核桃饼粕对大鼠学习、记忆和抗氧化功能的影响

樊永波，陶兴无*，马 琳，刘烈炬，刘志国，王丽梅

(武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北 武汉 430023)

摘 要：目的： 研究核桃饼粕对大鼠学习、记忆和抗氧化功能的影响及其相关机制。方法：64只大鼠随机分成8组：正常饲料组、大豆饼粕2.5g/(kg•d)组、核桃油2.5mL/(kg•d)组、核桃仁3.0g/(kg•d)组和核桃饼粕1.0、2.0、3.0、4.0g/(kg•d)组，连续喂养60d，进行跳台实验及Morris水迷宫行为学测试，并测定大鼠脑组织超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、乙酰胆碱酯酶(AChE)和一氧化氮合酶(NOS)的含量。结果：适量喂食核桃饼粕可明显改善大鼠在跳台及Morris水迷宫实验中的成绩，提高大鼠脑组织SOD活性，降低MDA含量，增强AChE的活性。结论：核桃饼粕能明显改善大鼠学习、记忆能力和抗氧化功能。

关键词：核桃饼粕；学习记忆；抗氧化；跳台；Morris水迷宫

Effects of Defatted Walnut Meal on Learning and Memory Ability and Antioxidant Capacity of Rats

FAN Yong-bo，TAO Xing-wu*，MA Lin，LIU Lie-ju，LIU Zhi-guo，WANG Li-mei

(Department of Biological and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China)

Abstract：Objective: To explore the effect of defatted walnut meal on learning and memory ability and antioxidant capacity in rats and its corresponding mechanisms. Methods: Totally 64 rats were randomly divided into eight groups: normal feed group, defatted soybean meal (2.5 g/(kg•d)) group, walnut oil (2.5 mL/(kg•d)) group, walnut (3.0 g/(kg•d))) group and defatted walnut meal groups at doses of 1.0, 2.0, 3.0 g/(kg•d) and 4.0 g/(kg•d). Following continuous feeding for 60 days, Step-down and Morris water maze tests were used to evaluate the learning and memory ability of rats. The contents of superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA), acetylcholinesterase (AChE) and nitric oxide synthase (NOS) in brain tissues of rats were determined. Results: Moderate consumption of defatted walnut meal could greatly improve the performance of Step-down and Morris water maze tests, increase the activities of SOD and AChE in brain tissues of rats and reduce MDA level. Conclusion: Defatted walnut meal can obviously improve the learning and memory abilities and antioxidant capacity of rats.

Key words：defatted walnut meal；learning and memory；antioxidant；step-down test；Morris water maze test

中图分类号：R151.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)17-0323-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201317068

核桃是营养价值很高的干果，核桃仁含有丰富的蛋白质、不饱和脂肪酸、维生素及矿物质[1]。核桃饼粕是核桃仁脱脂后的产物，蛋白质含量丰富且易于消化，其中谷蛋白70%，球蛋白18%，白蛋白7%以及其他醇溶性蛋白质[2]。核桃饼粕中氨基酸种类齐全，且8种人体必需氨基酸比例合理，其中精氨酸、谷氨酸和天冬氨酸含量较高。核桃的健脑功能为人们所共知，但其能够增强学习和记忆功能的具体组分(核桃油和核桃饼粕)尚不清楚。研究表明，核桃饼粕是核桃仁主要的抗氧化部分[3]。本实验分别以核桃仁、核桃油及不同剂量的核桃饼粕喂养发育期大鼠，以普通饲料和大豆饼粕作为对照，利用跳台实验及Morris水迷宫实验测定其对大鼠学习和记忆能力的影响，并对其抗氧化功能进行相关检测，以探讨其作用机制，促进核桃饼粕的开发利用。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

核桃、大豆均在超市采购，脱脂[4]后核桃饼粕蛋白质含量(凯氏定氮法)59.6%，粗脂肪含量(索氏提取法)4.7%，大豆饼粕蛋白质含量44.5%，粗脂肪含量3.6%。正常饲料由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供，蛋白质含量26.4%，粗脂肪含量2.7%。

