粗壮脉纹胞菌复合多菌种发酵茶粕
产纤维素酶的研究

刘沛毅，邓泽元，杨建远，李 静*

（南昌大学高等研究院，食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047）

摘 要：用粗壮脉纹胞菌分别复合东方伊莎酵母、里氏木霉、绿色木霉、乳酸杆菌固态发酵已去除茶皂素的茶粕，通过测定发酵产物中3种纤维素酶：外切葡聚糖酶（C1）、内切葡聚糖酶（Cx）、β-葡萄糖苷酶（β-G）及总酶滤纸酶（filter paper activity，FPA）的酶活力来探讨其分解粗纤维素的协同作用。粗壮脉纹胞菌和绿色木霉混合发酵产生的C1酶酶活力较粗壮脉纹胞菌单菌发酵提高了51.09%，粗壮脉纹胞菌和绿色木霉复合发酵较单菌发酵延长了其纤维素酶分泌的周期，96h时FPA酶活力达到2.782U/g；粗壮脉纹胞菌复合里氏木霉、绿色木霉混合发酵组在发酵10d后对茶粕粗纤维的最终降解率分别达到了64.19%和61.59%；接种量对单菌和混合菌发酵产纤维素酶影响总体趋势是随着接种量增加酶活力提高，但粗壮脉纹胞菌单菌发酵纤维素酶酶活力在接种量超过9mL/100g后开始下降。表明粗壮脉纹胞菌复合里氏木霉、绿色木霉混合发酵降解纤维素具有协同作用。

关键词：粗壮脉纹胞菌；纤维素酶；混合菌发酵；固态发酵；茶粕

Cellulase Production from Tea Seed (Camellia oleifera) Cake Using Neurospora crassa Mixed with Other Bacteria

LIU Pei-yi, DENG Ze-yuan, YANG Jian-yuan, LI Jing*

(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Institute for Advanced Studies, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Abstract: The production of cellulaes from tea seed (Camellia oleifera) cake with a minimized content of residual tea saponin of 0.917% as obtained by ultrasonic extraction method was studied in solid-state fermentation by mixed strains of Neurospora crassa with Issatchenkia oriental, Trichoderma reesei, Trichoderma vivide or L. plantarum. The activities of cellobiohydrolase 1 (C1), β-1,4-endoglucanase (Cx) and β-glucosidase (β-G) and filter paper activity (FPA) in fermentation supernatants were determined to explore their synergistic action on enzymatic hydrolysis of cellulose. The enzyme activity of C1 from Neurospora crassa combined with Trichoderma vivide was increased by 51.09% compared with that obtained from single-strain fermentation by Neurospora crassa; meanwhile, the combination of both strains resulted in prolonged secretion of cellulases, and the FPA activity reached 2.782 U/g after 96 h. The cellulose was degraded by 64.19% and 61.59% in tea seed cake fermented for 10 days by Neurospora crassa mixed with Trichoderma reesei and Trichoderma vivide, respectively. The overall tendency of the enzyme activities was an increase with increasing the inoculum size irrespective of fermentation with Neurospora crassa alone or combined with other strains. However, the cellulase activities were declined at higher inoculum sizes surpassing 9 mL/100 g of Neurospora crassa when inoculated alone. These results indicate that Neurospora crassa is able to cooperate with Trichoderma reesei and Trichoderma vivide respectively to degrade cellulose.

Key words: Neurospora crassa; cellulases; mixed-bacteria fermentation; solid-state fermentation; tea seed

中图分类号：TS209 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2014)01-0174-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201401034

