一种新型茶叶籽黄酮单体的分离鉴定及其抗氧化活性

侯留鑫，王华清，郑铁松*，吕丽爽

(南京师范大学金陵女子学院食品科学与营养系，江苏 南京 210097)

摘 要：采用大孔吸附树脂HPD826、ODS柱和Sephadex LH-20分离纯化得到高纯度的茶叶籽黄酮单体化合物Ⅰ，通过紫外(UV)、红外(IR)、质谱(MS)、核磁共振(NMR)等方法鉴定其分子结构为柚皮素-7-O-(β-D-吡喃木糖基(1→6))(β-D-葡萄糖基(1→3)-α-L-鼠李糖基(1→2))-β-D-葡萄糖苷。对化合物Ⅰ及其同系物柚皮素和柚皮苷的抗氧化活性进行对比研究。结果表明：化合物Ⅰ在体外有一定的抗氧化能力，3种物质的抗氧化活性关系为柚皮素＞柚皮苷＞化合物Ⅰ，即黄酮苷元的抗氧化活性大于黄酮糖苷，黄酮二糖苷的抗氧化活性大于黄酮四糖苷。

关键词：茶叶籽；黄酮；鉴定；抗氧化

Isolation and Identification of a New Flavonoid from Tea (Camellia sinensis) Seeds and Its Antioxidant Activity

HOU Liu-xin，WANG Hua-qing，ZHENG Tie-song*，LÜ Li-shuang

(Department of Food Science and Nutrition, Ginling College, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China)

Abstract：Using HPD826 resin, ODS and Sephadex LH-20 column chromatographies, compound Ⅰ, a flavanone glycoside was obtained from the crude extract of tea seeds rich in flavonoids. The structure of compound Ⅰ was identified by UV, IR, NMR and LC-MS as naringenin-7-O-[β-D-xylopyranosyl(1→6)][β-D-glucopyranosyl(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)]-β-D-glucopyranoside. The antioxidant activity in vitro was measured, and compared with reference standards of naringenin and naringin. Results showed that the antioxidant activity in vitro of these three materials followed the order: naringenin ＞ naringin ＞ compound Ⅰ, suggesting that the antioxidant activity of the aglycon flavanone was higher than that of the flavanone glycosides, and the antioxidant activity of diglycoside flavanone was higher than that of flavanone with four glycosyl moieties. Therefore, the glycosyl moieties in flavanones can reduce antioxidant activity.

Key words：tea seed；flavonoids；identification；antioxidant activity

中图分类号：TS201.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)21-0115-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201321024

茶叶籽是山茶属植物茶(Camellia sinensis(L.) O. Kuntze，Theaceae)即茶树的果实，目前茶叶籽的制油及综合开发利用已引起国内各相关企业和单位的高度重视[1-2]。据报道[3-5]，茶叶籽中的黄酮类化合物主要是山奈酚、柚皮素及其衍生物，有多种生理活性。研究[6-7]表明，黄酮类化合物由于含有大量的酚羟基，具有抗菌、抗炎、抗氧化及抗癌等作用，而这些生理活性是以抗氧化性为基础的，尤其是清除超氧阴离子自由基(O2－•)。柚皮素(naringenin)是一种天然的二氢黄酮类化合物[8]，同时也是柚皮苷(naringin)的苷元(图1)。柚皮素和柚皮苷主要存在于芸香科植物葡萄柚、橘、橙的果皮和果肉中[9]，均有一定的抗氧化活性[10-12]。

图 1 柚皮素和柚皮苷的化学结构

Fig.1 Chemical structure of naringenin and naringin

本研究采用大孔吸附树脂HPD826、ODS柱和Sephadex LH-20分离纯化得到高纯度的茶叶籽黄酮单体，通过紫外(UV)、红外(IR)、质谱(MS)、核磁共振(NMR)等方法鉴定其分子结构。对获得的茶叶籽单体的体外抗氧化作用进行了研究，并与柚皮素和柚皮苷标准品的抗氧化活性进行了对比，初步分析该类黄酮的抗氧化构效关系。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

茶叶籽(储叶种) 溧水县健茗茶厂；ODS填料(SP-120-50-ODS-A) 美国Sunchrom公司；Sephadex LH-20 美国GE Healthcare公司。

