百合多糖纯化及分子质量测定

陈志刚，朱 泉，王 芬

(南京农业大学食品科技学院，农业部农畜产品加工与质量控制重点实验室，江苏 南京 210095)

摘 要：以宜兴百合为原料，采用超声辅助热水法提取百合多糖。百合粗多糖经Sevag脱蛋白，透析后用DEAE-Sepharose Fast Flow及Sephadex G-100色谱柱纯化，得到百合多糖组分LLPS-1、LLPS-2和LLPS-3。经考马斯亮蓝、紫外光谱及高效凝胶过滤色谱(HPGFC)检测，3种百合多糖不含蛋白及核酸，具有较高纯度。经HPGFC测定，3种百合多糖的重均分子质量分别是350.5、403.3kD和146.2kD。

关键词：百合多糖；纯化；柱层析；高效凝胶过滤色谱；分子质量

Purification and Molecular Mass Determination of Lily Polysaccharides

CHEN Zhi-gang，ZHU Quan，WANG Fen

(Key Laboratory of Agricultural and Animal Products Processing and Quality Control, Ministry of Agriculture,

College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Abstract：Microwave-assisted hot-water extraction method was used to extract lily polysaccharides. Fractions LLPS-1, LLPS-2 and LLPS-3 were isolated from the aqueous polysaccharide extract and purified through deproteinizaiton by Sevag’s method, dialysis, DEAE-Sepharose Fast Flow chromatography and Sephadex G-100 column chromatography. Results from coomassie blue staining, UV and high-performance gel permeation chromatography (HPGPC) showed that the purified product contained neither protein or nucleic acid. The molecular weights of LLPS-1, LLPS-2 and LLPS-3 were 350.5, 403.3 kD and 146.2 kD, respectively.

Key words：lily polysaccharides；purification；column chromatography；HPGPC；molecular weight

中图分类号：TS244.5；TS247 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)17-0001-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201317001

百合(Lilium brownie var. viridulum)是国家卫生部审批通过的首批药食两用品之一，不仅在临床上有着广泛的应用，而且还具有很好的保健作用。目前在我国栽培面积较大的百合品种主要有宜兴百合、龙牙百合及兰州百合等。百合中除含有丰富的淀粉、蛋白质、脂肪、氨基酸、维生素和微量元素等营养物质外，还含有多糖、生物碱、皂苷等多种生物活性成分[1-4]。多年来，百合常被用作食品原料加工成百合粉、百合干、百合罐头、百合晶等，而对其多糖等活性成分的提取分离纯化及结构鉴定研究较少[3,5-7]。百合多糖是百合主要功能因子之一，研究发现百合多糖具有抗肿瘤、抗氧化和增强免疫力等多种生物医药功能[6-12]。本研究以宜兴百合为原料，采用超声辅助热水法提取其多糖，而后进行分离纯化、纯度检测及分子质量测定研究，为百合多糖在食品、医药等行业的应用提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

百合原料 宜兴市湖滨百合科技有限公司。

氯仿 上海凌峰化学试剂有限公司；正丁醇 上海申博化工有限公司；乙醇、乙醚、硫酸、苯酚 中国医药集团上海化学试剂公司。

1.2 仪器与设备

UV-2450紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；Waters 600高效液相色谱仪系统(配柱温箱，2410示差折光检测器)、UltrahydrogelTM Linear色谱柱 美国Waters公司。

1.3 百合多糖超声辅助提取

干燥百合经破碎，称取115.33g，加入无水乙醇，于45℃回流8h。称取脱脂后的百合粉，加去离子水及果胶酶(酶用量10U/mL、pH5.0、温度50℃、时间1h)，而后进行热水浸提，提取条件为温度62℃、时间8h、液料比19:1(V/m)。浸提过程中每隔0.5h超声3min，超声功率为270W。浸提液冷却后于4000r/min离心15min，取上清液，沉淀物用同样的方法重新提取2次，重提液再离心，取上清液。合并上清液，经旋转蒸发器55℃减压浓缩3～4倍。

