液相色谱串联质谱法测定水产品中苯甲酸雌二醇的残留

张珊珊1,2,于慧娟2,*,惠芸华2,冯 兵2,张晓玲2

(1.上海海洋大学食品学院,上海 201306;

2.中国水产科学研究院东海水产研究所,水产品质量安全加工实验室,上海 200090)

 

要:通过对前处理以及仪器方法的研究和优化,建立水产品中苯甲酸雌二醇残留的液相色谱串联质谱检测方法。样品经甲基叔丁基醚提取,LC-C18固相萃取小柱净化,甲醇-水溶液定容后离心去脂。采用甲醇-水为流动相,经
Waters XBridge RP-18色谱柱(150mm×4.6mm,5µm)分离后,电喷雾串联质谱测定,以甲羟孕酮-D3为内标进行定量。在标准添加水平1~10µg/kg范围内,加标回收率为77.9%~113.5%,相对标准偏差不超过9.4%,定量限为1µg/kg。该方法灵敏度高,重复性好,适用于各种水产品中苯甲酸雌二醇残留量的测定。

关键词:苯甲酸雌二醇;水产品;酶解;液相色谱串联质谱

 

Determination of Estradiol Benzoate Residues in Aquatic Products by LC-MS-MS

 

ZHANG Shan-shan1,2,YU Hui-juan2,*,HUI Yun-hua2,FENG Bing2,ZHANG Xiao-ling2

(1. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China;

2. Laboratory of Aquatic Products Quality Safety and Processing, East China Sea Fisheries Research Institute,
Chinese Academy of Fishery Sciences, Shanghai 200090, China)

 

Abstract:A high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric (LC-MS-MS) method has been established for the determination of estradiol benzoate residues in aquatic products. Sample pretreatment conditions and instrumental parameters were optimized. Samples were extracted with methyl tert-butyl ether, cleaned up on an LC-C18 solid phase extraction column and degreased with methanol-water. Separation of the analyte was carried out on Waters XBridge RP-18 column (150 mm × 4.6 mm i.d., 5 µm) using a mobile phase made up of methanol and water before analysis by electrospray ionization LC-MS-MS using medroxyprogesterone-D3 as internal standard. The limit of quantification of this method was 1 µg/kg. The average recovery from samples spiked in the range of 1 to 10 µg/kg was 77.9%–113.5%, with RSD less than 9.4%. This method was sensitive, reproducible, and suitable for the determination of estradiol benzoate in various aquatic products.

Key words:estradiol benzoate;aquatic products;enzymatic hydrolysis;high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS-MS)

中图分类号:TS254.7 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2013)22-0208-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201322042

苯甲酸雌二醇即雌二醇苯甲酸酯(结构见图1),是一种人工合成的雌激素,因其有促进动物生长,提高饲料转化率,诱导产生单一性别鱼苗等作用,而被用于水产养殖[1-2]。苯甲酸雌二醇进入生物体后会随食物链进入人体,造成人体内分泌紊乱,甚至有致癌危险[1]。因此,欧盟自1988年就将此类性激素列为禁用药物,农业部在2002年的235号公告中也规定苯甲酸雌二醇在动物源性食品中不得检出。但是,目前关于苯甲酸雌二醇的研究及报道极少[1,3],在水产品中残留方面的研究还属空白。由于苯甲酸雌二醇难挥发,使用气相色谱-质谱法测定时需要进行衍生化,操作复杂[4],因此本实验采用液相色谱-质谱法对其进行研究,并建立水产品中苯甲酸雌二醇残留检测方法,为实现水产品中苯甲酸雌二醇残留监控,保障水产品的质量安全提供技术支撑。

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图 1 苯甲酸雌二醇(A)与甲羟孕酮(B)的结构式

Fig.1 Chemical structures of estradiol benzoate (A) and medroxyprogesterone (B)

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鱼、虾和蟹均购为上海市购,当天运回实验室,取其肌肉部分,均质混匀,放于-20℃冰箱中待测。

