0.61

辛酸乙酯(octanoic acid ethyl ester)

8

23.59

0.56

氯乙酸(chloroacetic acid)

9

23.88

16.14

n-癸酸(n-decanoic acid)

10

25.05

0.46

癸酸乙酯(decanoic acid ethyl ester)

11

31.00

4.16

正十二烷酸(dodecanoic acid)

12

32.15

0.38

正十二烷酸乙酯(dodecanoic acid, ethyl ester)

13

37.32

1.21

十四烷酸(tetradecanoic acid)

14

38.30

0.27

十四烷酸乙酯(tetradecanoic acid ethyl ester)

 

 

由图3、表2可知,在实验组中,采用SPME/GC-MS对干酪的风味组分进行分析,干酪成熟3个月时,对干酪特征风味贡献较大的化合物检测到7种,分别为:3-羟基-2-丁酮、乙醇、己酸、辛酸、n-癸酸、正十二烷酸、丁酸。微生物产生少量的丁二酮、2,3-丁二醇等四碳化合物和微量挥发性酸、醇、醛等物质。对产生风味起重要作用的是3-羟基-2-丁酮,特殊风味的形成受菌株种类和干酪成熟时间的影响。对照组中的主要风味化合物包括:乙醇、丁酸、己酸、辛酸、n-十六烷酸,与实验组比较发现,在对照组干酪样品中检测到多种酯类,如丁酸乙酯、辛酸乙酯、二十酸乙酯、邻苯二甲酸二乙酯等(图4、表3)。

表 3 对照组干酪样品中主要风味物质成分

Table 3 Major cheese flavor ingredients in the control group

编号

保留时间/min

峰面积百分比/%

物质名称

1

4.22

3.69

乙醇(ethanol)

2

4.81

1.14

乙酸(acetic acid)

3

7.51

4.08

丁酸(butanoic acid)

4

8.01

0.35

丁酸乙酯(butanoic acid, ethyl ester)

5

10.31

0.19

2-辛酮(2-octanone)

6

12.70

10.05

己酸(hexanoic acid)

7

17.86

11.32

辛酸(octanoic acid)

8

18.53

0.79

辛酸乙酯(octanoic acid, ethyl ester)

9

23.84

4.27

n-癸酸(n-decanoic acid)

10

25.04

0.57

二十酸乙酯(eicosanoic acid ethyl ester)

11

31.02

1.38

正十二烷酸(dodecanoic acid)

12

32.04

0.38

邻苯二甲酸二乙酯(diethyl Phthalate)

13

35.23

0.31

苯甲酸(benzoic acid)

14

36.06

0.91

癸酸(decanoic acid)

15

37.35

2.25

十四烷酸(tetradecanoic acid)

16

39.63

0.70

硬脂酸(octadecanoic acid)

17

42.83

7.46

n-十六烷酸(n-hexadecanoic acid)

 

 

3 结 论

本实验利用乳酸乳球菌乳脂亚种KLDS4.0326和乳酸乳球菌乳酸亚种KLDS4.0424制备切达干酪,并分析了干酪成熟期间的蛋白水解情况、微观结构变化、质构参数变化以及风味物质分布。随着干酪成熟时间的延长,酪蛋白部分水解,形成很多的小肽,这些肽随着成熟时间的延长发生特征峰迁移,这说明分解产生了与酪蛋白不同的新物质;硬度和凝聚性随着成熟时间的延长而降低,而黏着性、弹性、咀嚼性则增大;干酪横断面的孔径逐渐变小,网状结构逐渐紧密,形成比较致密光滑的质地。实验组和对照组干酪样品的GC-MS图谱具有近似的轮廓,风味物质主要有非挥发性酸、挥发酸、羰基化合物及其他物质,实验组共检测出59种风味物质,而对照组检测出67种成分,挥发性酸和羰基化合物是干酪特征风味的主要来源。

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收稿日期:2013-06-29

基金项目:“十二五”国家科技支撑计划项目(2012BAD29B07);河南科技大学青年科学基金项目(2013QN015)

作者简介:陈俊亮(1981—),男,讲师,博士,研究方向为乳品微生物。E-mail:junliangchen@126.com

*通信作者:霍贵成(1958—),男,教授,博士,研究方向为乳品加工。E-mail:gchuo58@126.com