不同生长期香椿抗氧化作用及多酚氧化酶同工酶分析

王 成，张京芳*，张 颜，严明明，王立梅

(西北农林科技大学林学院，陕西 杨凌 712100)

摘 要：为探明不同生长期香椿抗氧化作用及多酚氧化酶(PPO)活力变化，采用3种方法评价不同生长期香椿提取物的抗氧化活性，分析不同生长期香椿PPO活力、总酚及总黄酮含量，采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳比较不同生长期香椿PPO同工酶的组成。结果表明：香椿抗氧化活性以第3生长期最强，其次是第2和第1生长期，且与酚性成分呈量效关系；PPO活力以第1生长期香椿最强，其次是第3和第2生长期；3个生长期香椿的总酚含量呈显著递增趋势(P＜0.05)；总黄酮含量以第1生长期最低，第2与第3生长期总黄酮含量差异不显著(P＞0.05)。香椿PPO共分离出5条酶带(A1～A5)，其中A3和A4为PPO特征酶带。不同生长期香椿同工酶A1、A2和 A5活力各异，且PPO活力及抗氧化活性与同工酶谱带的变化有关。

关键词：香椿；多酚氧化酶；同工酶；抗氧化活性

Antioxidant Capacity and Isozymes of Polyphenol Oxidase from Toona sinensis during Different Growth Periods

WANG Cheng，ZHANG Jing-fang*，ZHANG Yan，YAN Ming-ming，WANG Li-mei

(College of Forestry, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

Abstract：In order to understand the antioxidant capacity and the changes of polyphenol oxidase (PPO) from Toona sinensis during different growth periods, the antioxidant activity of the extract from Toona sinensis was evaluated by three methods, and the contents of total phenols and total flavonoids as well as PPO activity were analyzed. Furthermore, the isozymes of PPO were also compared by polyacrylamide gel slab electrophoresis. Results indicated that Toona sinensis at the third growth period had the highest antioxidant activity, followed by the second and the first growth periods. The antioxidant activity and phenolic components revealed a dose-dependent manner. The decreasing order of PPO activity in Toona sinensis during different growth periods was the first, third and second growth periods. The contents of total phenols showed a gradually increasing tendency during the entire growth periods (P ＜ 0.05). Toona sinensis at the first growth period had the lowest content of total flavonoids, and no significant difference between the second growth period and the third growth period was observed (P ＜ 0.05). Totally 5 kinds of isozymes (A1—A5) were separated, and A3 and A4 were the particular enzyme bands of Toona sinensis PPO. A1, A2 and A5 showed different enzymatic activities during the three growth periods. The changes of PPO activity and antioxidant activity at the same growth period were correlated with isozyme bands.

Key words：Toona sinensis；polyphenol oxidase；isozymes；anti-oxidant activity

中图分类号：Q946；Q554 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)17-0010-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201317003

香椿(Toona sinensis Roem)属于楝科香椿属落叶乔木，广泛分布于华北至华南和西南各省，是我国特有的传统木本蔬菜，其色、香、味俱佳。香椿嫩芽或嫩叶除含有氨基酸、蛋白质和维生素等营养物质外，还富含黄酮类、多酚类、萜类和皂苷等天然活性物质[1]。在紫洋葱等常见蔬菜中，以香椿叶醇提物对氧自由基的抑制率居第2位，仅次于马齿苋[2]。香椿中的黄酮类化合物具有保肝、抗炎和降血压等多种生理功能[3]。多酚氧化酶(PPO)能催化酚类底物形成醌类物质，导致产品褐至深褐色，无光泽，严重影响产品感官质量和营养品质[4]，因此研究不同生长期香椿PPO活力及其同工酶谱带变化对保护香椿酚性成分及抗氧化活性具有重要意义。为此，本研究选取3个不同生长期香椿，分析其PPO活力、PPO同工酶、总酚及总黄酮含量和抗氧化活性等，以期探索不同生长期香椿抗氧化活性与其PPO活力及同工酶组成之间的关系，为高效合理利用香椿资源提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