苯甲酸雌二醇(纯度大于97%)、雌二醇(纯度大于96.8%)、雌二醇-13C2(纯度大于97%)、甲羟孕酮-D3(纯度大于97%) 德国Dr.Ehrenstorfer公司,上述样品均采用甲醇配成100µg/mL的标准储备液,于-20℃保存。临用前标样用甲醇稀释成质量浓度为100ng/mL的标准工作液;甲羟孕酮-D3则配制成1µg/mL的内标工作液。β-葡萄糖醛酸酶/芳香基硫酸酯酶(4.5U/mL β-葡萄糖醛酸酶、14U/mL芳香基硫酸酯酶) 瑞士Roche公司;甲醇、乙酸乙酯、正己烷(均为色谱级) 美国 J.T.Baker公司;叔丁基甲基醚(色谱级) 韩国 Duksan公司;超纯水由Mili-Q 纯水仪制备。

1.2 仪器与设备

Thermo TSQ Quantum ULtra高效液相色谱串联质谱仪(配有电喷雾离子源(ESI)及Xcalibur1.2数据处理系统) 美国赛默飞世尔科技有限公司;Mili-Q 纯水仪 法国Millipore公司;RE-52A旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;CF16RXⅡ型离心机 日本Hitachi 公司;Vortex Genius 3型涡旋混合器 德国IKA公司;B-5510E型超声仪 美国Branson公司;LC-18固相萃取柱(500mg,3mL) 美国Supelco公司。

1.3 样品前处理

1.3.1 提取

将样品室温解冻,取(5.0±0.02)g于30mL离心管中,准确加入25μL内标工作液(若测定加标回收率,则同时加入一定量的标准溶液),加入10mL甲基叔丁基醚,涡旋混匀,超声提取5min,振荡提取2min,8000r/min离心8min,将上清液转移至100mL鸡心瓶中。重复提取1次,合并上清液,于28℃旋转蒸至无试剂残留,10mL正己烷溶解备用。

1.3.2 净化

用5mL甲醇活化LC-C18小柱,吹干后用5mL正己烷置换;取备用液上样,控制流速不超过1滴/s;10mL正己烷淋洗小柱,吹干;10mL甲醇洗脱,收集洗脱液于鸡心瓶中,35℃旋转蒸发至干。准确加入0.85mL甲醇溶解残渣,涡旋混匀30s;再准确加入0.15mL水,超声混匀30s,将溶液取至10mL塑料离心管中,5℃、8000r/min离心6min,经0.22μm滤膜过滤,上机测定。

1.3.3 基质标准液的配制

分别准确称取(5.0±0.02)g经测定为阴性样品,分别加入20、50、100、250、500μL及1000μL的标准工作液(100ng/mL),25μL内标工作液(1μg/mL),混匀后按1.3.1节和1.3.2节方法处理,得基质标准工作液。

1.4 色谱条件

1.4.1 液相色谱条件

色谱柱:Waters XBridge RP-18色谱柱(150mm×4.6mm,5µm);流动相:甲醇(A),水(B);梯度洗脱条件:0.00~10.00min,85% A;10.10~16.00min,95% A;16.10~20.00min,85% A。流速:0.4mL/min;进样量:20µL;柱温:25℃。

1.4.2 质谱条件

电喷雾离子源(electrospray ionization,ESI);正离子扫描方式;喷雾电压 3000V,离子传输管温度 350℃;鞘气流速13.3L/min;辅助气流速3.3L/min;多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM);碎片离子及碰撞能量见表1。

表 1 苯甲酸雌二醇和甲羟孕酮-D3的碎片离子及碰撞能量

Table 1 Fragment ions and collision energy of estradiol benzoate and medroxyprogesterone-D3

化合物

采集模式

母离子(m/z)

子离子(m/z)

碰撞能量/eV

苯甲酸雌二醇

ESI+

377.2

105.1*/135.1

28/10

甲羟孕酮-D3

ESI+

348.2

126.2

27

 

注:*.定量离子。

 

2 结果与分析

2.1 方法线性关系与检测限

按1.3节方法制备苯甲酸雌二醇的基质标准溶液并上机测定,绘制标准曲线。在2~100ng的加标范围内,曲线线性良好,标准回归方程为Y =0.000319146X-0.00130536,线性相关系数为0.9996。以信噪比(RSN)大于3,确定方法检测限为0.5μg/kg;以RSN大于10,回收率在75%~120%以内,确定方法定量限为1μg/kg。

2.2 回收率与精密度

为评价方法的有效性,选择草鱼、南美白对虾和梭子蟹为水产品代表品种,进行标准添加实验,加标水平分别为1、2µg/kg和10µg/kg,每个加标水平做5个平行,按照1.3节和1.4节方法进行处理和分析,加标回收率及精密度测定结果见表2。标准溶液及草鱼加标样品中苯甲酸雌二醇及甲羟孕酮-D3的特征离子质量色谱图见图2。

