乌鳢和草鱼鱼皮胶原蛋白的提取与理化性能分析

王忠稳1，汪海波1,*，梁艳萍1，李云雁1，王 敏1，汪海婴2

(1.武汉轻工大学食品科学与工程学院，湖北 武汉 430023；2.华中科技大学同济医学院，湖北 武汉 430030)

摘 要：以草鱼鱼皮和乌鳢鱼皮为原料，提取并分离纯化酸溶性胶原蛋白和酶溶性胶原蛋白，在此基础上通过胶原蛋白的结构鉴定、热稳定性分析和体外酶降解性能分析系统比较两种胶原蛋白在分子结构和理化性能上的异同点并与哺乳动物来源的猪皮胶原蛋白相比较。结果表明：提取所得的5种胶原蛋白均为典型的Ⅰ型胶原；不同提取来源的胶原蛋白具有相似的二级结构，但其在氨基酸组成、蛋白质一级结构等方面仍存在显著的差异性；差示扫描量热仪(DSC)分析结果表明：5种胶原蛋白的热变性温度分别为：猪皮酶溶性胶原蛋白(PSC)41.58℃、草鱼酸溶性胶原蛋白(ASC)35.62℃、草鱼鱼皮PSC 35.81℃、乌鳢鱼皮ASC 33.85℃和乌鳢鱼皮PSC 34.06℃；体外酶降解性能的分析结果表明：几种胶原蛋白样品的酶降解率依次为乌鳢鱼皮PSC＞草鱼鱼皮PSC＞乌鳢鱼皮ASC＞草鱼鱼皮ASC＞猪皮PSC。与草鱼鱼皮和乌鳢鱼皮胶原蛋白相比，猪皮胶原蛋白具有更好的热稳定性和耐酶降解性能。在两种淡水鱼来源的胶原蛋白之间，草鱼鱼皮胶原具有比乌鳢鱼皮胶原更好的热稳定性和酶解稳定性。同时，酸法提取的胶原蛋白比酶法提取的胶原蛋白具有更好的酶解稳定性能。

关键词：草鱼；乌鳢；胶原蛋白；提取；理化性能

Isolation and Characterization of Collagens from Skin of Grass Carp (Ctenopharyngodon idellus) and Snakehead (Channa argus)

WANG Zhong-wen1，WANG Hai-bo1,*，LIANG Yan-ping1，LI Yun-yan1，WANG Min1，WANG Hai-ying2

(1. College of Food Science and Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China；

2. Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China)

Abstract：In this study, the molecular structure and physico-chemical properties of collagens from herbivorous fish (grass carp) and carnivorous fish (snakehead) were compared. Acid-soluble collagen (ASC) and pepsin-soluble collagen (PSC) extracted from grass carp and snakehead skins were characterized comparatively for their compositional, structural and physiochemical properties and thermal stability and the results obtained were compared with those of pig skin collagen. Results indicated that all five extracted collagens were classified as type Ⅰ collagen which comprised two different α chains (α1 and α2). Collagens from different sources had considerably varying amino acid composition and protein patterns as well as their primary structure. The denaturation temperatures of different collagens were: PSC from pig skin (41.58 ℃), ASC from grass carp skin (35.62 ℃), PSC from grass carp skin (35.81 ℃), ASC from snakehead skin (33.85 ℃) and PSC from snakehead skin (34.06 ℃). The enzymatic hydrolyzability of different collagens decreased in the order of snakehead skin PSC, grass carp skin PSC, snakehead skin ASC, grass carp skin PSC and pig skin PSC. Collagens extracted from grass carp and snakehead had lower denaturation temperatures and higher enzymatic hydrolyzability than those from pig skin. Grass carp skin collagens were more resistive to collagenase and showed higher denaturation temperature compared with snakehead skin collagens. In addition, ASC was more resistive to collagenase compared to PSC.