香椿芽采自陕西省眉县。由于香椿芽生长过程中，若采摘其顶芽，则会长出侧芽，侧芽被采摘后又会长出新的侧芽，因此本研究中第1生长期香椿为顶芽，第2生长期香椿为顶芽采摘后长出的侧芽，第3生长期香椿为采摘侧芽后再次长出的新侧芽，香椿芽长度均为10～15cm。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、Fo1in-Ciocalteu试剂、Triton X-100、丙烯酰胺、没食子酸和TEMED 美国 Sigma公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-3100型紫外-可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；AUY220型分析天平 日本岛津公司；R206型旋转蒸发器 上海申生科技有限公司；3K30型高速冷冻离心机 美国Sigma公司；H1650台式高速离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；PB-21型pH计 德国赛多利斯公司；DYCZ-28C型电泳槽、DYY-6C型电泳仪 北京市六一仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 香椿酚性成分的提取

香椿酚性成分的提取(以下简称香椿提取物)参照Yang Ying等[5]的方法，略有修改。取20g香椿嫩芽，加入液氮研细后，加入100mL含体积分数0.1% HCl的酸化甲醇，于20℃、功率400W条件下超声提取20min，过滤，滤渣重复提取2次，每次加入50mL酸化甲醇，合并滤液后，于5000r/min离心10min，上清液于40℃减压浓缩。浓缩液按体积比1:2加入石油醚脱脂3次，分离出亲水相，冷冻干燥，即为香椿提取物。

1.3.2 不同生长期香椿总酚含量测定

总酚含量测定采用Fo1in-Ciocalteu法，参考Zhou Kequan等[6]的方法，略有改变。取1mL提取液至25mL容量瓶中，分别加入1.0mL Fo1in-Ciocalteu试剂和5.0mL 1mol/L Na2CO3，蒸馏水定容，混匀，在30℃水浴中避光反应1h，于4000r/min条件下离心10min，在760nm波长处测定吸光度。以不同质量浓度没食子酸做标准曲线，线性范围为1.0～7.0μg/mL。香椿总酚含量以没食子酸计(μg/g)。

1.3.3 不同生长期香椿总黄酮含量测定

总黄酮含量测定参照Jia Zhishen等[7]的方法，略有改变。取1.0mL提取液，加入4.0mL甲醇，0.3mL 5% NaNO2，混匀；6min后，加入0.3mL 10% Al(NO3)3；6min后，加入4mL 1.0mol/L NaOH和0.4mL甲醇，放置15min，以甲醇为空白，于510nm波长处测吸光度。以不同质量浓度槲皮素做标准曲线，线性范围为0～52.5μg/mL。香椿总黄酮含量以槲皮素计(μg/g)。

1.3.4 香椿PPO的提取及活力测定

香椿PPO提取方法参考Sun Jian[8]和Jiang Yueming[9]等的方法，略有修改。取3.0g新鲜香椿芽，加入6mL提取液(用0.1mol/L pH6.2磷酸钠缓冲液配制，含0.1g/100mL PVP和0.1% Triton X-100)研磨至匀浆。在4℃、10000r/min条件下离心20min，上清液用25%～70%饱和度硫酸铵盐析，于4℃、10000r/min离心20min，弃上清，沉淀用2mL 0.01mol/L磷酸钠缓冲液(pH6.2)溶解，于4℃条件下，用相同缓冲液透析24h，期间更换2～3次透析液，即为香椿PPO粗酶液。

PPO活力检测参考Jiang Yueming[10]的方法，略有改变。将0.1mL粗酶液迅速加入到2.9mL 20mmol/L儿茶酚 (0.01mol/L磷酸钠缓冲液配制)溶液中，于400nm波长处测定吸光度在3min内的变化。酶活力定义为每分钟吸光度改变0.001为一个酶活力单位。

1.3.5 不同生长期香椿提取物抗氧化活性的测定

DPPH自由基清除能力的测定，参考文献[11]。将不同生长期香椿提取物均稀释成6个不同质量浓度(8.0、16.0、26.7、40.0、80.0、160.0mg/mL)，以VC做阳性对照，各取0.1mL分别测定其DPPH自由基清除率。

(1)

式中：A对照为甲醇溶液代替样品溶液的吸光度；A样品为样品反应体系的吸光度。

超氧阴离子自由基清除能力的测定，参考文献[12]。将不同生长期香椿提取物均稀释成5个不同质量浓度(8.0、16.0、26.7、40.0、80.0mg/mL)，以VC做阳性对照，各取0.2mL分别测定其超氧阴离子自由基清除率。

(2)