超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒、乙酰胆碱酯酶(AChE)测定试剂盒、一氧化氮合酶(NOS)测定试剂盒、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒 南京建成生物工程研究所，其他试剂均为分析纯。所有实验用水均为蒸馏水。

YLS-3TB型跳台记录仪 济南益延科技发展有限公司；DMS-2 Morris水迷宫系统 中国医学科学院药物研究所；DY89-I型电动玻璃匀浆机 宁波新芝科器研究所；TGL-16M型高速离心机 长沙平凡仪器仪表有限公司；WH-1微型漩涡混合仪 上海沪西分析仪器厂有限公司；7200型分光光度计 上海光谱仪器有限公司；HH-6数显恒温水浴锅 国华电器有限公司。

1.2 实验动物

清洁级初断乳雄性SD大鼠64只，体质量(70±10)g，由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供。

1.3 方法

1.3.1 动物分组与喂养

初断乳雄性SD大鼠64只，随机分为8组，每组8只。每组大鼠饲料喂食量相同，每天定量投放饲料，以使大鼠能够全部食用完，自由饮水，连续60d，每2d称质量1次。正常饲料组(NF)喂食由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供的饲料，核桃油2.5mL/(kg•d)组(WO)按剂量要求每天灌胃1次，其余6组喂食由核桃或饼粕添加至正常饲料配制成的特殊实验饲料，根据大鼠体质量改变核桃或饼粕的添加量：大豆饼粕2.5g/(kg•d)组(SM)、核桃仁3.0g/(kg•d)组(WN)、核桃饼粕1.0g/(kg•d)组(WM1)、核桃饼粕2.0g/(kg•d)组(WM2)、核桃饼粕

3.0g/(kg•d)组(WM3)、核桃饼粕4.0g/(kg•d)组(WM4)。

1.3.2 跳台实验

跳台实验时先将大鼠放入装置中适应3min，然后通以36V交流电，大鼠受到电击后，其正常反应是跳到平台上躲避电击，记录通电后大鼠跳上平台的时间，作为反应期；观察5min内受到电击的次数为错误次数，以反应期和错误次数作为学习成绩。24h后重复实验，先将大鼠放在平台上，即刻通电，观察5min内大鼠从台上跳到铜栅上的时间为潜伏期，受到电击的次数为错误次数，以潜伏期和错误次数作为记忆成绩。

1.3.3 Morris水迷宫实验

水迷宫为直径150cm，高50cm的圆形水池，水温保持(22±1)℃，迷宫上方安置有显示系统的摄像机，同步记录大鼠运动轨迹。将水池等分为4个象限，平台置于第2象限水平面下2cm处，分别以4个象限的中间位置为入水点，训练期间迷宫外的参照物保持不变，实验前1d让大鼠自由游泳2min适应环境。定位航行实验：将大鼠依次从4个象限入水点面向池壁放入水池中，记录其90s内找到平台的时间，即逃避潜伏期；如果90s内未找到平台，则将其牵引至平台，并在平台上停留15s，潜伏期记为90s，每次训练间隔15s。共训练4d，以第4天的逃避潜伏期作为最终成绩，观察并记录大鼠找到平台的路线图。空间搜索实验：第5天进行空间搜索实验，撤除平台，随机选择一个入水点，记录大鼠90s内穿越原平台位置的次数及有效时间(即原平台所在象限停留时间)，检测大鼠的学习记忆能力。

1.3.4 生化指标SOD、MDA、AChE和NOS的检测

大鼠用20%乌拉坦麻醉后断头处死，在冰盘上迅速取其大脑，用预冷的生理盐水冲洗，并制成10%的脑组织匀浆，高速低温离心，取上清，按照试剂盒要求进行SOD、MDA、AChE和NOS的检测。

1.4 数据处理及统计分析

采用SPSS 13.0统计软件中的单因素方差分析和LSD检验对所得数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 核桃饼粕对大鼠跳台和Morris水迷宫实验学习的影响

表 1 核桃饼粕对大鼠跳台实验学习的影响(

x

±s，n=8)