柚皮素(naringenin)、柚皮苷(naringin)分析标准品 上海源叶生物科技有限公司；乙腈(色谱纯)、氘代甲醇 德国Merck公司；总抗氧化能力(T-AOC)测定试剂盒、抗超氧阴离子自由基能力测试盒 南京建成生物工程研究所；甲醇、氢氧化钠、无水乙醇、三氯化铝、醋酸镁、四氢硼钠、浓盐酸、溴化钾等均为国产分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

常压层析柱、AM3250B微型旋涡混合仪、DBS-100自动部分收集器、DHL-A恒流泵、HD-3型紫外检测仪 上海沪西分析仪器厂；722可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；MCFD5005A冷冻干燥机 上海虹益仪器仪表有限公司；N-1001型旋转蒸发仪 日本Eyela公司；Cary5000型紫外-可见-近红外分光光度计 美国Varian公司；DHG电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；1290 型高效液相色谱仪、9460型四极杆串联质谱 美国Agilent公司；NEXUS670型智能傅里叶红外光谱仪 美国尼高力公司；AVANCE400型核磁共振波谱仪 瑞士Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 提取分离

茶叶籽粉在液料比26:1(V/m)、乙醇体积分数58%、提取温度82℃、提取时间2h的条件下提取2次得粗提液，总黄酮的提取量为13.54mg/g。粗提液4℃冷藏静置12h后过滤，经旋转蒸发浓缩后进行HPD826大孔吸附树脂纯化，具体纯化条件为：上样质量浓度1.8mg/mL，上样速率为2mL/min，体积分数为50%的乙醇为洗脱剂，洗脱剂流速为1mL/min。样品经大孔树脂纯化后茶叶籽黄酮纯度为40.81%。此后进行ODS柱分离，采用20%体积分数的乙醇洗脱，在280nm波长进行紫外检测并记录紫外吸收谱图，合并目标峰附近收集到的洗脱液浓缩后进行两次Sephadex LH-20分离，用40%体积分数的甲醇洗脱，得到纯度为98%的茶叶籽黄酮单体——化合物Ⅰ。

1.3.2 结构鉴定

1.3.2.1 紫外光谱扫描

取2～3mL提取液溶于甲醇中，以甲醇作参比，在波长200～500nm范围内扫描，保存图谱，加6滴三氯化铝试液，混匀后立即在相同波长范围内扫描，保存图谱。试液中再加入3滴盐酸，并立即在相同波长范围内扫描，保存图谱。

1.3.2.2 红外光谱(IR)扫描

取少量样品粉末于玛瑙研钵中，加入适量溴化钾，研磨至细后压片。把压好的透明薄片放入红外光谱仪特定的装置中在400～4000cm-1范围内扫描，获得化合物的红外吸收光谱。

1.3.2.3 液质联用(HPLC-MS)分析

采用Agilent 1100series高效液相色谱仪，Zorbax XDB-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，DAD检测器。Agilent 9460型四极杆串联质谱。

色谱条件：进样量：3μL，流速：0.6mL/min，柱温：25℃，检测波长：280nm。流动相A：0.05%甲酸水溶液，流动相B：乙腈。流动相梯度：0～20min，B由23%变为27%。

质谱条件：电喷雾离子化(ESI)源，负离子模式检测，雾化压力为20psi，干燥气体的流速为11L/min，毛细管温度为350℃，毛细管电压为3.5kV，扫描范围：m/z 100～1500。

1.3.2.4 核磁共振波谱(NMR)分析

取5mg的化合物纯品，用适量氘代甲醇(CD3OD)溶解，装入专用核磁管内测量。

1.3.3 抗氧化能力的测定

1.3.3.1 总抗氧化能力(T-AOC)的测定

按照南京建成生物工程研究所试剂盒方法测定。

1.3.3.2 超氧阴离子自由基清除能力的测定

按照南京建成生物工程研究所试剂盒方法测定。

2 结果与分析

2.1 结构鉴定

2.1.1 紫外光谱鉴定

图 2 化合物Ⅰ的紫外光谱图

Fig.2 Ultra-violet spectrometry of compound Ⅰ

由图2可知，化合物Ⅰ在甲醇中的吸收峰带Ⅱ在281nm波长处，带Ⅰ很弱，在328nm波长处，与黄酮类化合物甲醇溶液的UV光谱对照，确定化合物Ⅰ为二氢黄酮(醇)类。诊断剂AlCl3使带Ⅱ红移23nm，表明化合物Ⅰ为带有5-OH的二氢黄酮(醇)化合物，而带Ⅰ红移50nm，表明化合物Ⅰ分子结构中只有5-OH，无3-OH[13]，故可将二氢黄酮醇类排除。诊断剂AlCl3-HCl谱图与AlCl3谱图基本相同，表明化合物Ⅰ分子中无邻二酚羟基结构。