1.4 百合多糖Sevag法除蛋白

浓缩过的百合多糖提取液用Sevag法去除游离蛋白。提取液中加入1/2溶液体积的Sevag试剂(氯仿、正丁醇体积比为5:1)，剧烈振荡10min，分液漏斗静置使其分层，除去下层有机相。上层10000r/min离心15min，留其上清液。上清液继续加入1/2溶液体积的Sevag试剂，重复操作3次。合并上清液，加入4倍体积的无水乙醇(乙醇终体积分数为80%)，置于4℃冰箱静置过夜。4000r/min离心20min，取沉淀物并用50℃抽真空干燥，即可得黄白色百合粗多糖。多糖样品中总糖含量采用苯酚-硫酸法测定。粗多糖得率按照式(1)计算。

(1)

1.5 百合粗多糖DEAE-Sepharose Fast Flow色谱初步分离

准确称取0.095g百合粗多糖溶于5mL去离子水中，加样于层析柱(1.6cm×25cm)。依次以去离子水、0.1、0.2、0.4、0.6、1mol/L NaCl溶液梯度洗脱，流速为1mL/min。自动部分收集器收集洗脱液，每管收集3mL，每梯度30管。苯酚-硫酸法隔管检测多糖含量。以收集的管数为横坐标，A490nm为纵坐标，绘制DEAE-Sepharose Fast Flow洗脱曲线图。合并各洗脱峰洗脱液，50℃旋转蒸发浓缩，去离子水透析，用电导率仪检测透析液的电导率，直至电导率不变为止，最后将透析液真空冷冻干燥。

1.6 Sephadex G-100色谱进一步纯化

分别称取0.015g经DEAE-Sepharose Fast Flow分离后的各多糖组分，溶于1.5mL去离子水中，上样于Sephadex G-100层析柱(1.6cm×45cm)。用去离子水洗脱，流速为0.5mL/min。自动部分收集器收集洗脱液，每管收集3mL，苯酚-硫酸法隔管检测多糖含量。以收集的管数为横坐标，A490nm为纵坐标，绘制Sephadex G-100色谱柱洗脱曲线图。合并各洗脱峰洗脱液，50℃旋转蒸发浓缩，去离子水透析，用电导率仪检测透析液的电导率，直至电导率不变为止，最后将透析液真空冷冻干燥。纯化多糖得率按照式(2)计算。

(2)

1.7 百合多糖组分纯度鉴定及分子质量测定

多糖样品的纯度鉴定采用考马斯亮蓝法，紫外光谱扫描和高效凝胶过滤色谱法(HPGFC)测定。分子质量采用HPGFC测定。色谱条件：Waters 600高效液相色谱仪；UltrahydrogelTM Linear色谱柱(300mm×7.8mm)；2410示差折光检测器(RID)；流动相：0.1mol/L NaNO3；流动相流速：0.9mL/min；进样体积：20μL；柱温：45℃。

2 结果与分析

2.1 百合多糖超声辅助提取

利用超声波产生的强烈振动、高的加速度、强烈的空化效应和搅拌作用等能加速有效成分进入溶剂，缩短提取时间，节约溶剂和能源；同时低温提取有利于有效成分的保护，避免了温度过高导致部分成分分解，从而提高了提取效率。百合鳞茎经破碎、脱脂、超声辅助热水(62℃)浸提后，再经离心浓缩、Sevag法除蛋白、80%乙醇沉淀及离心取沉淀，真空干燥，得百合粗多糖。粗多糖得率为(9.46±0.35)%，呈黄白色固体。目前对于百合的提取已有一些研究，所报道的百合粗多糖得率差异较大，原因主要有两方面[13-15]：一是采用的原料不同；二是采取的方法(尤其是浸提时间)不同。

2.2 百合粗多糖的DEAE-Sepharose Fast Flow色谱法初步分离

图 1 百合多糖在DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱上的洗脱曲线

Fig.1 Elution curve of crude LLPS on DEAE-Sepharose Fast Flow column

经Sevag法除蛋白后，百合粗多糖仍含有少量蛋白及色素等杂质，需要进一步分离纯化。利用DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱对百合多糖进行初步分离，采用不同溶剂体系对样品进行洗脱。由图1可知，百合粗多糖经DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱分离后得到3个主要组分，分别是去离子水洗脱的组分F1、0.1mol/L NaCl溶液洗脱的组分F2和0.2mol/L NaCl溶液洗脱的组分F3。将得到的3个初步纯化产品F1、F2和F3用凝胶层析柱进一步纯化。

