pH值及底物对副干酪乳杆菌发酵
生产苯乳酸的影响

王立梅1,2，腾 宇1，陈文飞1，张 辉1，储开阳1

（1.常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏 常熟 215500；2.苏州市食品生物技术重点实验室，江苏 常熟 215500）

摘 要：在7.5L发酵罐中研究pH值及流加苯丙酮酸和葡萄糖对副干酪乳杆菌W2分批发酵产苯乳酸（phenyllactic acid，PLA）的影响。结果表明：发酵液初始pH值、底物葡萄糖和苯丙酮酸对菌体生长和产物产量都有影响。控制发酵液pH值为6.5，采用间歇流加苯丙酮酸及连续流加苯丙酮酸和葡萄糖，发酵36h后PLA产量分别达到1.148g/L和2.121g/L，苯丙酮酸的转化率分别为62.19%和47.2%，与分批发酵相比分别提高41.72%和161.53%。

关键词：副干酪乳杆菌；苯乳酸；苯丙酮酸；底物流加

Effects of pH and Substrate Feeding on Phenyllactic Acid Production by Lactobacillus paracasei W2

WANG Li-mei1,2, TENG Yu1, CHEN Wen-fei1, ZHANG Hui1, CHU Kai-yang1

(1. School of Biotechnology and Food Engineering, Changshu Institute of Technology, Changshu 215500, China;

2. Suzhou Key Laboratory of Food Biotechnlogy, Changshu 215500, China)

Abstract: In this paper, the effects of initial medium pH and feeding of the substrates glucose and phenylpyruvic acid (PPA) on the production of phenyllactic acid (PLA) by Lactobacillus paracasei W2 in a 7.5 L fermentor were studied. The results indicated that all three factors generated corresponding effects on cell growth and PLA production. Two substrate feeding strategies, intermittent feeding of PPA and continuous feeding of both glucose and PPA were performed and the initial medium pH was set to 6.5. After 36 h of fermentation under these conditions, PLA production reached 1.148 g/L and 2.121 g/L, respectively, and the conversion rate of PPA reached 62.19% and 47.2%, respectively. In addition, in comparison with fed-batch fermentation, the PLA yield was enhanced by 41.72% and 161.53%, respectively.

Key words: Lactobacillus paracasei; phenyllactic acid; phenylpyruvic acid; substrate feeding

中图分类号：TQ921.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2014)01-0163-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201401032

苯乳酸（phenyllactic acid，PLA）是一种广泛存在于乳酸菌发酵产品和蜂蜜中的有机酸[1]。研究证实PLA具有广谱且高效的抗菌活力，可以有效抑制包括食源性致病细菌、酵母和霉菌等多种微生物的生长，并且可以替代抗生素用于家畜饲养[2-4]。PLA具有较宽pH值范围、热稳定性高、溶解性好、易于在各种食品体系中扩散、对人和动物细胞均无毒性等优点，为其在食品工业中的应用提供广阔的前景[5-6]。

PLA生产包括化学合成法和发酵法。据报道[7-9]，能够产生PLA的微生物包括霉菌、芽孢杆菌、丙酸菌和乳酸菌，其中多数乳酸菌都具备合成PLA能力。然而乳酸菌发酵过程中产生的有机酸，会抑制细胞生长和代谢产物形成[10]。另外，PLA是乳酸菌代谢产物苯丙氨酸的分解代谢产物，而苯丙氨酸在细胞内不会过量积累，因此限制了PLA的合成[11]。乳酸菌发酵生产PLA的关键是提高菌体浓度和PLA产量，因此维持发酵体系pH值稳定，并通过外源添加中间产物苯基丙酮酸可以显著提高PLA产量[12]。

本研究以1株产苯乳酸副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）W2为出发菌株[13]，采用7.5L发酵罐对发酵体系中pH值和底物流加进行优化，以期达到提高PLA发酵水平的目的。

1 材料与方法

1.1 菌种、试剂与培养基

1.1.1 菌种

副干酪乳杆菌（L. paracasei）W2，本实验室筛选（中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏号CCTCC No. M209318）。