近年来，随着我国农业产业的快速发展，大量的各类农产品加工废弃物堆积，如何高效利用农副产品成为研究热点。茶粕是油茶籽经过压榨提取茶油后剩下的残渣，约为油茶籽质量的65%，是茶油生产过程中的一种营养价值较高的榨油工业副产品。我国年产茶油约15万t，茶籽粕约50万t[1]。由于茶粕含较高浓度的茶皂素、味苦，所以基本上用于水产养殖业的清塘剂和肥料，没有高值化利用，造成了很大的资源浪费。由于茶皂素具有较大的抑菌作用[2-3]，若利用微生物对茶粕进行发酵，须先将茶粕中的抑菌性物质茶皂素去除。因此，本实验采用实验室超声波提取茶皂素专利技术将茶粕中的茶皂素去除；提取茶皂素后的茶粕，可溶性糖、蛋白质和矿物元素含量都较丰富[4]，可作为动物饲料或食品的良好原料，但其含较高的纤维素，通过高产纤维素酶的微生物生长，降解纤维素，可大大提高其利用价值。

降解纤维素需要3种酶如内切、外切和/或β-糖苷酶的密切配合。自然界很难通过一种菌将纤维素彻底降解为纤维二糖或单糖，因此常采用产不同纤维素酶的复合菌进行降解。混合菌固体发酵产纤维素酶在菌株的选择上，通常采用的是真菌，包括部分腐生菌、反刍动物瘤胃菌、青霉属等，例如，当曲霉和酵母进行联合发酵时，曲霉属菌株常选用木霉，酵母则可用产朊假丝酵母[5]。本课题组筛选的粗壮脉纹胞菌（Neurospora crassa）所产内切葡聚糖酶活性较高[6]，绿色木霉、里氏木霉产外切葡聚糖酶酶活力较高，在发酵产纤维素酶酶系上可以互补，使所产纤维素酶体系较全面，且它们均为丝状真菌，适合固态发酵[7-8]。乳酸杆菌可以利用上述菌分解的低聚糖或纤维二糖，而产生有益动物健康的变化[9]，酵母菌与产纤维素酶菌多是共生和互生关系[10]。此外，有报道称固态发酵农副产品产纤维素酶的效果要优于液体发酵，所产酶系也较液体发酵更全面，固态发酵更适合产纤维素酶的丝状真菌的生长[11]。因此，本研究试图通过发酵过程中各纤维素酶活性的变化、发酵前后各粗纤维素组分的变化，筛选能与粗壮脉纹胞菌复合共生或协同作用的多种菌种，以降解茶粕中的纤维素来提高其利用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与菌种

茶粕由江西省绿源油脂有限公司提供，原料粉碎过40目筛。

粗壮脉纹胞菌（Neurospora crassa）、东方伊莎酵母菌（Issatchenkia oriental）、乳酸杆菌（NCU116）和绿色木霉（Trichoderma vivide） 本实验室筛选并保藏；里氏木霉（CICC 13052） 国家工业微生物菌种保藏中心。

1.2 培养基

1.2.1 液体种子培养基

东方伊莎酵母培养基：酵母浸粉0.5g/L、葡萄糖2g/L、蛋白胨1g/L。

绿色木霉培养基：羧甲基纤维素钠7.5g/L、蛋白胨5g/L、CaCl2 0.3g/L、KH2PO4 4g/L、MgSO4 0.3g/L，pH 值自然。

里氏木霉培养基：可溶性淀粉10g/L、葡萄糖10g/L、蛋白胨10g/L、(NH4)2SO4 2g/L、KH2PO4 3g/L、MgSO4 5g/L、CaCO3 5g/L。

MRS培养基，用于乳酸杆菌培养。

Mandel Weber营养液[13]：（NH4）2SO4 1.4g/L、KH2PO4 2.0g/L、CaCl2•2H2O 0.3g/L、MgSO4•7H2O 0.3g/L、FeSO4•7H2O 5.0mg/L、MnSO4•H2O 1.6mg/L、ZnSO4 1.4mg/L、CoCl2•6H2O 2.0mg/L、蛋白胨0.1g/L、吐温-80 0.1g/L。