Table 1 Effect of defatted walnut meal on learning and memory ability of mice in step down test (

x

±s，n=8)

注：a.与NF比较，有显著性差异(P＜0.05)；c.与SM比较，有显著性差异(P＜0.05)；e.与WO比较，有显著性差异(P＜0.05)。

跳台实验结果如表1所示，在学习成绩方面，WM3与WO比较，反应期明显缩短(P＜0.05)；在记忆成绩方面，核桃饼粕各组潜伏期都有延长的趋势，WM1和WM3与NF比较，从安全台跳下的潜伏期明显延长(P＜0.05)，WM1比WO的潜伏期明显延长(P＜0.05)；WM1、WM2、WM3和WN与NF及SM比较，5min内大鼠遭受电击次数明显减少(P＜0.05)。由此可知，喂食核桃饼粕能提高大鼠的学习和记忆成绩。

由表1还可以看到，核桃饼粕高剂量组WM4与WM1、WM2及WM3比较，实验数据尽管无显著性差异，但学习成绩和记忆成绩均出现下降的现象，即随着核桃饼粕剂量的提高，大鼠学习和记忆能力反而有下降的趋势。根据跳台实验结果可知，喂食核桃饼粕能提高大鼠的学习和记忆成绩，但添加量不宜过大。

表 2 核桃饼粕对大鼠Morris水迷宫实验学习的影响(

x

±s，n=8)

Table 2 Effect of defatted walnut meal learning and memory ability of mice in Morris water maze test (

x

±s，n=8)

注：a.与NF比较，有显著性差异(P＜0.05)；b.与NF比较，有极显著性差异(P＜0.05)；c.与SM比较， 有显著性差异(P＜0.05)；d.与SM比较，有极显著性差异(P＜0.01)；e.与WO比较，有显著性差异(P＜0.05)。

Morris水迷宫实验如表2所示，核桃饼粕4个剂量组和WN比NF及SM的逃避潜伏期明显缩短(P＜0.05，P＜0.01)，WN比WO的潜伏期明显缩短(P＜0.05)；核桃饼粕4个剂量组、WO和WN的有效时间比NF明显延长(P＜0.05，P＜0.01)；WM1、WM3、WM4、WO和WN的穿越平台次数比NF和SM明显增多(P＜0.05，P＜0.01)，核桃饼粕各剂量组间无显著性差异。可见喂食核桃饼粕、核桃油、核桃仁都能够提高大鼠的空间学习记忆能力。综合跳台和Morris水迷宫实验结果：与NF比较，WN、WO及核桃饼粕各剂量组都有提高大鼠的学习和记忆能力的趋势。总体而言，核桃饼粕各剂量组大鼠的学习和记忆能力较强于WO，可见核桃饼粕可能是整个核桃健脑功能的主要部分，但随着核桃饼粕剂量的提高，大鼠学习和记忆能力有下降的趋势，具有剂量依赖性，过高的剂量反而不能更好的提高大鼠学习和记忆能力。此外，WO摄入的脂肪量明显高于核桃饼粕组，而蛋白摄入量低于核桃饼粕组。因此，摄入较低剂量的核桃油和适量的核桃饼粕有利于大鼠学习和记忆能力的提高。核桃饼粕组大鼠学习和记忆能力明显高于SM，可能与其中某些氨基酸的含量不同有关：核桃蛋白中的精氨酸含量比大豆蛋白高得多，谷氨酸的含量也较高。

2.2 大鼠脑组织生化指标测定结果

表 3 核桃饼粕对大鼠脑组织中SOD、MDA、AChE、NOS活性的影响 (

x

±s，n=8)

Table 3 Effect of defatted walnut meal on the activities of SOD, MDA, AChE and NOS in brain tissues of mice (

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±s，n=8)

注：a.与NF比较，有显著性差异(P＜0.05)，b.与NF比较，有极显著性差异(P＜0.05)；e.与WO比较，有显著性差异(P＜0.05)；f.与WN比较，有显著性差异(P＜0.05)，g.与WN比较，有极显著性差异(P＜0.01)；h.与WM2比较，有显著性差异(P＜0.05)。