1.1.2 试剂

葡萄糖试剂盒 保定长城临床试剂有限公司；苯乳酸及苯丙酮酸标准品 美国Sigma公司；苯丙酮酸 山东绿源天然原料有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 培养基

种子培养基（g/L）：葡萄糖20、酵母膏5、蛋白胨10、牛肉膏10、乙酸钠5、K2HPO4 2、柠檬酸二铵2、MgSO4•7H2O 0.58、MnSO4•4H2O 0.25，吐温-80 1mL/L，pH6.5，121℃灭菌20min。发酵培养基（g/L）：葡萄糖20、酵母膏5、蛋白胨15、乙酸钠5、K2HPO4 2、柠檬酸二铵1.8、MgSO4 0.58、MnSO4 0.25、苯基丙酮酸3，吐温-80 4mL/L，pH6.5～7.0，121℃灭菌20min。

1.2 仪器与设备

LC-20A高效液相色谱仪 日本Shimadzu公司；BioFlo110发酵罐 美国NBS公司；CR22GⅡ高速冷冻离心机 日本Hitachi Koki公司；DHG-9243BS-Ⅲ电热恒温鼓风干燥箱 上海新苗医疗器械制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培养方法

种子培养：将活化后的菌种先接入种子培养基中，30℃静止培养18h，然后按体积分数5%接种量再接入500mL发酵培养基中，同样条件培养后备用。

初始pH值对苯乳酸产量的影响：将发酵培养基的初始pH值分别调整到4.5～8.5范围内，于30℃、接种量10%条件下，在7.5L发酵罐中发酵36h，测定PLA产量与生物量。

分批发酵：按照上述确定的最佳初始pH值，于接种量10%、30℃条件下，在7.5L发酵罐中发酵36h，每3h测定苯乳酸产量、葡萄糖含量、pH值与生物量。

恒定pH值发酵：在7.5L发酵罐中装入3L发酵培养基，接种量10%，采用10mol/L的NaOH控制pH值为6.5，每小时间歇搅拌2min，搅拌转速50r/min，30℃发酵36h。每3h检测葡萄糖含量、生物量和PLA产量。

补料发酵：补料发酵在7.5L全自动发酵罐中进行，装液量3L，接种量10%，发酵温度30℃，采用10mol/L NaOH流加控制发酵液pH6.5。补料从发酵6h开始至发酵结束，间歇补料为每3h流加苯丙酮酸（18g/L）40mL（总添加量为400mL），最终发酵液体积3900mL；连续补料苯丙酮酸质量浓度50g/L，流加速率13mL/h；连续补料葡萄糖质量浓度500g/L，在发酵6～15h葡萄糖流加量为8mL/h，在15～36h葡萄糖流加量为18mL/h，最终发酵液体积4340mL。发酵罐搅拌速度为50r/min。每3h检测葡萄糖含量、生物量和PLA产量。

1.3.2 分析方法

1.3.2.1 葡萄糖含量测定

采用葡萄糖氧化酶法，按照试剂盒说明书操作。

1.3.2.2 生物量测定

取50mL发酵液离心后收集菌体，蒸馏水洗涤3次，于105℃干燥、称质量。

1.3.2.3 PLA提取与测定

将发酵液离心，取上清液调整pH2.0，然后加入2倍体积的乙酸乙酯萃取，减压蒸发浓缩，得到PLA样品，经0.22μm纤维素膜过滤，取滤液进行HPLC测定。

HPLC条件：色谱柱C18柱，流动相A为0.05%三氟乙酸甲醇溶液，B为0.05%三氟乙酸水溶液，检测波长210nm，柱温30℃，总流速1mL/min，进样量5μL。

苯乳酸产率按下式计算。

PLA产率/%= ×100

PLA产量/（g/L）

苯丙酮酸消耗量/（g/L）

2 结果与分析

2.1 初始pH值对PLA产量的影响

图 1 初始pH值对PLA合成的影响

Fig.1 Effect of initial medium pH on PLA production

如图1所示，发酵液初始pH值对副干酪乳杆菌W2菌体生长和代谢影响较大，初始pH值为6.5～7.0时有利于菌体生长和PLA积累，初始pH值呈酸性或碱性均不利于乳酸菌生长和代谢产物积累。