Key words：collagen；grass carp；snakehead；isolation；physico-chemical properties

中图分类号：TS254.1 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)17-0023-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201317006

胶原蛋白(collagen)是生物体中最主要的结构蛋白之一，广泛存在于人体、哺乳动物以及鱼类的皮肤、骨骼和跟腱等器官组织中，对生物机体器官的形成和各项功能的表达均产生重要作用。由于胶原蛋白具有低免疫原性、促细胞增殖能力等诸多优良的生物学特性，近年来其在生物医学材料、功能食品和化妆品等领域中得到了越来越广泛的应用[1-5]。如胶原海绵辅料被应用于外科手术的止血、空腔填充以及创面组织的快速修复；注射型胶原蛋白凝胶被应用于人体面部皮肤皱纹的修复等。到目前为止，牛、羊、猪的皮肤和跟腱仍是胶原蛋白提取的主要来源之一。但是，随着疯牛病、口蹄疫等人畜共患疾病的数次爆发以及天然胶原蛋白样品需求量的日益增加，科学家们正逐渐将水生动物，特别是鱼类胶原纳入天然胶原的提取来源之中。近年来，围绕不同鱼类中胶原蛋白的提取和结构分析的相关研究正陆续开展，其研究成果对鱼源胶原蛋白的开发和应用起到了良好的指针作用[6-9]。我国是世界最主要淡水鱼养殖和加工国家之一，淡水鱼品种多、产量大。淡水鱼加工废弃物如鱼皮、鱼骨等均富含胶原蛋白，是天然胶原蛋白提取的潜在来源之一。目前，鱼源胶原蛋白已在功能食品、饮料以及化妆品等领域得到了较为广泛的应用，但是针对不同品种淡水鱼胶原蛋白的结构、性能差异等问题的相关研究尚鲜有报道。为此，本实验分别以两种长江流域中常见的草食性和肉食性淡水鱼品种——草鱼(grass carp)和乌鳢(snakehead，又名财鱼、黑鱼等)鱼皮为原料，提取并分离纯化鱼皮胶原蛋白，开展其蛋白结构、热稳定性和体外酶解稳定性的相关分析和比较，旨在为鱼源胶原蛋白在功能食品和生物材料领域中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

平均质量约1000g/条的新鲜草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、乌鳢(Channa argus)和新鲜猪皮均购于武汉市常青花园武商量贩超市。鲜鱼经人工分离鱼皮后去除鱼皮上附着鱼肉，随后对鱼皮进行充分洗涤并切成小片，冻藏(－20℃)备用；猪皮经人工去除皮下脂肪后切成小块，充分洗涤并冻藏(－20℃)备用。

1.2 试剂与仪器

NaOH、NaCl、Na2CO3、乙酸等化学试剂均为国产分析纯；胃蛋白酶(800～2500U/mg) 丰达生物科技有限公司；Ⅰ型胶原蛋白酶(30U/mg) 美国Sigma公司；肽链内切酶(2.5U/mg) 日本Wako公司；蛋白质分子质量标准Marker 加拿大Fermentas公司。

Cary-50紫外-可见分光光度计 美国Varian公司；LGJ-10D冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂；NEXUS傅里叶红外光谱分析仪 美国Thermo Nicolet公司；Varian高效液相色谱仪 美国Varian公司；DSC0Q10差示扫描量热仪(DSC) 美国TA公司。

1.3 方法

1.3.1 胶原蛋白的制备[10-11]

以下所有操作均在低于20℃的条件下进行。解冻后的鱼皮原料用0.1mol/L的NaOH溶液浸泡24h脱除杂蛋白，随后用去离子水充分洗涤至中性并用10%的正丁醇溶剂浸泡脱脂24h。脱脂鱼皮用去离子水反复洗涤、沥干后用0.5mol/L的乙酸溶液(1:40，m/V)搅拌提取，重复提取2次，每次24h，分离并合并上清液得到酸溶性胶原蛋白(ASC)粗提液。提取残渣继续用含有2g/100mL胃蛋白酶的0.5mol/L乙酸溶液(1:40，m/V)提取，重复提取2次，每次24h，过滤并合并上清液，得到酶溶性胶原蛋白(PSC)粗提液。分别向ASC和 PSC粗提液中添加NaCl至0.9mol/L，静置盐析24h后过滤，胶原蛋白沉淀用0.5mol/L的乙酸溶液复溶后依次对0.1mol/L的乙酸和蒸馏水透析，最后冷冻干燥得到草鱼鱼皮ASC、草鱼鱼皮PSC、乌鳢鱼皮ASC和乌鳢鱼皮PSC胶原蛋白样品，按照式(1)计算样品得率。

(1)

为获取哺乳动物来源的胶原蛋白作为对照，采用上述相同方法从猪皮原料中提取ASC和PSC，分别得到猪皮ASC和猪皮PSC。由于猪皮ASC的样品得率(以干基计)小于0.1%，故未对该样品开展后续研究。