大鼠脑组织的生化指标检测结果如表3所示，WM2和WM3的SOD活性与NF比较有明显提高(P＜0.05)；WM2的SOD活性比WN明显提高(P＜0.05)；WM3的MDA含量比NF组明显降低(P＜0.01)。SOD和MDA指标能反映脑组织抗氧化能力：SOD是机体内清除超氧阴离子自由基保护细胞免受损失的主要酶，MDA是体内脂质过氧化物的最终产物，间接反应了机体细胞受自由基攻击的严重程度[5]。研究表明，核桃饼粕中含有少量褪黑素(约3.5ng/g)，长时间喂食核桃能够明显提高大鼠血液中褪黑素的含量[6]，褪黑素能改善D-半乳糖模型大鼠学习记忆能力和提高大脑海马区SOD活性、降低MDA的含量[7]。同时核桃饼粕中的酚类复合物和黄酮类化合物有着很强的抗氧化活性[8]。在本实验中，与NF相比，WM3能够明显提高大鼠脑组织SOD含量(P＜0.05)，降低MDA含量(P＜0.01)，核桃饼粕各组都有提高大鼠的抗氧化能力的趋势。由此可见，核桃饼粕能够增强大鼠的学习记忆和抗氧化能力，可能与核桃饼粕中含有褪黑素、酚类复合物和黄酮类化合物有关。

由表3可知，WM1和WM3的AChE酶活比NF、WN及WM2明显增加(P＜0.05，P＜0.01)，SM的AChE酶活比WN明显增加(P＜0.05)。AChE是胆碱能神经递质乙酰胆碱水解酶，其活力可以反映乙酰胆碱在脑内的代谢率的变化，脑内胆碱能系统在认知功能尤其是记忆中发挥着重要作用[9]。研究表明，血管性痴呆大鼠学习和记忆能力的提高，伴随着脑内AChE活性的上升[10]。在本实验中，WO的AChE酶活比NF并无明显增加，可见核桃油提高大鼠学习记忆能力与AChE活性关系不大。而WM1、WM3与NF相比，能够明显提高大鼠脑内AChE的活性(P＜0.05)，表明核桃饼粕能够提高大鼠的学习和记忆能力，可能与胆碱能系统有关。

从表3还可以看到，WM1、WM2、WM3和SM的NOS的活性比WN明显提高(P＜0.01)，WM2的NOS活性与WO差异显著(P＜0.05)。一氧化氮(NO)作为中枢神经系统(CNS)细胞间信使分子，在学习和记忆机制中具有重要作用[11]。NOS是催化产生内源性NO的唯一酶，很大程度上决定了NO的生物学效应。在本实验中，WM1、 WM2和 WM3的NOS活性明显高于WN或WO，可见核桃饼粕能够提高大鼠的学习记忆能力可能与NOS活性提高有关，适量喂食核桃饼粕有利于提高大鼠脑内NOS的活性。

3 结 论

综上所述，适量喂食核桃饼粕可明显改善大鼠在跳台及Morris水迷宫实验中的成绩，提高大鼠脑组织的SOD活性，降低MDA含量，增加AChE活性。核桃饼粕能明显提高大鼠学习和记忆能力，改善大鼠的抗氧化功能。

本实验结果为核桃饼粕的开发利用，特别是制定核桃饼粕的合理食用量，研制抗衰老、益智产品提供了参考依据。目前国内对核桃的研究主要集中在对核桃油脂的营养价值研究[12-13]以及对核桃蛋白的提取工艺研究[14-16]等方面，而对核桃饼粕的营养功能研究报道较少。核桃饼粕作为核桃提取核桃油后的剩余产物，对其进行深加工及利用显得非常必要。但核桃饼粕中能够提高大鼠学习和记忆能力的具体成分及其作用机制，有待于进一步实验探讨。此外，实验中如能同时测定血清和肝脏中的相关生化指标，将有助于对核桃饼粕生物功能的全面了解。

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