高效液相色谱-二极管阵列检测器-荧光检测器法测定植物油中的18种多环芳烃

王 峰1，张志杰1，林 慧1，仓义鹏2,*

（1.江苏省产品质量监督检验研究院，江苏 南京 210007；2.宿迁市产品质量监督检验所，江苏 宿迁 223800）

摘 要：建立凝胶渗透色谱法净化样品、高效液相色谱-二极管阵列串联荧光检测器法同时测定植物油中18 种多环芳烃的检测方法。样品经环己烷-乙酸乙酯（1∶1，v/v）溶解，利用凝胶渗透色谱法去除油脂大分子，PAH C18柱分离，乙腈和水作流动相进行梯度洗脱，设置荧光检测程序，以2个发射波长通道同时采集数据，测定油样中的17种多环芳烃，以二极管阵列检测器测定苊烯。结果表明：方法检出限为0.5～4ng/mL，样品回收率在78.65%～103.4%之间，相对标准偏差小于5%。本方法满足德国标准对18 种多环芳烃的同步检测新要求。

关键词：植物油；多环芳烃；高效液相色谱；荧光检测器

Determination of 18 Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Vegetable Oil by High Performance Liquid Chromatography with Diodearry Detector and Fluorescence Detector

WANG Feng1, ZHANG Zhi-jie1, LIN Hui1, CANG Yi-peng2,*

(1. Jiangsu Provincial Supervising & Testing Research Institute for Product Quality, Nanjing 210007, China;

2. Suqian Product Quality Supervision and Testing Institute, Suqian 223800, China)

Abstract: A method has been developed for the simultaneous determination of 18 polycyclic aromatic hydrocarbons in vegetable oil by gel permeation chromatography (GPC) and high performance liquid chromatography with diodearray detector and fluorescence detector (HPLC-DAD-FLD). The samples were dissolved in cyclohexane-ethyl acetate (1:1, V/V), then purified with GPC to remove grease molecules, and separated on a PAH C18 column using acetonitrile and water as the mobile phase with gradient elution. Subjected to 2-wavelength channel data acquisition setting with fluorescence procedure, 17 kinds of polycyclic aromatic hydrocarbons in oil samples were determined. Data acquisition of acenaphthylene was achieved by DAD detector. The detection limit of this method was 0.5–4 ng/mL. The average recovery rate in oil was in the range of 78.65%–103.4% with relative standard deviation (RSD) of less than 5%. This method was satisfactorily used for the simultaneous detection of 18 kinds of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in edible oil, while meeting the new detection requirements of Germany standards for these PAHs.

Key words: vegetable oil; polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs); high performance liquid chromatography (HPLC); fluorescence detector

中图分类号：TS202.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）06-0142-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201406030

多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是由2～7个苯环组成的芳香族化合物，属强致癌、持久性有机污染物（persistent organic pollutants，POPs）。多环芳烃可损伤生殖系统，导致皮肤癌、肺癌等癌症，具有致畸和致突变性[1-2]。目前世界各国对多环芳烃都有严格限制，美国环境保护署将16 种多环芳烃列入优先控制污染物名单[3]；欧洲食品安全局和德意志研究联合会参议院认定2 种剧毒多环芳烃，苯并（j）荧恩和苯并（e）芘，为第2类致癌物质，并将其增加到欧盟化学品注册、评估、许可和限制法规附录XVII（第50项）进行管制[4]。德国GS认证已将管控的多环芳烃种类由16 种增加为18 种[5-6]。我国对水、食用油、熏烤肉和粮食中的苯并（a）芘也有严格限量规定[7]。

目前，对多环芳烃的检测集中于早期标准规定的16 种多环芳烃，对新要求的18 种多环芳烃的测定鲜有报道。检测方法主要有分光光度法[8]、气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法[9-12]、高效液相色谱-荧光检测器（high performance liquid chromatography- fluorescence detector，HPLC-FLD）法[13-14]。其中，分光光度法仅适用于苊、1,2-苯并蒽、苯并（a）芘等少数多环芳烃的测定，且基质干扰较大，但对仪器设备要求较低、检测费用低。GC-MS法引入特征碎片离子，对多组分具有较好的检测能力，但二苯并（a,h）蒽、苯并（g,h,i）芘的沸点高达525℃[15-16]，容易造成污染，并且苯并（j）荧蒽、苯并（b）荧蒽和苯并（k）荧蒽这3种苯并荧蒽难以分离，重质多环芳烃的回收率较低[17-18]。HPLC-FLD法的检出限较低，且具有较高的选择性[19]，但对18 种多环芳烃的同步分离，尤其是同分异构体苯并（e）芘和苯并（j）荧蒽的分离效果欠佳，并且受食用油的基质干扰较严重。

