反相高效液相色谱法测定调味品中
7种合成工业染料

陈永艳1,2，蒋丽娜3，屈飞飞2，刘卫东2

（1.中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所，北京 100050；

2.北京市海淀区疾病预防控制中心，北京 100094；3.北京食品科学研究院，北京 100050）

摘 要：建立测定调味品中7 种工业合成染料的高效液相色谱法。样品经乙腈超声提取后，10000 r/min离心10 min，取上清液进行分析，以0.02 mol/L乙酸铵溶液和乙腈溶液为流动相进行梯度洗脱，二极管阵列检测器测定。结果表明：7 种工业合成染料的分离效果良好，回收率为86.8%～106.0%，相对标准偏差为1.07%～5.44% （n=5）；检出限为0.2～0.5 mg/kg。该方法操作简单快速，结果准确，重复性好，适用于调味品中7 种工业合成染料的同时测定。

关键词：反相高效液相色谱；工业合成染料；调味品

Determination of Seven Industrial Synthetic Dyes in Condiments by RP-HPLC

CHEN Yong-yan1,2, JIANG Li-na3, QU Fei-fei2, LIU Wei-dong2

(1. Institute of Environmental Health and Related Product Safety, Chinese Center for Disease Control and Prevention,
Beijing 100050, China; 2. Beijing Haidian District Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100094, China;
3. Beijing Academy of Food Science, Beijing 100050, China)

Abstract: An HPLC method for the determination of seven industrial synthetic dyes in condiments was established. Samples were extracted with acetonitrile under ultrasonic-assisted conditions and the extract was centrifuged. The supernatant was then analyzed by HPLC-DAD with gradient elution using a mobile phase consisting of 0.02 mol/L ammonium acetate and acetonitrile and quantified by an external standard method. The concentrations of seven industrial synthetic dyes showed good linearity with peak area, and good separation was achieved for them. Their recovery rates from a spiked sample were in the range of 86.8%–106.0%, and the relative standard deviations were 1.07%–5.44% (n = 5). The detection limits were in the range of 0.2–0.5 mg/kg. In conclusion, this method is rapid, simple, sensitive, accurate and reproducible, and has a good applicability to the simultaneous determination of seven industrial synthetic dyes in condiment products.

Key words: high performance liquid chromatography; condiment; industrial synthetic dyes

中图分类号：TS202.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）06-0168-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201406036

自2003年5月法国首先发现了红辣椒粉制品中苏丹红Ⅰ至今，食品中添加工业染料的违法事件层出不穷，食品安全备受关注，食品安全不仅仅关乎百姓的身体健康，更关系到社会的和谐发展。由于工业染料种类繁多，且不法商贩把其添加到食品中，给食品日常监管带来较大困难，更给消费者的健康带来很大的危害。国际癌症研究机构将苏丹红归为三类致癌物，我国及欧盟等国家已禁止其作为食用色素。碱性橙具有致癌、致畸变性。根据美国卫生研究所化学品健康与安全数据库资料，摄取、吸入以及皮肤接触该物质均会造成急性和慢性的中毒伤害，GB 2760—2007《食品添加剂卫生标准》规定，严禁将其作为食品添加剂使用。早在20世纪末，欧美、日本等国家和地区就己明令禁止将罗丹明B用于食品加工中，我国也将其列入《食品中可能违法添加的非食用物质名单（第一批）》进行重点监管。但由于以上7 种工业燃料具有价格低廉、着色稳定、色泽鲜艳等特点，在利益的驱动之下，某些不法商贩利用这些特点，将其作为色素用于食品生产与加工，给消费者带来潜在的危害和巨大的风险，因此建立一套快速、准确且可同时测定多种食品中非食用色素的测定方法具有重要意义，也可为日常监管提供有力的技术保障。 

苏丹红Ⅰ～Ⅳ为亲脂性偶氮染料，其检测方法多为电分析法[1-2]、荧光猝灭法[3]、酶联免疫吸附测定法[4]、液相色谱法[5-9]，碱性橙Ⅱ、酸性橙Ⅱ、罗丹明B为亲水性染料，由于其酸碱性不同，检测方法通常包括荧光法[10-11]、液相色谱法 [12-16]、液-质联用法[17]，目前液相色谱法较为普遍。液相色谱-串联质谱法可同时测定几十种工业染料[18-22]，
虽然准确度精密度高，但需要大型仪器设备，操作繁琐，检测成本较高，因而使用液相色谱法初筛更为普遍，简单快速。目前国标方法尚不能实现对以上7 种工业染料同时检测。本实验拟建立一种简单快速、具有良好的重复性、检出限的测定方法，为快速检测各种调味品红色系工业染料的方法提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