1.2.2 固体种子培养基

取10g纯豆渣，25mL无菌水，用于粗壮脉纹胞菌培养。

1.3 试剂与仪器

微晶纤维素、纤维二糖 美国Aladdin公司；羧甲基纤维素钠 广东西陇化工有限公司。

DFT-200粉碎机 温岭市大德中药机械有限公司；KL-UP-III-10超纯水制备机 台湾艾柯（成都）实验专业纯水设备厂；HG101-5型电热鼓风干燥箱 南京实验仪器厂；RE52-99型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；紫外-可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；DSX-280B型不锈钢手提式灭菌器 上海申安医疗器械厂；HD-650桌上型超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；HWS-150型恒温恒湿培养箱 上海精宏实验设备有限公司；PHS-2酸度计 上海雷磁仪器厂；15R型高速冷冻离心机 江西省立康科技公司；SJC-Ⅱ多功能溢流循环超声波生物萃取仪 无锡市上佳生物科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 茶粕中茶皂素残留率的测定

采用本课题组超声波提取茶皂素专利技术（公开号CN101289473A），采用香草醛硫酸法[12]对提取茶皂素后的茶粕进行残留茶皂素量的测定，计算出其茶皂素残留率。

1.4.2 种子培养

分别取100mL上述液体种子培养基置于250mL锥形瓶中，将经活化的绿色木霉、里氏木霉和东方伊莎酵母分别接种至锥形瓶中，28℃恒温振荡（180r/min）培养，绿色木霉和里氏木霉培养时间为48h，酵母菌培养时间为24h，乳酸杆菌于28℃恒温培养箱中静置培养24h；取10g豆渣置于250mL的发酵瓶中，接种粗壮脉纹胞菌，加入25mL无菌水，30℃恒温培养箱中培养72h，取孢子配成约1×108CFU/mL的孢子悬浮液，备用。

1.4.3 混合菌固态发酵产纤维素酶

将10g经过预处理的茶粕置于250mL发酵瓶中，加入9mL Mandel Weber营养液，保持总接种量10mL/100g，粗壮脉纹胞菌与各菌种接种量体积之比均为2∶1，30℃恒温培养，控制相对湿度70%，研究不同发酵时间48、60、72、84、96h对各种纤维素酶酶活性的影响。此外选择发酵96h，改变菌种接种量，研究当粗壮脉纹胞菌和复合菌接种量为3、6、9、12mL/100g时对各种纤维素酶酶活性的影响。

1.4.4 粗酶液的提取

称取发酵培养物1g，加入0.1mol/L HAc-NaAc（pH 5.2）
缓冲液20mL，加入玻璃珠，30℃摇床上振荡提取1h。4℃离心，取上清液（即为粗酶液），备用。

1.4.5 纤维素酶的测定[14-15]

还原糖标准曲线：取0.125g葡萄糖溶于250mL蒸馏水中，配成0.5g/L的葡萄糖溶液，再分别取0、5、10、15、20、25mL 0.5g/L葡萄糖溶液于25mL的容量瓶，定容后各取1mL，加2.5mL 3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）试剂，5min沸水浴后立即流水冷却，加水至5mL，于550nm波长处测定吸光度。

1.4.5.1 滤纸酶（filter paper activity，FPA）酶活力

向试管中各加入1cm×6cm的Whatman No.1定性滤纸，2mL酶液在50℃水浴中保温30min，取出后立即加入2.5mL DNS试剂终止反应。加热、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液定容5mL，在550nm波长处测定吸光度。

1.4.5.2 外切葡聚糖酶（C1）酶活力

取0.5mL粗酶液，加入10mg微晶纤维素，50℃水浴中反应30min后，加入2.5mL DNS沸水浴5min终止反应，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液定容5.0mL，在550nm波长处测定吸光度。

1.4.5.3 内切葡聚糖酶（Cx）酶活力

取0.5mL粗酶液，加入1.5mL 1g/100mL羧甲基纤维素钠盐溶液，50℃水浴中反应30min后，加入2.5mL DNS沸水浴5min终止反应，如上法测定吸光度。

1.4.5.4 β-葡萄糖苷酶（β-G）酶活力

取0.5mL适当稀释的粗酶液，加入1.0mL 15.0mmol/L纤维二糖溶液，50℃水浴中反应30min后，加入2.5mL DNS沸水浴5min终止反应。如上法测定吸光度。

