荧光法结合化学计量学法快速检测
牛乳中恩诺沙星残留

刘小鸣，冯仕云，周颖喆，田丰伟，赵建新，张 灏，陈 卫

(江南大学食品学院，江苏 无锡 214122)

摘 要：以添加不同恩诺沙星浓度的牛乳体系构建校正集和预测集，应用化学计量学中的偏最小二乘(PLS)法和偏最小二乘判别分析(PLSDA)法对荧光光谱数据进行解析并构建模型。结果表明：PLS模型可较好地预测牛乳中恩诺沙星的含量，回收率在96%～111.4%之间；PLSDA模型可用来判断样品中恩诺沙星含量是否超过最大残留量。所建立的检测模型可应用于牛乳中恩诺沙星残留的快速检测。

关键词：牛乳；恩诺沙星；荧光；化学计量学；快速检测

Rapid Determination of Enrofloxacin in Milk by Fluorescence Spectroscopy Combined with Chemometrics

LIU Xiao-ming，FENG Shi-yun，ZHOU Ying-zhe，TIAN Feng-wei，ZHAO Jian-xin，ZHANG Hao，CHEN Wei

(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Abstract：Though there are many analytical methods available to determine antibiotic residues in milk, most of them are rather complicated. A rapid screening method for enrofloxacin in milk was proposed by fluorescence spectroscopy combined with chemometrics. The fluorescence spectra of milk samples spiked with different concentrations of enrofloaxcin (ENRO) were recorded and partial least square discriminate analysis (PLSDA) and partial least square (PLS) regression methods were conducted for use as calibration and prediction models. The results showed that the PLS model could determine the concentration of ENRO in milk, and the recovery rate for milk samples was in the range of 96% to 111.4%. The PLSDA model could accurately identify whether ENRO levels in milk samples exceeded the maximum residue limit with good repeatability. Therefore the established models are useful for rapid determination of ENRO residues in milk.

Key words：milk；enrofloxacin；fluorescence；chemometrics；rapid determination

中图分类号：TS252.7 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)22-0111-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201322022

近年来，我国乳制品的消费者人数逐年增加，我国的乳制品行业得到迅猛发展。然而目前国内乳制品的质量与安全方面还存在一些隐患。首先由于我国乳牛的农场化养殖水平较低，大部分原料乳(约占80%)是来自乳牛散养户，因此导致原料乳品质波动性很大。随着畜牧业的发展，抗生素被广泛应用于奶牛饲养中，对奶牛用药不当或滥用抗生素，会导致乳制品的抗生素残留现象[1-3]。恩诺沙星是氟喹诺酮类的一种抗生素，被广泛用于奶牛疾病的治疗中[4-7]。我国农业部公告中明确规定，牛乳中恩诺沙星的残留量不得超过100μg/kg[8]。

目前常用的牛乳中抗生素残留量的检测方法有TTC(2,3,5-氯化三苯四氮唑)法、液相色谱-质谱法和免疫法等[9-11]。尽管上述检测方法有较好的分析结果，但操作较为繁复。荧光法结合化学计量学在牛乳中抗生素残留检测中的应用，可提供一种简便有效的快速检测方法。在之前的研究中，已尝试采用荧光与化学计量学方法建立了另一种氟喹诺酮类抗生素-达诺沙星的快速检测方法[12]。恩诺沙星也含有具有荧光特性的苯环平面结构，可采用荧光法进行检测[13-14]。本实验以添加不同恩诺沙星浓度的牛乳体系为研究对象，采用化学计量学中的偏最小二乘(partial least square，PLS)和偏最小二乘判别分析(partial least square discriminate analysis，PLSDA)法解析其荧光光谱，对牛乳中的恩诺沙星进行定性和定量分析，旨在建立牛乳中恩诺沙星的快速检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

UHT奶购自无锡超市。

甲醇(色谱纯)、三氯乙酸(TCA，分析纯) 国药集团化学试剂有限公司；恩诺沙星(ENRO，标准品) 上海Sigma-Aldrich公司。

配制1mg/L的ENRO溶液(甲醇溶解)，4℃避光保存；三酸(Britton-Robinson，B-R)缓冲液：0.04mol/L H3PO4、H3BO3和CH3COOH溶液，用0.2mol/L NaOH溶液调节至不同的pH值。

1.2 仪器与设备

F-7000荧光分光光度计 日本日立公司；Sorvall Legend Micro17微量离心机 上海森信实验仪器有限公司；SevenEasy实验室pH计 上海梅特勒-托利多仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 水溶液体系