辣椒粉、辣椒酱、五香粉、花椒等 市售。

甲醇、乙腈（均为色谱纯） 美国Fisher公司；二氯甲烷（色谱纯）、乙酸铵（色谱纯）；碱性橙（C.I.11270） 上海安谱科学仪器有限公司；酸性橙Ⅱ （纯度87.0%）、罗丹明B（纯度95.0%） 德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；苏丹红Ⅰ（纯度96.1%）、苏丹红Ⅱ（纯度87.5%）、苏丹红 （纯度91.2%）、苏丹红Ⅳ （纯度82.5%） 中国计量科学研究院。

1.2 仪器与设备

LC-10ATvp高效液相色谱系统（配有二极管阵列检测器和CLASS-VP色谱工作站） 日本岛津公司； Millipore纯水系统 美国Millipore公司；3K15离心机 美国Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：X bridge C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.02 mol/L乙酸胺溶液（B）；梯度洗脱程序：0～5.0 min，35%～60% A；5.0～10.0 min，60%～90% A；10.0～26.0 min，90%～90% A；26.0～30.0 min，90%～35% A。

1.3.2 样品处理

称取2 g样品于50 mL带盖离心管中，加入10mL乙腈，涡旋混匀后超声提取20 min，10000 r/min离心10 min，取上清液于另一离心管中，残渣用10 mL乙腈再提取1次，合并上清液，定容至20 mL。提取液中加入2.5 mL水和约0.5 g氯化钠，涡旋混匀后冷冻放置2h，取出后10000 r/min离心10 min，取乙腈层进行液相色谱分析。

1.3.3 标准曲线绘制

酸性橙Ⅱ、碱性橙Ⅱ、罗丹明B标准物质分别用纯水溶解，乙腈定容配制质量浓度为1000 mg/L（按纯度标示折算）的单标准储备液。苏丹红Ⅰ～Ⅳ标准物质分别用二氯甲烷溶解，乙腈定容配制质量浓度为1000 mg/L（按纯度标示折算）的单标准储备液。再分别准确吸取质量浓度为1000 mg/L的单标准储备液各10 mL于100 mL容量瓶中，用乙腈定容得100 mg/L的7 种混合标准溶液。使用时用流动相将混合标准溶液稀释成0.05、0.1、0.5、1、5、10、15 mg/L质量浓度的标准溶液进行高效液相色谱分析，以标准工作液的质量浓度为横坐标，各物质的峰面积为纵坐标，绘制各物质标准曲线。

1.3.4 回收率实验

添加回收率实验样品处理同1.3.2节，以辣椒粉为典型代表，在辣椒粉样品中7 种被测物质的添加量为2.5、5、10 mg/kg。

2 结果与分析

2.1 检测波长的选择

由于目标化合物的化学结构不同，每种物质的最大吸收波长有所区别；7种染料的最大吸收波长在410～550 nm之间。为减少数据分析时间在兼顾灵敏度的前提下选择适宜分析波长，本实验采用碱性橙Ⅱ在410 nm波长处测定；酸性橙Ⅱ、苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ在485 nm下测定；苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ在510 nm波长处测定；罗丹明B在550 nm波长处测定。

2.2 流动相的选择

苏丹红所需流动相组成简单，一般为甲醇-水、乙腈-水。苏丹红水溶性低，为获得适宜的柱效和保留时间，流动相中有机相含量通常较高；酸性橙Ⅱ、碱性橙Ⅱ及罗丹明B亲水性强，流动相中乙酸铵对酸性橙Ⅱ、碱性橙Ⅱ、罗丹明B分离影响较大。如图1所示，通过对流动相中0、0.02、0.03 mol/L乙酸铵进行对比，不添加乙酸铵不能改善目标化合物峰形及分离，乙酸铵浓度过高在梯度洗脱中与高比例有机相易发生盐结晶，损坏仪器。通过实验对比，选定0.02 mol/L为流动相盐浓度。