上述4种酶的酶活力单位定义：在50℃、pH5.2，恒温30min的条件下，以反应中1min水解底物形成1μmol葡萄糖的酶量为一个酶活力单位，换算成每克干物料含有的酶活力，用U/g表示[16]。

1.4.6 粗纤维素组分的测定

将10g经过预处理的茶粕置于250mL发酵瓶中，加入9mL Mandel Weber营养液，保持总接种量10mL/100g，各菌种与粗壮脉纹胞菌接种体积比均为2∶1，在经过96h发酵后，用Soest法[17]测定各实验组及原料中各粗纤维组分的含量，探寻纤维素酶酶活力与不同种类纤维素降解的关联。

1.4.7 原料与发酵产物中粗纤维含量的测定

将10g经过预处理的茶粕置于250mL发酵瓶中，加入9mL Mandel Weber营养液，保持总接种量10mL/100g，各菌种与粗壮脉纹胞菌接种体积比均为2∶1，在经过10d发酵后，测定各组复合菌培养基中粗纤维含量（GB/T 6434—2006《饲料中粗纤维测定方法》），以期得到对茶粕纤维素降解效果最佳的复合菌搭配。

1.4.8 验证实验

为了证实乳酸杆菌和酵母菌对粗壮脉纹胞菌产纤维素酶的影响是由其次级代谢产物造成的，本研究设计以下验证实验。

1.4.8.1 乳酸杆菌复合厌氧实验

将10g经过预处理的茶粕置于250mL发酵瓶中，加入9mL Mandel Weber营养液，接种6mL/100g的粗壮脉纹胞菌，发酵72h后接种3mL/100g，经过28℃恒温培养72h的乳酸杆菌，放置无氧环境中继续培养24h，测定各纤维素酶酶活力。

1.4.8.2 酵母菌复合实验

将10g经过预处理的茶粕置于250mL发酵瓶中，加入9mL Mandel Weber 营养液，接种6mL/100g的粗壮脉纹胞菌，发酵72h后接种3mL/100g的同样经过72h培养的东方伊莎酵母，28℃培养箱中继续培养24h，测定各纤维素酶酶活力。

2 结果与分析

2.1 茶皂素残留率

经过超声波提取后的茶粕中茶皂素的残留率达到0.917%，对微生物正常生长没有影响[18]。

2.2 复合菌发酵中纤维素酶的酶活力

2.2.1 发酵时间对纤维素酶活力的影响

A. FPA；B. C1；C. Cx；D. β-G.；Nc. 粗壮脉纹胞菌；Tv. 绿色木霉；Tr. 里氏木霉；Io. 东方伊莎酵母；Lp. 乳酸杆菌。下同。

图 1 各种菌在不同复合方式下的发酵时间对纤维素酶活力的影响

Fig.1 Effect of fermentation time on the cellulose activities

各种菌不同复合方式在不同发酵时间对纤维素酶酶活力的影响结果见图1。发酵时间对混合菌发酵产纤维素酶影响较大。粗壮脉纹胞菌单菌发酵各纤维素酶酶活力随着发酵时间的延长而提高，其总酶活力（FPA）、内切酶（Cx）及β-糖苷酶（β-G）在72～84h时间段中酶活力迅速上升并达到峰值（分别为2.980、16.588、8.438U/g），且均高于其他实验组；里氏木霉＋粗壮脉纹胞菌复合发酵组与粗壮脉纹胞菌＋绿色木霉复合发酵组96h后4种纤维素酶酶活力仍处于上升趋势，在粗壮脉纹胞菌＋绿色木霉复合发酵组中C1酶的酶活力最高值出现在96h，达到16.688U/g，Cx酶的酶活力在96h为15.548U/g，超过同时期粗壮脉纹胞菌单菌发酵组。酵母菌和乳酸杆菌对粗壮脉纹胞菌发酵茶粕产纤维素酶有一定的抑制作用，各酶活在各个发酵时间段相比于粗壮脉纹胞菌单菌发酵均有较大幅度的下降，这两个实验组中各纤维素酶酶活总体趋势是先升后降，基本上与粗壮脉纹胞菌单菌发酵同步。