表 2 水产品中苯甲酸雌二醇的加标回收率与精密度(n=5)

Table 2 Recoveries and precision (RSD) of estradiol benzoate in aquatic products (n = 5)

样品

加标水平/(μg/kg)

回收率/%

平均回收率/%

相对标准偏差/%

草鱼

1

85.1/77.9/86.6/85.9/98.5

86.8

8.5

2

103.1/99.6/89.3/112.5/111.6

103.2

9.2

10

89.5/108.1/112.9/109.6/113.5

106.7

9.3

 

 

 

 

 

南美白
对虾

1

79.8/86.5/90.3/86.7/88.9

86.4

5.2

2

90.1/108.7/105.2/113.4/106.9

104.9

8.4

10

99.3/85.4/93.2/105.7/106.8

98.08

9.1

 

 

 

 

 

梭子蟹

1

99.6/106.3/111.3/112.5/88.9

103.7

9.4

2

99.8/89.2/86.3/85.4/87.2

89.6

6.6

10

88.2/79.6/85.9/96.2/78.9

85.8

8.2

 

 

由表2可以看出,在不同的水产品品种和不同的加标水平下,苯甲酸雌二醇的回收率为77.9%~113.5%,相对标准偏差为5.2%~9.4%,该方法灵敏度、准确度及精密度满足国家对禁用药物残留检测的要求。

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1.苯甲酸雌二醇;2.甲羟孕酮-D3

图 2 标准溶液(A)及草鱼添加样品(B)中苯甲酸雌二醇及甲羟孕酮-D3的特征离子质量色谱图

Fig.2 Characteristic ion chromatograms of estradiol benzoate and medroxyprogesterone-D3 in standard solution (A) and spiked grass carp (B)

2.3 实验条件的优化

2.3.1 酶解有效性探讨

据文献[5-13]报道,性激素在生物体中以结合态和游离态两种形式存在,在肝、肾等组织中结合态含量较高,而在肌肉中游离态含量较高。有研究表明,肌肉中可检测到结合态的17β-雌二醇为3%~5%[13],结合态孕酮小于5%[13],结合态睾酮小于20%[15],所以有部分研究认为在测定肌肉样品中的性激素时未采用酶解[16-20];但为使动物源性食品中性激素测定结果更加准确,目前部分研究者[5-13]采用酶解的方法进行样品前处理,以期通过酶解的方式将结合态的性激素转化为游离态,达到测定性激素总量的目的。但并未有研究表明酶解过程中性激素有分解或转化的现象。常用的酶解的条件为:一定量样品加入10mL乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.2),涡旋混匀后,加入100µL的β-葡萄糖醛酸酶/芳香基硫酸酯酶,于37℃条件下振荡酶解12h或16h。

苯甲酸雌二醇又称雌二醇苯甲酸酯,分子结构中具有酯基,从理论上分析,酯在酸性或碱性条件可能会发生水解,生成雌二醇。为证实该推测是否成立,评价目前的酶解处理方式是否适合于水产品中苯甲酸雌二醇残留量的测定,本实验室采用标准添加法进行了酶解实验。

实验共分两组进行,每组各作3个平行:样品为草鱼和南美白对虾,样品取样量为(5.0±0.02)g。A组(酶解):分别加入100ng苯甲酸雌二醇、25ng甲羟孕酮-D3及10mL乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.2),涡旋混匀后,加入100µL的β-葡萄糖醛酸酶/芳香基硫酸酯酶,于37℃条件下振荡酶解12h后取出,恢复室温后按1.3节和1.4节方法进行处理和分析;B组(未参与酶解):分别加入100ng苯甲酸雌二醇及25ng甲羟孕酮-D3,按1.3节和1.4节方法进行处理和分析。