式中：A对照为缓冲液代替提取液测得的吸光度；A样品为样品反应体系吸光度。

还原Fe3+能力的测定，参考文献[13]。将不同生长期香椿提取物均稀释成6个不同质量浓度(同DPPH自由基清除率测定)，以VC做阳性对照，各取0.5mL分别测定其还原Fe3+能力。

1.3.6 不同生长期香椿PPO同工酶电泳及活性染色

不同生长期香椿多酚氧化酶非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳参照汪家政等[14]的方法，其中浓缩胶4%，分离胶12%，上样量为35μL。PPO活性染色参照Zhu Zhujun等[15]的方法。

1.4 数据统计

所有实验均设计3次重复，记录结果为平均值，采用Excel程序进行数理统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同生长期香椿总酚和总黄酮含量及PPO活力

2.1.1 不同生长期香椿总酚和总黄酮含量

酚性成分具有较好的抗氧化活性，膳食中酚性成分含量与动脉粥样硬化和血栓形成等疾病发病率呈负相关[7]。以没食子酸做标准曲线，其线性回归方程为y = 0.1098－0.0095(R2=0.9996)。据标准曲线计算不同生长期香椿总酚含量见表1。不同生长期香椿总酚含量差异显著(P＜0.05)，以第1生长期香椿总酚含量最低，第2生长期的居中，第3生长期的最高。

表 1 不同生长期香椿总酚、总黄酮含量及PPO活力(

x

±s)

Table 1 Contents of total phenols and total flavonoids and PPO activity of Toona sinensis at different growth periods (

x

±s)

注：同列字母不同表示差异显著(P＜0.05)。

黄酮类化合物是香椿酚性成分的重要组成部分。以槲皮素做标准曲线，线性回归方程为y=6.862x＋0.0193 (R2=0.9994)。由表1可知，第1生长期香椿总黄酮含量显著低于第2生长期和第3生长期(P＜0.05)，第2生长期和第3生长期香椿总黄酮含量差异不显著(P＞0.05)。

2.1.2 不同生长期香椿PPO活力

由表1可知，第1生长期香椿PPO活力高于其他两个生长期，第2生长期香椿和第3生长期香椿PPO活力差异不显著(P＞0.05)。不同生长期香椿PPO活力的变化能影起其总酚含量变化，由于香椿PPO的内源底物为酚性成分，且PPO活性越强对其最适内源性底物的作用效果就越强。第2、3生长期香椿总黄酮含量显著高于第1生长期，其原因可能是香椿中的黄酮类化合物并非均是或仅限个别是其PPO最适内源性底物，因此PPO活力较弱的第2生长期香椿总黄酮含量更高，但具体原因有待进一步研究。

2.2 不同生长期香椿提取物的抗氧化活性

2.2.1 不同生长期香椿提取物对DPPH自由基的清除能力

DPPH自由基是一种以氮为中心的较稳定的质子自由基，已经广泛用于检测果蔬及其提取物的抗氧化活性[16]。不同生长期香椿提取物对DPPH自由基的清除能力见图1。不同生长期香椿提取物对DPPH自由基的清除能力差异显著(P＜0.05)。第3生长期香椿提取物对DPPH自由基的清除率显著高于第1和第2生长期，且在8mg/mL时清除率达88.90%，其较强的抗氧化活性可能与该生长期总酚含量较高有关。在质量浓度低于40mg/mL时，不同生长期香椿提取物对DPPH自由基清除力均高于166.67μg/mL VC对照，表明香椿提取物对DPPH自由基清除能力较强。

图 1 香椿提取物及VC对DPPH自由基的清除率

Fig.1 Scavenging rates of Toona sinensis extract and vitamin C on DPPH free radicals

2.2.2 不同生长期香椿提取物对Fe3+的还原能力

还原力是反映待测样品提供电子的能力，吸光度越大则还原力越强[17]。不同生长期香椿提取物及VC对Fe3+还原能力见图2。不同生长期香椿提取物的还原力均显著高于VC，尤以低质量浓度时差异更显著。第3生长期香椿提取物的还原力显著高于第1和第2生长期香椿的还原力(P＜0.05)。