2.2.2 各种复合菌接种量对纤维素酶活力的影响

图 2 各种菌不同复合方式的接种量对各纤维素酶活力的影响

Fig.2 Effects of inoculum size on the cellulose activities

各菌种不同复合方式在不同接种量时发酵96h后，纤维素酶测定结果如图2所示。各实验组中各种纤维素酶酶活基本上都随着接种量的增加而提高，粗壮脉纹胞菌单菌发酵组中当接种量从9mL/100g增加至12mL/100g时，总酶酶活力（FPA）和C1酶酶活力都有一定程度的下降，分别从2.587U/g和11.141U/g下降至2.536U/g和10.612U/g。粗壮脉纹胞菌＋绿色木霉复合发酵组和粗壮脉纹胞菌＋里氏木霉复合发酵组在接种量达到12mL/100g时各纤维素酶酶活力均到达最高值，其中FPA酶、C1酶酶活力超过粗壮脉纹胞菌单菌相应接种量的酶活力，分别为2.881、2.979U/g和17.033、16.965U/g。

2.3 原料与发酵产物纤维素组分含量的对比

表 1 不同复合菌发酵对产物粗纤维素各种组分的影响

Table 1 Effect of single- and mixed-strain fermentation on lignin, cellulose and hemicelluloses in tea seed cake

由表1可知，粗壮脉纹胞菌单菌发酵对半纤维素降解效果比其他混合菌种发酵组要好，降解率达到45.05%，可能是由于半纤维素对粗壮脉纹胞菌产纤维素酶有一定的底物诱导作用或是粗壮脉纹胞菌所产纤维素酶酶系对半纤维素有特异性[19]；东方伊莎酵母、绿色木霉、里氏木霉与粗壮脉纹胞菌复合发酵降解纤维素的能力均较粗壮脉纹胞菌单菌发酵高，可能是复合菌C1酶酶活力相比于粗壮脉纹胞菌单菌发酵有所提高，纤维素酶酶系更加完整，微生物菌群结构更合理等；由于该实验所选用的不是产木质素酶显著的微生物，所以各实验组对木质素的降解效果均不理想，最好的是粗壮脉纹胞菌+里氏木霉复合发酵组，木质素含量从6.85%下降至5.30%。

2.4 原料与发酵产物粗纤维含量对比

表 2 原料与发酵产物粗纤维含量的对比

Table 2 Comparison of cellulose content between raw and fermented materials

由表2可知，粗壮脉纹胞菌和里氏木霉复合发酵组对茶粕中粗纤维降解效果最明显，粗纤维降解率达到64.19%，其次是粗壮脉纹胞菌和绿色木霉发酵组、粗壮脉纹胞菌单菌发酵组、粗壮脉纹胞菌＋东方伊莎酵母菌组，粗壮脉纹胞菌＋乳酸杆菌组降解粗纤维效果最差。

2.5 验证实验结果

2.5.1 乳酸杆菌复合粗壮脉纹胞菌厌氧发酵对产纤维素酶的影响

图 3 乳酸杆菌复合粗壮脉纹胞菌对产纤维素酶酶活力的影响

Fig.3 Effect of co-fermentation with L. plantarum and Neurospora crassa on the cellulase activities

由图1、3可知，48～72h时间段，粗壮脉纹胞菌产纤维素酶酶活力正常，上升趋势明显，在72h加入乳酸杆菌后，本应处于快速增长期的各纤维素酶酶活力却在这时大幅下降，培养96h后Cx酶活力相比于粗壮脉纹胞菌单菌发酵的同期下降了66.11%，其酶活变化趋势与之前实验结果契合。乳酸杆菌对粗壮脉纹胞菌产纤维素酶有抑制作用。

2.5.2 东方伊莎酵母复合粗壮脉胞菌发酵对产纤维素酶的影响

图 4 东方伊莎酵母复合粗壮脉纹胞菌对产纤维素酶酶活力的影响

Fig.4 Effect of co-fermentation with Issatchenkia oriental and Neurospora crassa on the cellulase activities