2.1.2 红外光谱鉴定

图 3 化合物Ⅰ的红外光谱图

Fig.3 FT-IR spectrum of compoundⅠ

由图3可知，3319.23cm-1处吸收峰为黄酮分子中－OH的伸缩振动峰，2925.53cm-1处吸收峰为芳香环的C－H
的伸缩振动峰，1639.22cm-1处吸收峰为C＝O的伸缩振动，1519.66、1577.51、1448.30cm-1处的吸收峰为苯环的特征吸收峰，1384.66、1268.95、1203.38、1176.38、1076.10cm-1处的吸收峰为C－O的伸缩振动峰，813.83cm-1处的吸收峰为＝C－H的面外变形振动峰[14-15]。

2.1.3 HPLC-MS分析

图 4 化合物Ⅰ的总离子流图(a)和高效液相色谱图(b)

Fig.4 Total ion chromatogram (a) and HPLC chromatogram (b) of compound Ⅰ

经ODS柱和Sephadex LH-20分离纯化得到的茶叶籽黄酮单体——化合物I经HPLC-MS检测纯度达98%(图4)。化合物I的ESI-MS图见图5，m/z 873.3为准分子离子峰[M-H]－，909.3为[M＋Cl]－峰，确定化合物Ⅰ的相对分子质量为874.3。继续对m/z 873.3离子进行二级质谱分析，碎片离子m/z 271.0[M-H-162-132-162-146]－为[M-H]－脱去4个糖配基的产物，m/z 753.1[M-H-120]－为[M-H]－通过RDA裂解反应脱去B环产生[16]，此碎片说明该分子母核B环上有－OH取代，另有m/z 150.8的碎片离子，这与柚皮素的裂解规律一致[17-18]，联系该物质的紫外吸收光谱，推测其可能为苷元为柚皮素的四糖苷。此外，在ESI-MS/MS
图谱中，碎片离子m/z 710.2[M-H-162]－为[M-H]－脱去一分子葡萄糖基的产物，碎片离子m/z 577.2[M-H-162-132-H]－为m/z 710.2脱去一分子吡喃木糖基的产物。结合文献[19]推测该物质为柚皮素-7-O-(β-D-吡喃木糖基(1→6))(β-D-葡萄糖基(1→3)-α-L-鼠李糖基(1→2)]-β-D-葡萄糖苷。

图 5 化合物Ⅰ的一、二级质谱图

Fig.5 ESI-MS and ESI-MS/MS spectra of compoundⅠ

2.1.4 核磁共振波谱分析

化合物Ⅰ的1H-NMR和13C-NMR数据见表1。化合物Ⅰ的1H-NMR谱图中显示有一组AA'BB'耦合体系：δH 7.36 (2H, d, J=8Hz, H-2’, 6’)和δH 6.85 (2H, d, J=6.8 Hz, H-3’, 5’)，
耦合常数8Hz左右是苯环上邻位氢原子的典型特征[20]，据此推测该化合物B环中有4个氢原子在邻位，可能有4’-OR取代。δH 6.20 (1H, s, H-6)和δH 6.26 (1H, s, H-8)，表示A环5、7取代。H-6和H-8的化学位移均向低场移动，可能是由于7-OH成苷。δH 5.42 (1H, dd, J=10, 0.8Hz, H-2)及δH 2.78(1H, dd, J=14.8, 7.6 Hz, H-3)、3.19 (1H, m, H-3) 3个氢原子均作为1个双二重峰出现，是一组ABX体系，为典型的二氢黄酮2、3位质子的共振峰[20]。δH 5.11 (1H, d, J=7.8Hz, H-1”)、 5.11 (1H, d, J=7.8Hz, H-1’’’)、5.30 (1H, d, J=3.6Hz, H-1””)、4.50 (1H, d, J=7.2Hz, H-1”)分别为4个糖配基上的端基质子，δH 3.13～4.23之间是的糖配基上氢原子的化学位移。在氢谱高场部分，还存在化学位移 δH 1.33 (3H, m, H-6””)一处信号，为鼠李糖上的甲基氢原子的共振吸收。