图 2 香椿提取物及VC对Fe3+的还原能力

Fig.2 Reducing power of Toona sinensis extract and vitamin C on Fe3+

2.2.3 不同生长期香椿提取物对超氧阴离子自由基的清除能力

超氧阴离子自由基主要产生于细胞酶系的反应，该自由基经过一系列反应形成其他氧自由基，从而损害细胞，因此清除超氧阴离子对保护机体细胞免受早期氧化损伤具有重要意义[11,18]。不同生长期香椿提取物及VC对超氧阴离子自由基的清除能力见图3。在质量浓度低于26.67mg/mL时，不同生长期香椿提取物对超氧阴离子自由基的清除能力差异显著(P＜0.05)，其中第3生长期清除能力最强，其次是第2生长期，第1生长期最差。不同生长期香椿提取物对超氧阴离子自由基的清除能力均显著高于VC对照，表明香椿提取物具有较强的清除超氧阴离子自由基的能力。

图 3 香椿提取物及VC对超氧阴离子自由基的清除率

Fig.3 Scavenging rates of Toona sinensis extract and vitamin C on superoxide anion free radicals

综上，不同生长期香椿提取物对DPPH自由基和超氧阴离子自由基的清除能力、Fe3+还原力均以第3生长期香椿的最强，且该生长期香椿总酚含量最高，表明香椿酚性成分含量越高，其抗氧化活性越强。不同生长期香椿PPO活力变化会导致其酚性成分含量发生变化，因此不同生长期香椿抗氧化活性变化亦与其PPO活力有关。

2.3 不同生长期香椿PPO同工酶分析

1-1和1-2、2-1和2-2、3-1和3-2分别表示第1、第2和第3生长期PPO谱带，上样量均为35μL。1-1’和1-2’均表示第1生长期PPO谱带，上样量均为20μL。

图 4 不同生长期香椿PPO同工酶谱

Fig.4 PPO isoenzyme bands of Toona sinensis during different growth periods

由图4可知，3个生长期香椿共分离出5条PPO同工酶带，酶带从上至下依次为A1、A2、A3、A4和A5，可分为3个酶区，分别是Ⅰ(Rf：0.2～0.25)，Ⅱ(Rf：0.25～0.30)，Ⅲ(Rf＞0.3)，Ⅰ区有2条酶带(A1和A2)，Ⅱ区有2条酶带(A3和A4)，Ⅲ区有1条酶带(A5)。

由表2可知，在香椿生长过程中，PPO同工酶具有明显的变化，第1生长期香椿PPO活力最强为(9410±650)U/mL，(表1)，可能与该生长期A5带有关。从第2生长期到第3生长期，A1带和A2带的活性染色逐渐加深，说明该两种PPO同工酶活力增强，这与表1中结果一致。不同生长期香椿PPO均共有A3和A4两条酶带，因此从同工酶带角度看，A3和A4是香椿PPO的特征带。香椿PPO同工酶谱中A1、A2和A5在不同生长期的动态变化导致了各生长期香椿PPO活力的差异。

表 2 不同生长期香椿PPO同工酶谱带的分布

Table 2 Distribution of PPO bands of Toona sinensis during different growth periods

注：—．酶带未出现；＋．酶带出现但不明显；＋＋．酶带明显出现。

由表1和表2可知，不同生长期香椿PPO活性变化的原因是其同工酶谱带的差异，而不同的同工酶其最适内源性底物不一样，使得不同生长期香椿PPO对其内源酚性底物的作用发生变化，进而导致不同生长期香椿酚性成分含量及其抗氧化活性各异。

3 结 论

第1生长期香椿PPO活力最强，且其总酚和总黄酮含量显著低于第2生长期与第3生长期。第2生长期、第3生长期香椿总黄酮含量、PPO活力均无显著差异。

采用3种体外抗氧化活性评价方法，比较不同生长期香椿的抗氧化活性。结果表明，以第1生长期香椿抗氧化活性最弱，其次是第2生长期，第3生长期香椿抗氧化活性最强，且与不同生长期香椿提取物总酚含量呈量效关系。

不同生长期香椿PPO同工酶电泳图谱表明，香椿PPO包括5种同工酶A1、A2、A3、A4和A5，其中A3和A4为PPO特征酶带外，在香椿不同生长期其余3种同工酶活力有明显差异。由于香椿PPO同工酶谱带的变化导致其活力不同，使PPO对酚性底物的作用发生变化，从而造成不同生长期香椿酚性成分含量及抗氧化活性的差异。因此为了更好的控制香椿PPO活性、提高香椿酚性成分含量和抗氧化活性，有待进一步研究不同生长期香椿PPO同工酶特性及其最适内源性底物。

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