由图4可知，FPA、Cx和C1这3种酶活均在接种东方伊莎酵母后开始下降，且下降幅度较图1中更为明显。此外，发酵96h后产物中酒精度达3.2mL/100g。β-糖苷酶下降趋势较平缓，可能是由于乙醇不是其主要的竞争性抑制剂的缘故。

3 结论与讨论

3.1 单菌发酵和混合菌发酵所产纤维素酶酶活力的变化

本实验的目的是寻找能与粗壮脉纹胞菌协同降解纤维素或对粗壮脉纹胞菌生长有促进作用的复合菌，以便提高农副产物的利用价值。由于粗壮脉纹胞菌自身所产纤维素酶中Cx酶活力较高，而里氏木霉和绿色木霉产C1酶活力较高[20-21]，但其相对于粗壮脉纹胞菌产酶高峰来的较晚，产酶周期长。粗壮脉纹胞菌单菌发酵达到产酶高峰一般在发酵后的60～84h，而其与绿色木霉或里氏木霉复合后，产酶高峰出现延后，一般在96h才达到较高水平。发酵84h时，粗壮脉纹胞菌单菌发酵的Cx（16.588U/g）、FPA（2.980U/g）、β-G（8.438U/g）酶活力均高于各复合菌发酵，但发酵96h后，粗壮脉纹胞菌单菌产各种纤维素酶酶活力均降低Cx（15.111U/g）、FPA（2.547U/g）、β-G（8.222U/g），而各复合菌发酵产各纤维素酶酶活力保持增势，粗壮脉纹胞菌＋绿色木霉复合发酵组的C1酶活力在96h达到了16.688U/g（84h时为13.125U/g）。结合粗纤维素降解数据，经过10d充分发酵后，本实验观察到菌体基本停止生长，这时基料中的营养物质基本上利用完全，粗壮脉纹胞菌＋里氏木霉组和粗壮脉纹胞菌＋绿色木霉组对茶粕中粗纤维的降解效果更好、更彻底。这可能是由于里氏木霉和绿色木霉的产酶周期长，C1酶活力较高（与Cx酶活基本一致），正好互补了粗壮脉纹胞菌所产C1酶活力较低这一不足。粗壮脉纹胞菌＋里氏木霉组和粗壮脉纹胞菌＋绿色木霉组对纤维素组分的降解效率要高于粗壮脉纹胞菌单菌组，可能是由于纤维素组分作为碳源对绿色木霉和里氏木霉的诱导效果优于对粗壮脉纹胞菌的诱导效果，导致纤维素酶水解效率提高；此外，还可能是绿色木霉、里氏木霉复合粗壮脉纹胞菌所产纤维素酶酶系更完整，C1酶活力高，对打断纤维素复杂的结晶区有所帮助，导致其降解效果提高[22]。综上所述，粗壮脉纹胞菌与绿色木霉和里氏木霉的混合发酵组相比于粗壮脉纹胞菌单菌发酵，其所产纤维素酶周期长，酶系更完整，酶效率更高，降解纤维能力更强。