表 1 化合物Ⅰ的1H-NMR和13C-NMR化学位移δ

Table 1 1H-NMR and 13C-NMR spectra of compoundⅠ

化合物Ⅰ的13C-NMR谱图中显示该化合物分子中含有38个碳原子，化学位移δC 196.9为共轭羰基碳信号，结合δC 79.1(C-2)、42.4(C-3)为典型的二氢黄酮苷元碳信号，同时其他12个碳原子符合黄酮A、B环及5、7、4’-三氧取代的黄酮骨架，C-7的化学位移向高场移动，加上该化合物质谱的碎片离子m/z 271.0[M-H]－，推测该化合物的母体结构为柚皮素，且糖配基通过C-7与母核连接。高场区δC 16.6有一个甲基碳信号，结合化学位移δH 1.33 (3H, m, H-6””)，表明糖配基中有一个鼠李糖基。根据以上信息初步确定化合物为二氢黄酮类化合物。

HMBC谱显示C-7与葡萄糖-1的端基质子H-1”相关，可知糖基连在苷元的C-7位上，同时葡萄糖-1的端基质子H-1”的耦合常数为7.8Hz，表明其结合苷键为β型[21]。葡萄糖-1的C-6”与木糖端基质子H-1”’相关，可知木糖和葡萄糖-1之间以1→6相连接，同时木糖的端基质子H-1'''的耦合常数为7.2Hz，表明其结合苷键为β型。葡萄糖-1的C-2”与鼠李糖端基质子H-1””相关，可知鼠李糖和葡萄糖-1之间以1→2相连接，同时鼠李糖端基质子H-1””的耦合常数为3.6Hz，表明其结合苷键为α型。鼠李糖C-3””与葡萄糖-2的端基质子H-1””，可知葡萄糖-2和鼠李糖之间以1→3相连接，同时葡萄糖-2端基质子H-1””的耦合常数为7.2Hz，表明其结合苷键为β型。

综合分析化合物Ⅰ的紫外、红外、质谱、核磁图谱数据，以及与文献[19,22]报道的黄酮类化合物的核磁数据进行比对，确定化合物Ⅰ的结构为柚皮素-7-O-(β-D-吡喃木糖基(1→6))(β-D-葡萄糖基(1→3)-α-L-鼠李糖基(1→2))-β-D-葡萄糖苷，其化学结构如图6所示。

图 6 化合物Ⅰ的化学结构式

Fig. 6 Chemical structure of compoundⅠ

2.2 抗氧化能力的测定

2.2.1 总抗氧化能力(T-AOC)的测定结果

图 7 不同样品的总抗氧化能力

Fig.7 Total antioxidant capability of compound I, naringenin and naringin

总抗氧化能力是综合评价抗氧化能力的指标，它的优点是可以反映出生物体内酶促和非酶促两个体系的抗氧化能力，从总体上反映生物体防御体系的抗氧化能力的强弱[23]。

采用试剂盒测定总抗氧化能力，样品液的吸光度越大则表明其抗氧化活性越大。由图7可知，总抗氧化能力大小关系为柚皮素＞柚皮苷＞化合物Ⅰ。化合物Ⅰ、柚皮素和柚皮苷的总抗氧化能力都随着样品的质量浓度增加而升高，都表现出了一定的抗氧化能力。但在相同样品质量浓度下，柚皮素的总抗氧化能力均显著高于化合物Ⅰ和柚皮苷，而化合物Ⅰ总抗氧化能力最小且十分微弱。柚皮素的总抗氧化能力随浓度的增加而升高的幅度很大，而化合物Ⅰ和柚皮苷升高的幅度相对较小。

从总体上看，二氢黄酮苷元的的总抗氧化能力在相同质量浓度下显著高于二氢黄酮糖苷，且二糖苷的的总抗氧化能力高于四糖苷。

2.2.2 超氧阴离子自由基清除能力的测定结果

超氧阴离子自由基是最早生成的氧自由基，它本身不会造成生物体细胞和组织的氧化损伤，但当它与金属离子共存时，就会发生Fenton反应，产生羟自由基。因此，对超氧阴离子自由基的清除对有效地减少氧自由基的生成具有重要意义。

图 8 不同样品的超氧阴离子自由基清除能力

Fig.8 Superoxide anion radical scavenging activity of compound Ⅰ, naringenin and naringin