实验结果发现:A组样品中苯甲酸雌二醇的测定值明显低于B组样品,在草鱼和南美白对虾样品中A组苯甲酸雌二醇的平均测定值分别约为B组的45%和15%。为查明A组样品苯甲酸雌二醇测定结果较低的原因,分别对A组样品和B组样品进行了正负离子模式的一级全扫描,发现在负离子模式全扫描下A组样品中有m/z 271.2的化合物出现,而B组样品中没有该化合物。由于雌二醇的相对分子质量为272.3,在负离子模式母离子质荷比与其基本一致,后用标准品经二级质谱确认,证实该化合物为雌二醇。此研究证实了酶解处理会导致苯甲酸雌二醇发生水解的猜测,并且发现损失量很大,即使采用标准参与样品前处理的方法也难于校正。另外,目前还不清楚苯甲酸雌二醇在肌肉组织中是否存在结合态,因此,本方法在测定水产品中苯甲酸雌二醇残留时不经酶解处理,而采用直接用有机溶剂提取,固相萃取柱净化的方法。A组和B组样品的二级质谱总离子流图见图3,从图3A和图3B的对比可以明显看出苯甲酸雌二醇在酶解过程中部分水解转化为雌二醇,但雌二醇在甲醇-水流动相下离子化效率较低,所以峰面积与苯甲酸雌二醇损失相比相对较小。

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图 3 酶解(A)与未参与酶解(B)南美白对虾样品的二级质谱总离子流图

Fig.3 MS-MS Total ion chromatogram of whiteleg shrimp with (A) and without (B) enzymatic hydrolysis

2.3.2 提取剂的选择

考虑到苯甲酸雌二醇极性较低,本实验分别用甲基叔丁基醚、乙酸乙酯作提取剂,对阴性草鱼、梭子蟹进行标准添加实验。结果表明:两种提取方式都能将苯甲酸雌二醇从基质中提取出来,且提取效率均较高。但使用乙酸乙酯作提取剂时,对大黄鱼、鳗鲡及蟹等油脂丰富的样品来说,乙酸乙酯易包裹在油里,难以完全去除。而油中残留的乙酸乙酯将会影响苯甲酸雌二醇在C18固相萃取柱上的吸附效率,导致苯甲酸雌二醇在C18柱上的回收率不稳定,时高时低。因此,本研究采用甲基叔丁基醚作提取剂。

2.3.3 色谱柱的选择

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1.基质空白溶液;2.草鱼加标样品。

图 4 苯甲酸雌二醇在柱长为150mm(A)及250mm(B)的
Extend-C18色谱柱上的分离情况

Fig.4 Separation of estradiol benzoate on Extend-C18 columns 150 mm (A)and 250 mm (B) long

本实验最初选用Agilent ZORBAX Extend-C18色谱柱(150mm×4.6mm,5µm)进行分离,研究发现,草鱼、鲫鱼、大黄鱼及南美白对虾等诸多样品分析时苯甲酸雌二醇后均有一强干扰峰,如图4A所示,该色谱柱无法将两者完全分离,通过改变前处理方式也无法降低或消除干扰。考虑到增加柱子的有效长度可以使分离更彻底,本实验改用Agilent Extend-C18色谱柱(250mm×4.6mm,5µm)进行分析,从图4B可以看出,柱的长度增加导致出峰时间变长,但分离效果无明显改善,仍无法将苯甲酸雌二醇和杂质峰完全分离。本研究在连续尝试了一系列性质不同的柱子后,发现使用Waters XBridge RP-18色谱柱(150mm×4.6mm,5µm)时,苯甲酸雌二醇和杂质峰的出峰时间发生改变,干扰峰出峰时间提前,与苯甲酸雌二醇完全分离(图2)。因此,本研究选用XBridge RP-18色谱柱来完成苯甲酸雌二醇的分离。

3 结 论

本实验通过对前处理条件以及仪器方法的研究,建立水产品中苯甲酸雌二醇的检测方法,其灵敏度、准确度及精密度都满足国家对禁用药物的要求。由于苯甲酸雌二醇在酶解过程中有水解转化现象,因此,建议在对含有酯基的性激素如戊酸雌二醇酯、苯丙酸诺龙、丙酸睾酮等进行残留研究时,若要采用酶解条件处理,应对酶解的有效性进行考察,以防引起新的测定结果偏差。

参考文献:

[1] HOOIJERINK H, LOMMEN A, MULDER P P J, et al. Liquid chromatography-electrospray ionisation-mass spectrometry based method for the determination of estradiol benzoate in hair of cattle[J]. Analytica Chimica Acta, 2005, 529(1/2): 167-172.

[2] 杨永铨, 张中英, 林克宏, 等. 莫桑比克罗非鱼性别生理遗传控制的初步研究[J]. 遗传学报, 1979, 6(3): 305-310.

[3] 王全林, 张爱芝, 陈立仁. 超高效液相色谱-串联质谱法对奶制品中苯甲酸雌二醇残留的测定[J]. 分析测试学报, 2009, 28(9): 1069-1073.