3.2 接种量对复合菌各纤维素酶酶活力的影响

接种量的增加对粗壮脉纹胞菌＋绿色木霉组和粗壮脉纹胞菌＋里氏木霉组所产纤维素酶影响较大，当接种量达到9mL/100g后，粗壮脉纹胞菌＋绿色木霉组C1（15.672U/g）、Cx（15.569U/g）酶活力超过粗壮脉纹胞菌单菌（分别为11.141U/g和12.229U/g）；粗壮脉纹胞菌＋里氏木霉组在接种量达到12mL/100g时，其FPA（2.979U/g）和C1（16.965U/g）酶活力优于同接种量的粗壮脉纹胞菌单菌发酵组（分别为2.536U/g和10.612U/g）。粗壮脉纹胞菌+酵母菌组随着接种量的增加各纤维素酶酶活力均稳步上升，但总体酶活力较低，结合表1，可以发现虽然在酶活上没有升高，但对纤维素的降解率相对于粗壮脉纹胞菌单菌发酵提高了12.15%，可能是由于酵母菌将无机氮转换成菌体蛋白后，分泌B族维生素、生物活性物质等[23]促进了粗壮脉纹胞菌的生长的原因。粗壮脉纹胞菌单菌发酵的β-G酶活力高于其他各实验组，并且随着接种量的增加而提高，在接种量到12mL/100g时达到了8.742U/g。可能是由于前期发酵产生的Cx和C1两种纤维素酶的作用导致发酵物中纤维二糖含量剧增，通过反馈诱导机制刺激β-G大量分泌，而后期β-G酶活力呈现下降趋势，是由于葡萄糖含量增加，竞争性抑制了β-G酶活力[24]。此外，β-G的变化趋势和FPA变化趋势是契合的，表明β-G可能是总酶活的一个关键控制酶。总体来说，当接种量达到12mL/100g时，粗壮脉纹胞菌单菌发酵所产酶酶活力呈下降趋势，可能是过多的接种量导致基料消耗快，在未达到产酶高峰前，基料中的营养成分就耗尽，不能满足如此大量的菌同时生长；而绿色木霉、里氏木霉对基料中营养成分要求更低，与粗壮脉纹胞菌复合，纤维素酶系更齐全，对纤维素的利用效率更高[25]。

通过本实验可以得出如下结论：乳酸菌在发酵茶粕产纤维素酶上对粗壮脉纹胞菌没有促进作用，在发酵后期，对粗壮脉纹胞菌的产酶还有抑制作用，导致该组在发酵96h后FPA酶活力只有0.629U/g，验证实验组中FPA酶活力只有0.85U/g。可能是由于在发酵后期发酵瓶中的氧气含量较低，乳酸杆菌大量生长，分泌对真菌生长有抑制作用的乳酸类、酚酸类物质[26-27]，降低了粗壮脉纹胞菌的作用。有研究表明[28]，酵母菌复配真菌发酵能产生较好的效果。但本实验中，东方伊莎酵母对粗壮脉纹胞菌发酵茶粕产纤维素同样没有促进作用。结合验证实验，本研究认为可能是酵母菌在发酵中期开始利用粗壮脉纹胞菌降解纤维素产生的可溶性糖迅速生长并分泌次级代谢产物——酒精，对粗壮脉纹胞菌的生长产生了干扰，导致发酵后期纤维素酶酶活力显著下降。

参考文献：

[1] 邓桂兰，魏强华. 利用茶粕生产菌体蛋白饲料的研究[J]. 粮食与食品工业, 2008(15): 31-38.

[2] 黄卫文, 敖常伟, 钟海雁. 油茶皂素抑菌效果研究[J]. 经济林研究, 2002, 20(1): 17-19.

[3] 黄冬梅, 香私, 李庆, 等. 茶皂素提取工艺的研究及应用前景[J]. 化工科技市场, 2003 (11): 11-13.

[4] 陈钦, 郑清芳. 油茶饼综合利用的研究[J]. 福建林学院学报, 2002, 20(2): 97-100.

[5] 罗永生, 常春. 固态混菌发酵产纤维素酶的研究进展[J]. 酿酒科技, 2010(1): 79-82.

[6] XIROS C, TOPAKAS E, KATAPODIS P, et al. Hydrolysis and fermentation of brewer’s spent grain by Neurospora crassa[J]. Bioresource Technology, 2008, 99(13): 5427-5435.

[7] 熊海燕, 王卫国, 王存文, 等. 混合菌培养及其在工业上的应用[J]. 贵州化工, 2004, 29(3): 16-19.

[8] RODRIGUEZ-COUTO S, SANROMAN M A. Application of solid-state fermentation to ligninolytic enzyme production[J]. Biochemical Engineering Journal, 2005, 22: 211-219.