由图8可知，3种物质的超氧阴离子自由基清除能力大小关系为柚皮素＞柚皮苷＞化合物Ⅰ。化合物Ⅰ、柚皮素和柚皮苷对超氧阴离子自由基的清除率都随着样品的质量浓度增加而升高，都表现出了对超氧阴离子自由基清除效果。但在相同样品质量浓度条件下，柚皮素对超氧阴离子自由基的清除率均明显高于化合物Ⅰ和柚皮苷，而化合物Ⅰ和柚皮苷的清除率差别并不十分明显，柚皮苷比化合物Ⅰ的清除率略高一些。柚皮素的清除率在质量浓度达到50mg/mL时趋近于90%，而化合物Ⅰ和柚皮苷的清除率在质量浓度为50mg/mL均不足50%，远低于柚皮素。

从总体上看，二氢黄酮苷元对超氧阴离子自由基的清除率在相同质量浓度下高于二氢黄酮糖苷，且二糖苷的清除率略高于四糖苷。

3 讨 论

在本实验的几种方法中，3种黄酮类化合物在体外均有一定的抗氧化能力，且抗氧化能力与质量浓度有很好的量效关系。抗氧化活性关系为柚皮素＞柚皮苷＞化合物Ⅰ，即黄酮苷元的抗氧化活性大于黄酮糖苷，黄酮二糖苷的抗氧化活性大于黄酮四糖苷。

柚皮素、柚皮苷和化合物Ⅰ抗氧化活性的差异是由于它们分子结构上的不同造成的，3个物质A环7位碳上的取代基各不相同，分别为羟基、二糖配基、四糖配基。黄酮类化合物主要是通过分子中的酚羟基与自由基反应，因此结构中的羟基的数目、位置是影响黄酮类化合物抗氧化能力的关键因素。酚羟基数目越多，可提供的与活性自由基结合的氢原子越多，抗氧化能力越强[24-25]。有研究表明，7-OH可以螯合过渡金属离子，且有较强的酸性[26-27]，有利于抗氧活性，而7-OH被氧糖苷取代后将对其活性不利[28-29]。柚皮苷和化合物Ⅰ比柚皮素少一个活性部位
(7-OH)，表明7-OH是此类黄酮重要的活性位点，7位氧糖苷的形成对其活性不利[30]。大量研究表明，黄酮糖苷的体外抗氧化活性比其苷元低[31-32]。糖苷中的糖基除了取代苷元原有的羟基减少了一个活性部位，降低了分子供氢能力，还造成了空间位阻，阻碍4位羰基和5位羟基的相互作用[33]。而4位羰基和5位羟基是螯合过渡金属离子的重要位点[34]。羟基成苷后，原来的分子失去了络合过渡金属离子的能力，使一些需要金属离子催化的过氧化链式反应得以顺利，造成抗氧化活性的降低。另外，同甲基化一样，氧糖苷的形成改变分子的平面结构和亲脂性，对其活性也有不利影响[35-36]。

蒋柳云等[37]报道从茶叶里提取的黄酮苷活性随着糖基中糖的增多而减小。这也与本研究结果相吻合。这是由于随着糖基的增大，空间位阻影响进一步增大，亲水性更强而亲脂性更差，所以化合物Ⅰ抗氧化活性弱于柚皮苷。根据以上结果和理论可知，在柚皮素的同系物中，7-OH是重要的活性位点，7位氧糖苷不利于其抗氧化活性，且抗氧化活性随糖基的增大而减小。

4 结 论

本研究采用通过大孔吸附树脂HPD826、ODS柱和Sephadex LH-20分离纯化得到高纯度的茶叶籽黄酮单体，通过UV、IR、MS、NMR等方法鉴定其分子结构为柚皮素-7-O-(β-D-吡喃木糖基(1→6))(β-D-葡萄糖基(1→3)-α-L-鼠李糖基(1→2))-β-D-葡萄糖苷。对化合物Ⅰ及其同系物柚皮素和柚皮苷的抗氧化活性进行了对比研究。结果表明，化合物Ⅰ在体外有一定的抗氧化能力，3种物质的抗氧化活性关系为柚皮素＞柚皮苷＞化合物Ⅰ，即黄酮苷元的抗氧化活性大于黄酮糖苷，黄酮二糖苷的抗氧化活性大于黄酮四糖苷。在柚皮素的同系物中，7位羟基糖苷化不利于其抗氧化活性，且抗氧化活性随糖基的增大而减小。

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