[4] DUFFY E, RAMBAUD L, BIZEC B L, et al. Determination of hormonal growth promoters in bovine hair: comparison of liquid chromatography-mass spectrometry and gas chromatography-mass spectrometry methods for estradiol benzoate and nortestosterone decanoate[J]. Analytica Chimica Acta, 2009, 637(1/2): 165-172.

[5] YANG Yi, SHAO Bing, ZHANG Jing, et al. Determination of the residues of 50 anabolic hormones in muscle, milk and liver by very-high-pressure liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography B, 2009, 877(5/6): 489-496.

[6] 邹龙. 气相色谱质谱联用技术对水产品中激素多残留检测的研究[D]. 青岛: 中国海洋大学, 2008.

[7] 张爱芝, 王全林, 沈坚, 等. 超高效液相色谱-串联质谱法同时测定鱼制品中残留的7种性激素[J]. 色谱, 2010, 28(2): 190-196.

[8] 湛嘉, 俞雪钧, 李佐卿, 等. 黄鳝肌肉中11种性激素的气质联用检测方法[J]. 分析测试学报, 2007, 26(5): 642-646.

[9] 孙汉文, 康占省, 李挥. 凝胶渗透色谱.固相萃取净化-超快速液相色谱-串联质谱法检测牛肉中9种类固醇激素残留[J]. 分析化学研究报告, 2010, 38(9): 1272-1276.

[10] BLASCO C, POUCKE C V, PETEGHEM C V. Analysis of meat samples for anabolic steroids residues by liquid chromatography/tandem mass spectrometry[J]. Journal Chromatography A, 2007, 1154(1/2): 230-239.

[11] SANGIORGI E, CURATOLO M, ASSINI W, et al. Apllication of neutral loss mode in liquid chromatography-mass spectrometry for the determination of corticosteroids in bovine urine[J]. Analytica Chimica Acta, 2003, 483(1/2): 73-86.

[12] SHAO Bing, ZHAO Rong, MENG Juan, et al. Simultaneous determination of residual hormonal chemicals in meat, kidney, liver tissues and milk by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Analytica Chimica Acta, 2005, 548(1/2): 41-50.

[13] DUNN T G, KALTENBACH C C, KORITNIK D R, et al. Metabolites of estradiol-17β and estradiol-17β-3-benzoate in bovine tissues[J]. Journal of Animal Science, 1977, 45(3): 659-673.

[14] ESTERGREEN V L, LIN M T, MARTIN E L, et al. Distribution of progesterone and its metabolites in cattle tissues following administration of progesterone-4-14C1,2,3,4[J]. Journal of Animal Science, 1977, 45(3): 642-651.

[15] HOFFMANN B, RATTENBERGER E. Testosterone concentrations in tissue from veal calves, bulls and heifers and in milk-samples[J]. Journal of Animal Science, 1977, 45(3): 635-641.

[16] VANHAECKE L, BUSSCHE V J, WILLE K, et al. Ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry in high-throughput con?rmation and quanti?cation of 34 anabolic steroids in bovine muscle[J]. Analytica Chimica Acta, 2011, 700(1/2): 70-77.

[17] 赖世云, 陶保华, 傅士姗, 等. 液相色谱-质谱联用测定乳及乳制品中 29 种性激素[J]. 分析化学研究报告, 2012, 40(1): 135-139.

[18] ZENG Dongping, LIN Cuiping, ZENG Zheling, et al. Multi-residue determination of eight anabolic steroids by GC-MS in muscle tissues from pigs[J]. Agricultural Sciences in China, 2010, 9(2): 306-312.

[19] 陈慧华, 应永飞, 吴平谷, 等. 液相色谱-串联质谱同时测定动物组织中22种同化激素[J]. 分析化学研究报告, 2009, 37(2): 181-186.

[20] KOOTSTRA P R, ZOONTJES P W, TRICHT E F, et al. Multi-residue screening of a minimum package of anabolic steroids in urine with GC-MS[J]. Analytica Chimica Acta, 2007, 586(1/2): 82-92.

 

收稿日期:2013-06-30

基金项目:农业部行业标准制定项目(农财发[2012 56号]-337)

作者简介:张珊珊(1989—),女,硕士研究生,研究方向为水产品质量安全。E-mail:zhangss1213@126.com

*通信作者:于慧娟(1960—),女,研究员,硕士,研究方向为水产品质量安全。E-mail:yuhuijuan607@ sohu.com