在25mL的容量瓶中分别加入1.5、2.25、3、3.75mL的ENRO溶液(1mg/L)，用超纯水定容，配成配制一系列质量浓度递增的ENRO溶液(质量浓度分别为60、90、120、150μg/L)。选择激发波长范围270～380nm、发射波长范围400～500nm，进行荧光三维扫描，扫描速率为12000nm/min。固定激发波长285nm，发射波长400～500nm，扫描二维荧光光谱，扫描速率1200nm/min，激发波长和发射波长的狭缝宽度均为5nm，光电倍增管电压600V。

1.3.2 牛乳体系

建立校正集：选取品牌A的全脂牛乳建立校正集，在25mL棕色容量瓶中分别加入适量的ENRO溶液(1mg/L)，并用牛乳定容，制成质量浓度为分别为0、30、60、90、120、150、180、210μg/L的ENRO牛乳溶液；取2mL溶液于离心管中，加入3mL甲醇，混匀，再加入1mL 30%三氯乙酸(TCA)，振荡混匀，静置5min；4000r/min离心10min，过滤，收集上清液，每次实验平行3次，共有27个样品。

建立预测集：在25mL容量瓶中分别加入不同品牌的牛乳，加入适量的ENRO溶液(1mg/L)，并用相对应的牛乳定容，制成质量浓度为分别0、80、130、160μg/L的ENRO牛乳溶液；采用与上述步骤相同的方法离心、收集上清液。每次实验平行2次。

扫描条件：固定激发波长285nm；发射波长400～500nm；扫描二维荧光光谱，扫描速率1200nm/min；激发波长和发射波长的狭缝宽度均为5nm。

1.3.3 重复性实验

第2天时，选取前1d预测集中的部分样品构建预测集2；在第3天时，再选择部分样品建立预测集3：采用与1.3.2节相同的方法制备样品，并在相同荧光扫描条件下进行扫描。

1.4 数据分析

PLS主要用于定量分析，可在多个变量间寻找出最好的线性关系。在本实验中，将校正集样品的光谱数据(X变量)与其抗生素所对应的质量浓度变量(Y变量)一起导入Unscrambler中，应用PLS1(适用于1个Y变量)进行分析，采用交叉法进行内部验证，获得PLS定量校正模型，并利用所建立的预测集样本对此定量模型进行验证。

PLSDA主要用于定性分析，它以偏最小二乘法的基本原理为基础，主要目的是判别单个未知样品与已知样品组之间的关系[15]。在本实验中，PLS与PLSDA模型的区别主要在于各自的Y变量不同，在PLS模型中为质量浓度变量，而在后者中以反应变量(－1或1)为变量。对牛乳中ENRO的含量大于最大残留量(100μg/L)的牛乳样品赋值为1，小于最大残留量的样品赋值为－1，然后将校正集的光谱数据和所对应的赋值一起导入Unscrambler软件中进行分析，建立定性校正模型，并利用建立的预测集样本对模型进行验证。根据欧盟的规定[16]对筛选方法灵敏度采用(1－α)×100计算，其中α为假阳性的概率。根据检出限(limit of detection，LOD)公式计算建立方法的检出限：

LOD=3σ/S

式中：σ为空白标准偏差/(μg/L)；S为校正曲线斜率。

2 结果与分析

2.1 水溶液体系的荧光光谱

图 1 水溶液体系(恩诺沙星120μg/L)的荧光三维光谱(a)和等高图谱(b)

Fig.1 3D-Fluorescence spectra of ENRO at 120 μg/L (a) and corresponding contour spectra (b)

首先在激发波长(λEx)260～380nm和发射波长(λEm)400～500nm条件下，对水溶液体系进行三维荧光光谱扫描，结果如图1所示。ENRO具有与达诺沙星相似的荧光特性，在等高谱图中可以观察到一强一弱两个荧光峰。在λEx/λEm=285nm/440nm时，有强荧光峰出现，在λEx/λEm=330nm/440nm处有1个荧光强度相对较低的荧光峰。依据观察到的激发波长与发射波长，分别对样品进行二维荧光光谱扫描，发现在λEx/λEm=285nm/440nm与λEx/λEm= 330nm/440nm处，样品的荧光强度与所含ENRO质量浓度均有较好的相关性(R2=0.99)。