[9] 考书娟, 张锋, 张彬. 丝状真菌YW-7与乳酸菌共同培养发酵豆粕的研究[J]. 家禽科学, 2008, 24(6): 16-19.

[10] 张昆, 王春维, 余岳, 等. 复合杂粕多菌种发酵工艺研究[J]. 粮食与饲料工业, 2012, 5(3): 49-52.

[11] AHAMED A, VERMETTE P. Enhanced enzyme production from mixed cultures of Trichoderma reesei RUT-C30 and Aspergillus niger LMA grown as fed batch in a stirred tank bioreactor[J]. Biochemical Engineering Journal, 2008, 42: 41-46.

[12] 肖玉娟, 邓泽元, 范亚苇, 等. Neurospora crassa降解茶粕培养基粗纤维的发酵工艺研究[J]. 食品科学. 2010, 31(23): 243-247.

[13] OBEROI H S, CHAVAN Y, BANSAL S, et al. Production of cellulases through solid state fermentation using kinnow pulp as a major substrate[J]. Food Bioprocess Technology, 2010, 3(4): 528-536.

[14] BAILEY M J, BIELY P, POUTANEN K. Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity[J]. Journal of Biotechnology, 1992, 23: 257-270.

[15] RODRIGUEZ-COUTO S, SANROMAN M A. Application of solid-state fermentation to ligninolytic enzyme production[J]. Biochemical Engineering, 2005, 22: 211-219.

[16] KIM S, KIM C H. Production of cellulase enzymes during the solid-state fermentation of empty palm fruit bunch fiber[J]. Bioprocess Biosystem Engineering, 2012, 35: 61-67.

[17] 陈贤情. 秸秆中纤维素/半纤维素和木质素的几种测定方法对比[D]. 杨凌: 西北农林科技大学, 2006.

[18] 刘蓉, 张利蕾, 范亚苇, 等. 茶渣中粗茶皂素的纯化及其抗氧化和抑菌活性[J]. 南昌大学学报: 工科版, 2013, 35(1): 17-21.

[19] BUNGAY H R, BUNGAY M L. Microbial interactions in continuous culture[J]. Advances in Applied Microbiology, 1986, 10: 269-312.

[20] 曹健, 郭德宪, 曾实, 等. 里氏木霉纤维素酶的纯化和性质[J]. 食品科学, 2003, 24(5): 73-75.

[21] de VRIES R P, VISSER J. Aspergillus enzymes involved in degradation of plant cell wall polysaccharides[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2001, 65(4): 497-522.

[22] 陈合, 余建军, 舒国伟, 等. 复合酶降解高温蒸煮玉米秸秆的饲料化研究[J]. 食品工业科技, 2010, 5(12): 176-178; 181.

[23] 戴四发, 贺淹才. 绿色木霉纤维素酶系分泌特性及酶解条件的研究[J]. 安徽技术师范学院学报, 2001, 15(4): 50-53.

[24] GALAS E, ROMANOWSKA I. Purification and some properties of beta-glucosidase from Aspergillus niger IBT-90[J]. Acta Microbiologica Polonica, 1997, 46(3): 241-252.

[25] BISARIAA V S, GHOSE T K. Biodegradation of cellulosic materials: substrates, microorganisms, enzymes and products[J]. Enzyme and Microbial Technology, 1981, 3(2): 90-104.

[26] PERALTAA E M, HATATE H, KAWABE D, et al. Improving antioxidant activity and nutritional components of Philippine salt-fermented shrimp paste through prolonged fermentation[J]. Food Chemistry, 2008, 111: 72-77.

[27] PREMA P, SMILA D, PALAVESAM A, et al. Production and characterization of an antifungal compound (3-phenyllactic acid) produced by Lactobacillus plantarum strain[J]. Food Bioprocess Technology, 2010, 3: 379-386.

[28] MURADOA M A, PASTRANA L, VÁZQUEZ J A, et al. Alcoholic chestnut fermentation in mixed culture. Compatibility criteria between Aspergillus oryzae and Saccharomyces cerevisiae strains[J]. Bioresource Technology, 2008, 99: 7255-7263.