图 1 乙酸铵浓度对分离的影响

Fig.1 Effect of ammonium acetate concentration on peak shape

本实验对乙酸铵溶液中酸度变化对分离的影响进行了研究，通过乙酸调节，在pH值为4.1、4.6、5.6进行对比，发现酸性橙Ⅱ、碱性橙Ⅱ、罗丹明B的保留时间会有所变化但均不影响分离，对苏丹红色系列无任何影响，为简化流动相条件本实验选择不调节pH值。

经过反复实验考察，最终确定得到1.3.1节的色谱实验条件，在波长485 nm条件下7 种工业染料的标准物质谱图见图2。

1.酸性橙Ⅱ；2.碱性橙Ⅱ；3.罗丹明B；4.苏丹红Ⅰ；5.苏丹红Ⅱ；6.苏丹红Ⅲ；7.苏丹红Ⅳ。

图 2 标准品色谱图

Fig.2 HPLC chromatogram of 7 industrial synthetic dye standards

2.3 提取条件的选择

本实验选择乙腈、丙酮-水（90∶10，V/V）、乙腈-丙酮（90∶10，V/V）作为提取液进行对比，并对辣椒粉、花椒粉进行提取条件优化实验。图3表明，3 种提取溶剂对碱性橙以外的6种工业染料提取效率没有显著性差异，乙腈对碱性橙的提取效果明显优于丙酮-水（90∶10，V/V）、乙腈-丙酮（90∶10，V/V）的提取效果。为提高提取回收率，采用将20 mL乙腈分2次提取，每次10 mL，回收率满足实验要求，不再进行第3次提取，以简化实验步骤。提取液中加入2.5 mL水和约0.5 g氯化钠，将氯化钠加入乙腈提取液中，增强离子化效应，使乙腈与水分层，同时也使提取目标物更完全地溶于乙腈中。

图 3 提取溶剂对不同染料回收率的影响

Fig.3 Effect of extraction solvents on the average recoveries of industrial synthetic dyes

2.4 线性实验

根据1.3.3节配制不同质量浓度的混合标准溶液，以峰面积为纵坐标、质量浓度为横坐标，分别作出碱性橙Ⅱ、酸性橙Ⅱ、罗丹明B、苏丹红Ⅰ～Ⅳ的标准工作曲线，线性关系实验结果如表1所示。

表 1 线性关系实验结果

Table 1 Linear regression equations and limits of detection of seven industrial synthetic dyes

2.5 方法的检出限、回收率和精密度

表 2 回收率实验（n=5）

Table 2 Results of recovery tests (n = 5)

图 4 辣椒粉空白样品色谱图

Fig.4 Chromatogram of blank sample of chili powder

采用在空白样品中添加标准溶液的方法，对调味品中苏丹红染料进行3次添加回收率重复实验，分别在阴性的辣椒样品基质中添加2.5、5.0 mg/kg和10.0 mg/kg 3 种水平的7 种混合标准溶液，按1.3.2节方法进行预处理，每个水平重复测定5次。分别计算平均回收率和相对标准偏差；以信噪比（RSN）大于3为方法检出限，结果如表2所示。阴性的辣椒样品谱图及加标水平为10 mg/kg的样品加标谱图见图4、5。

图 5 辣椒粉空白样品加标色谱图

Fig.5 Chromatogram of blank sample of chili powder spiked with 7 industrial synthetic dyes

2.6 实际样品测定

本方法建立了同时测定调味品中7 种工业染料的高效液相色谱法，通过对实验条件进行选择和优化，确定了色谱条件，7 种目标物可完全达到基线分离。该方法简单快速，结果准确可靠，适用于调味品中工业合成染料的检测。收集了农贸市场、超市销售的辣椒粉、五香粉、花椒等20个调味品样品采用本实验方法进行7 种工业染料检测，未发现阳性样品。图6、7分别为花椒、五香粉的实际样品测定谱图。

图 6 花椒样品色谱图

Fig.6 Chromatogram of Pericarpium Zanthoxyli

图 7 五香粉样品色谱图

Fig.7 Chromatogram of five-spice powder

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