2.3 百合多糖Sephadex G-100色谱法进一步纯化

利用Sephadex G-100层析柱对经DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱初步分离的F1、F2和F3共3个组分分别进行进一步纯化，结果见图2。初步分离的3个组分经Sephadex G-100进一步纯化后各得到1个纯化组分，分别命名为LLPS-1、LLPS-2和LLPS-3。将这3个纯化组分分别收集，50℃旋转蒸发浓缩，真空冷冻干燥，得到白色百合多糖纯化产品。3个纯化组分LLPS-1、LLPS-2和LLPS-3的得率分别是1.66%、1.71%和0.28%。柱层析是有效分离天然活性成分的常用方法[16-22]。多糖的分离纯化常用的柱层析方法有凝胶柱层析和离子交换柱层析两类[17,18,20,22]，由于不同研究者采用的柱层析方法不同，洗脱时溶剂体系不同，常会得到不同的多糖组分[3,7,15]。

图 2 百合多糖初步分离组分F1(a)、F2(b)、F3(c)在Sephadex G-100

层析柱上的洗脱曲线

Fig.2 Elution curve of LLPS fraction F1(a), F2(b) and F3(c) on Sephadex G-100 column

2.4 百合多糖组分纯度鉴定及分子质量测定

图 3 百合粗多糖(LLPS)及纯化组分(LLPS-1、LLPS-2及LLPS-3)

的紫外光谱图

Fig.3 UV-Spectra of crude LLPS, LLPS-1, LLPS-2 and LLPS-3

图 4 百合多糖纯化组分LLPS-1(A)、LLPS-2(B)、LLPS-3(C)分子质量的高效凝胶过滤色谱图

Fig.4 HPGPS Profiles of LLPS-1 (A), LLPS-2 (B) and LLPS-3(C) obtained from measuremenl of relative molecular weight

首先采用考马斯亮蓝法测定LLPS-1、LLPS-2和LLPS-3多糖的蛋白含量，结果表明3种多糖并不含有蛋白，但在粗多糖中蛋白含量为(3.61±0.27)%。其次利用紫外-可见分光光度计对百合粗多糖(LLPS)及其纯化产品进行紫外光谱扫描。由图3可知，粗多糖在260～280nm附近有弱吸收峰，而纯化组分在260～280nm附近无吸收峰，表明粗多糖中含有少量核酸或蛋白质，而LLPS-1、LLPS-2和LLPS-3中不含有核酸和蛋白质，与考马斯亮蓝法测定结果一致。

为进一步检验3种多糖样品的纯度，采用高效凝胶过滤色谱法进行鉴定分析，同时测定其分子质量。由图4可知，LLPS-1、LLPS-2和LLPS-3 3个组分经高效凝胶过滤色谱检测，仅出现单一、相对对称的洗脱峰。表明百合粗多糖经DEAE-Sepharose Fast Flow和Sephadex G-100层析柱分离纯化后得到的3组分均为相对均一的多糖组分，具有较高的纯度。以标准多糖重均分子质量的对数值(lgMw)为纵坐标、保留时间(TR)为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程：lgMw=11.30–0.336TR(R2=0.995)。LLPS-1、LLPS-2和LLPS-3的保留时间分别是17.050、16.969、18.233min，它们的重均分子质量分别是350.5、403.3、146.2kD。

3 结 论

DEAE-Sepharose Fast Flow及Sephadex G-100色谱柱可用于百合多糖的分离纯化，百合粗多糖经上述层析柱纯化后得到3种纯化多糖LLPS-1、LLPS-2和LLPS-3。经考马斯亮蓝、紫外光谱及高效凝胶过滤色谱检测，3种百合多糖不含蛋白及核酸，具有较高纯度，分子质量分别是350.5、403.3、146.2kD。目前，国内外对百合多糖结构的详细研究报道较少，下一步本课题组将对分离纯化的百合多糖结构进行鉴定并对其构效关系进行研究，以期为百合多糖的进一步应用提供更多实验依据。

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