2.2 分批发酵

图 2 PLA分批发酵曲线

Fig.2 Time course of fed-batch fermentation

由图2可知，发酵前期，生物量和PLA产量随时间延长呈指数增长，而葡萄糖质量浓度迅速下降，发酵9h葡萄糖基本消耗尽，发酵液pH值降至4.1，菌体生长受到限制，生物量最高为3.014g/L，PLA产量为0.811g/L。

2.3 恒定pH值分批发酵

图 3 恒定pH值PLA分批发酵曲线

Fig.3 Time course of fed-batch fermentation at a constant pH

pH值控制在6.5，考察恒定pH值对副干酪乳杆菌W2生长及其代谢产物的影响，结果如图3所示。菌体的生长速率和PLA的合成量都得到提高，细胞浓度和PLA产量最高分别达到5.308g/L和0.936g/L，分别比未控制pH值时提高76.11%和15.56%，对数生长期从6h延长到9h。在发酵12h，葡萄糖几乎耗尽，细胞生长明显受到抑制，产物合成受到限制。

2.4 恒定pH值间歇补料苯丙酮酸发酵

图 4 恒定pH值间歇补料苯丙酮酸发酵曲线

Fig.4 Time course of PLA production with intermittent feeding of PPA at a constant pH

pH值控制在6.5，间歇流加苯丙酮酸对副干酪乳杆菌W2生长及其代谢产物的影响如图4所示。发酵0～9h，菌体生长迅速，随后到达稳定期；葡萄糖含量迅速下降，12h几乎耗尽，细胞的生长受到限制；发酵0～18h时，PLA的产量呈指数增长，18h后增长趋势减缓。苯丙酮酸添加明显提高了PLA产量，36h达到1.148g/L，PLA产率为62.19%。

2.5 恒定pH值连续补料葡萄糖和苯丙酮酸

如图5所示，发酵0～24h，连续补料发酵中菌体细胞一直处于连续增长状态，30h时，菌体生物量达到最高5.945g/L；发酵0～9h时PLA产量迅速增加，然后呈缓慢上升趋势，发酵36h，产量达到2.121g/L，比分批发酵分别提高了97.25%和161.53%，PLA产率为47.2%。

图 5 恒定pH值连续补料葡萄糖和苯丙酮酸发酵曲线

Fig.5 Time course of PLA production with continuous feeding of both PPA and glucose at constant pH

3 结论与讨论

本研究考察了在7.5L发酵罐中控制恒定pH值及流加底物葡萄糖和苯丙酮酸对副干酪乳杆菌W2分批发酵生产PLA的影响。乳酸菌发酵产生的有机酸使发酵液pH值降低，会导致细胞生长环境的酸化，造成了所谓的“酸胁迫”。乳酸菌在酸环境胁迫下，应激产生一系列应激蛋白（UspA蛋白），使菌体迅速适应环境的变化[14]。有研究显示，UspA蛋白是通过调节生物膜的形成、增加菌体的运动和黏附性、保护和修复DNA系统等功能来应对环境的胁迫以保护细胞，使菌体在逆境环境中存在[15-17]。酸胁迫严重影响细胞的生理活性，引起细胞膜的通透性、膜结构、稳定性发生变化，影响酶的活性，进而影响乳酸菌的生长及代谢[18-20]。通过控制发酵液pH值，副干酪乳杆菌W2的菌体浓度明显增加，同时连续补料发酵36h，生物量和PLA产量较分批发酵分别提高了97.25%和161.53%。但连续补料发酵过程中PLA产率明显下降。苯丙酮酸是PLA生产过程中间产物，当苯丙酮酸浓度过高时，反应向苯丙氨酸反应方向进行[21]。通过进一步对发酵液的高效液相图谱分析和对副干酪乳杆菌W2转氨酶酶学性质研究（尚未发表）都发现当苯丙酮酸浓度过高时，苯丙氨酸含量明显增加，不利于PLA的合成。因此，恰当的苯丙酮酸流加方法将有利于提高PLA产量。

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