2.2 牛乳体系中恩诺沙星的荧光特性

图 2 恩诺沙星(120μg/L)在除蛋白牛乳体系中的三维荧光图谱

Fig.2 Contour spectra of milk with ENRO (120 μg/L) after deproteinization

牛乳体系含有多种内源性的荧光物质，如色氨酸、VA、美拉德产物等，对阴性牛乳样品进行三维扫描时发现，牛乳中色氨酸表现出了强烈的荧光信号(图略)。在对含有恩诺沙星的牛乳样品的三维荧光光谱进行分析时发现，来源于牛乳的色氨酸荧光峰覆盖了恩诺沙星的荧光信号，因此在检测牛乳中恩诺沙星残留之前需要对牛乳进行除蛋白工艺。从除蛋白后的含恩诺沙星的牛乳荧光光谱(图2)可以看出，牛乳样品的荧光特性与水溶液中恩诺沙星的荧光谱图相似，可采用二维荧光技术(λEx/λEm= 285nm/440nm)检测牛乳中恩诺沙星的残留。从图2也可看出，虽然采用除蛋白的方法去除了牛乳中色氨酸带来的荧光干扰，但牛乳中仍残留有较多的荧光组分，例如美拉德产物、VA等，这些物质仍会给分析过程带来一定的影响。所以在接下来快速检测方法的建立中需引入化学计量学方法对牛乳体系荧光谱图进行处理，以“数学分离”代替化学分离，进而实现对牛乳中恩诺沙星残留的检测[17-20]。

2.3 PLS模型和PLSDA模型的建立

表 1 恩诺沙星校正模型的有关指标

Table 1 Characteristics of PLS regression and PLSDA models of ENRO

注：a.校正集荧光谱数据；b.校正集中分析物质量浓度变量。

采用Unscrambler软件对牛乳的二维荧光光谱数据建立的校正模型，如表1所示。可知PLS和PLSDA校正模型有较好的精确度和稳定性。

图3是校正集经PLS分析得到的Loading图，该图中的PC1为ENRO的特征荧光峰，表征了98%的光谱信息；PC2代表了1%的光谱信息，主要对应的是实验中所用市售牛乳之间的美拉德反应产物等产物的差异。

图 3 牛乳中恩诺沙星的PLS模型的载荷图

Fig.3 The factor loadings of PLS model for ENRO in milk

2.4 PLS和PLSDA模型的验证

应用建立的ENRO的PLS和PLSDA的校正模型，对不同品牌(A、B、C)的市售UHT牛乳进行预测，表2为依据所建模型对预测集样品的定量和定性预测结果。由PLS模型预测结果可知，样品中ENRO的回收率在100.9%～114.8%之间。在应用PLSDA定性模型进行预测时，发现所建模型可对全脂奶与高钙奶进行正确预测，阳性样品(MRL＞100μg/L)的预测值均大于0，阴性样品(MRL＜100μg/L)的预测值均小于0，该模型可用于牛乳中ENRO残留是否超标的快速筛选。因此，应用PLS和PLSDA模型来判别牛乳中ENRO残留情况可行。

表 2 UHT牛乳样品中ENRO残留量的预测结果

Table 2 The predicted results for commercial UHT milk samples

注：UWA～UWC为不同品牌的全脂UHT牛乳样品；UCaA～UCaC为不同品牌的全脂UHT高钙牛乳样品。下同。

2.5 对已建立模型性能的评价

表 3 不同日期配制的预测集样品中ENRO残留量的预测结果

Table 3 The predicted results for prediction set samples prepared on different dates

由表3可见，计算得出该模型对恩诺沙星的最低检出限为2.87μg/L，回收率在96%～111.4%之间，线性范围为5～210μg/L之间，PLSDA模型预测的正确率为100%。将第1、2、3天的预测集的预测结果进行比较与分析，由表4可知，同种质量浓度的样品预测到的含量之间的标准偏差在1.5～4.4μg/L之间，平均偏差为3.1%，该检测方法的最低检出限与高效液相色谱法所检测的结果相似[21-22]。

与色谱法相比，荧光-化学计量学方法的局限之处在于：只能应用于具有荧光特性或衍生化后可产生荧光特性的样品，而且由于食品本身含有荧光物质可能为检测带来干扰，必须选择合适的化学计量学方法才能构建出有效的校正模型。而另一方面，如本实验所示，对于合适的检测对象，荧光-化学计量学方法也具有检测时间快、灵敏度高的特点。另外，如果检测物质具有良好的荧光信号且荧光特性各异，也可采用三维荧光扫描与化学计量学方法实现对多种荧光物质的同时检测[23]。

表 4 重复性实验

Table 4 Reproducibility of the predicted results

3 结 论

本研究表明荧光光谱技术结合化学计量方法可快速检测牛乳中的恩诺沙星残留。PLS回归模型可以预测出未知牛乳样品中恩诺沙星的含量；PLSDA模型可以精确地判断出样品是否为阳性，实验方法具有良好的重复性。因此所建立的模型可应用于牛乳中恩诺沙星残留的快速筛选与检测中。

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