本研究利用凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC）去除植物油中大分子的干扰、高效液相色谱-二极管阵列检测器-荧光检测器（HPLC-diodearry detector-FLD，HPLC-DAD-FLD）法，建立了植物油中18 种多环芳烃的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

植物油 市售；乙腈、环己烷、丙酮、乙酸乙酯（均为色谱纯） 美国Tedia公司。

1.2 仪器与设备

1260型高效液相色谱仪（配有二极管阵列检测器、荧光检测器） 美国Agilent公司；凝胶渗透净化色谱仪 德国LCTech公司；艾科浦超纯水机 重庆颐洋企业发展有限公司。

18 种多环芳烃混合标准物质：萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并（a）蒽、屈、苯并（j）荧蒽、苯并（e）芘、苯并（b）荧蒽、苯并（k）荧蒽、苯并（a）芘、二苯并（a,h）蒽、苯并（g,h,i）芘、茚并（1,2,3-c,d）芘，质量浓度均为1μg/mL 美国o2si公司。

1.3 方法

1.3.1 样品净化

考察固相萃取（填料为中性氧化铝）法和GPC法净化植物油样品的净化效果。固相萃取法：参照GB/T 22509—2008《动植物油脂：苯并（a）芘的测定》[20]；GPC法：植物油样中加入18种多环芳烃标准溶液，设定流速为5mL/min，分20个小瓶收集，每瓶收集2min，通过分段收集和荧光分析，以确定18种多环芳烃的洗脱时间。

1.3.2 样品前处理

称取1g植物油样品于10mL试管中，以乙酸乙酯-环己烷（1∶1，v/v）定容后，充分混匀，将稀释液转移至GPC配备的样品瓶中，进行净化，将收集的洗脱液用N2吹至近干，以乙腈定容至1mL，过0.22μm有机相滤膜后待测。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：Eclipse PAH C18柱（4.6 mm×50 mm，1.8 μm）；柱温18℃；流动相：水和乙腈，梯度洗脱程序；进样量10μL；流速1.0 mL/min；检测器：DAD（230 nm）和FLD。由于18种多环芳烃的最佳激发波长和发射波长各不同，而每台仪器的最佳波长参数又略有不同，因此根据所使用仪器的扫描结果结合文献[21-23]，确定各个物质的最佳激发波长和发射波长。

1.3.4 方法的回收率和精密度

取大约40 g植物油至圆底烧瓶中，加入2 g活性炭，旋转蒸发仪中90 ℃加热2h，离心后上层清液过0.45 μm滤膜，作为空白样品，添加18种多环芳烃标准品至其质量浓度为5 μg/kg，按优化后的方法平行测定6次，计算平均回收率和精密度。

2 结果与分析

2.1 样品前处理优化

比较了氧化铝固相萃取小柱和GPC法对植物油样品的净化效果。结果发现，采用氧化铝固相萃取柱净化油样，对多环芳烃中最常检测的BaP影响不大，但对前10 min出峰的轻质多环芳烃（Naph、Acy、Ace、Flu、Phe、Ant、Fla和Pyr）影响特别大。主要原因是测定BaP时，采用的激发波长（λEx）为384 nm，发射波长（λEm）为406 nm；而测定前10 min出峰的多环芳烃时，采用的激发波长为260 nm，导致样品中部分杂质出峰形成干扰，因而以中性氧化铝为填料的固相萃取小柱不适用于多环芳烃检测。而经GPC净化的样品，有效去除了植物油中的大分子干扰物质，在24～50 min内可以将18种多环芳烃收集完全，故本实验采用GPC净化食用油样品[5]。

2.2 检测波长的选择

18种多环芳烃的检测波长见表1。Acy基本无荧光吸收，用DAD检测。

BjF和BeP是同分异构体，难以用Eclipse PAH C18柱分离。在λEx=315 nm、λEm=512 nm处，BeP无荧光峰，而BjF有很强的荧光峰；在λEx=315 nm、λEm=400 nm处，BjF无荧光峰，而BeP有很强的荧光峰（图1）。因此可以利用λEx=315 nm、λEm=512 nm和λEx=315 nm、λEm=400nm的
2个荧光波长通道分别进行测定，解决BjF和BeP 2种物质较难分离的问题[25]。

表 1 18种多环芳烃的荧光波长

Table 1 Fluorescence wavelengths of 18 PAHs

注：—. 无最佳激发和发射波长。

A.苯并（j）荧蒽

B.苯并（e）芘

图 1 不同荧光发射波长下苯并（j）荧蒽和
苯并（e）芘的色谱图

Fig.1 HPLC chromatograms of benzo (j) fluoranthene and benzo (e) pyrene at different fluorescence emission wavelengths

采用多发射波长模式，测定18种多环芳烃。将检测波长设为2个通道：一个通道λEx=315 nm、λEm=400nm，测定BeP；另一个通道，根据各物质的最佳激发、发射波长（表1）和保留时间设置荧光检测程序，测定其余16种多环芳烃。

2.3 柱温

不同的柱温对多环芳烃分离度和出峰时间有一定影响。在保持梯度洗脱条件、色谱柱和检测波长不变的情况下，分别设置3个不同的柱温（18、15℃和25℃），比较不同柱温对色谱峰的分离度和出峰时间的影响。结果表明，随柱温的升高，出峰时间缩短、分离度变差。综合考虑，采用18℃的柱温。

2.4 梯度洗脱条件的选择

乙腈和水的不同配比直接影响多环芳烃出峰的时间。本实验中，乙腈含量的比例高时，出峰较快，但Ace和Flu，BjF、BeP和BbF，DhA和BgP都难以分离开。经过优化，设置梯度洗脱程序为：A相为水，B相为乙腈，0～3.5 min，55% B；3.5～10 min，55%～90% B；10～15.5 min，90%～100% B；15.5～18min，100% B；18～20min，100%～55% B；20～22min，55% B。在该梯度洗脱程序下，多环芳烃取得较好分离（图2），各个组分的保留时间见表1。

图 2 18种标准物质的荧光色谱图

Fig.2 Fluorescence chromatograms of 18 PAH standards

2.5 线性范围及检出限

以乙腈为溶剂，配制质量浓度为0.5、1、4、10、50ng/mL的18种多环芳烃混合标准系列工作液，按照优化的实验条件进行测定。以各组分的峰面积（y）为纵坐标，质量浓度（x）为横坐标，绘制标准曲线。结果表明，Flu、Phe、Ant、Pyr、BaA、CHR、BbF、BkF和BaP线性范围为0.5～50ng/mL；Naph、Ace、Fla、BjF、BeP、DhA、BgP和IcP线性范围为1～50ng/mL；Acy线性范围为4～50ng/mL。本法线性范围很宽，但实际植物油样品中多环芳烃的含量较低，因此需要根据实际情况确定线性范围、绘制标准曲线。

配制接近方法检出限的标准样品，重复测定7次，以信噪比为3时对应质量浓度作为18种多环芳烃的方法检出限，结果见表2。

2.6 方法的回收率和精密度

表 2 各化合物的线性范围、线性方程、相关系数、添加回收率及检出限

Table 2 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients, spike recoveries and limits of detection

由表2可知，18种多环芳烃的方法检出限为0.5～4ng/mL，平均回收率在78.65%～103.4%。方法的相对标准偏差为0.9%～4.5%，方法精密度良好。

2.7 实际样品分析

采用所建立的方法，对10 种市售品牌食用植物油进行分析。结果表明，10 份食用植物油样本中，只有Acy和Ace没有检出，其余均有检出。10 份食用植物油样本中的18种多环芳烃总含量最低为1.2 μg/kg，最高为201.52μg/kg，大多数样品的含量为30μg/kg左右。

3 结 论

采用HPLC-DAD-FLD方法，可在25min内完成18种多环芳烃的测定。结果表明，该方法检测效率高、线性范围宽、检出限低、实用性强，可用于植物油中18种多环芳烃的检测。本方法满足德国标准对18种多环芳烃同步检测的新要求。

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