1.3.2 红外光谱分析

胶原蛋白材料样品研磨成细粉后，取样约5mg与150mg KBr充分混匀，压片，放入样品室。测定扫描范围为4000～400cm-1，分辨率2cm-1，扫描次数为4次。

1.3.3 氨基酸组成分析

胶原蛋白样品经盐酸水解后采用高效液相色谱法测定其氨基酸组成并按照式(2)计算脯氨酸的羟基化率。测定条件：Sopium氨基酸分析色谱柱，线性梯度洗脱，A相为0.2mol/L柠檬酸钠水溶液pH3.00，B相为0.2mol/L硼酸钠水溶液pH9.80，洗脱液流速为0.4mL/min，柱温为65℃。

(2)

1.3.4 SDS-PAGE和肽谱分析

SDS-PAGE凝胶电泳分析：参考文献[12]方法，采用不连续的Tris-甘氨酸电泳系统。将胶原样品溶于0.1mol/L 醋酸溶液，配制质量浓度为2mg/mL的胶原溶液。胶原溶液上样量为20μL，分子质量标准Marker上样量为10μL。电泳分离采用7.5%分离胶和4%浓缩胶体系，采用直流稳压电源，浓缩胶电压80V、0.5h；分离胶电压120V、2.5h。电泳分离后，胶体用0.25%考马斯亮蓝R-250染色过夜，用甲醇-乙酸脱色液脱色2～3次，直至背景颜色为无色，随后用凝胶成像系统照相并分析各分离条带的分子质量。

肽谱分析[13]：称取1mg胶原样品溶于100μL 0.1mol/L的磷酸钠缓冲溶液(pH7.2，含0.5% SDS)中，充分溶解，然后加入10μL肽链内切酶液，37℃水解10min，沸水浴加热3～5min，终止酶反应。随后将样品置于－20℃冰箱保存待用，点样时自然解冻，按上述SDS-PAGE方法进行电泳分析，得到肽谱图。

1.3.5 变性温度测定

采用差示扫描量热仪(DSC)测定胶原蛋白样品热变性温度。测定前仪器用金属铟进行校正，用空铝盒做对照，扫描温度范围20～80℃；升温速率2℃/min，样品室氮气流量为20mL/min。

1.3.6 体外酶降解性能测定[14]

准确称取胶原蛋白样品40mg置于20mL的胶原蛋白酶溶液中(胶原蛋白酶质量浓度0.5mg/mL，缓冲体系为含0.8mmol/L NaN3和5mmol/L CaCl2的0.01mol/L Tris-HCl，pH7.4)，随后将该样品液转移至透析袋中(截留分子质量＞14000D)，37℃条件下透析，透析外液为总体积100mL的0.01mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)。实时测定透析外液中羟脯氨酸总含量并绘制胶原蛋白样品的体外酶降解曲线。采用分光光度法方法定量测定羟脯氨酸含量[15]，测定标准曲线为Y=0.1106X＋0.0193(R2=0.9998)，式中：X为羟脯氨酸的质量浓度/(mg/mL)，Y为吸光度。

(3)

1.4 统计学处理

实验数据用

±s表示。采用SPSS 12.0软件进行统计学分析，组间均数比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 氨基酸组成分析结果

实验得到的胶原蛋白冻干物均为白色、蓬松状样品。草鱼鱼皮和乌鳢鱼皮胶原蛋白的总得率分别为(45.3±2.8)%和(64.1±2.3)%，而猪皮中胶原蛋白的得率仅为(38.8±1.1)%，猪皮胶原蛋白得率明显低于草鱼鱼皮和乌鳢鱼皮(P＜0.05)，说明草鱼和乌鳢鱼皮中含有更丰富的胶原蛋白，具备作为天然胶原蛋白提取原料的潜在价值。同时，ASC和PSC在3种不同提取原料中的分布不尽相同。草鱼鱼皮ASC的样品得率(25.5±1.3)%高于草鱼鱼皮PSC(19.8±1.5)%，乌鳢鱼皮中ASC和PSC的得率情况则正好相反，而从猪皮中仅能提取微量的ASC。研究表明[16]，当天然胶原蛋白主要以分子间交联的形式存在时，其几乎不溶于酸性溶液，只有在酶辅助部分水解的条件下才能溶出。本实验的结果表明，草鱼鱼皮中的胶原蛋白主要以非交联的游离态形式存在，而乌鳢鱼皮和猪皮中胶原蛋白则主要以分子间的交联形式存在。

表 1 不同胶原蛋白的氨基酸组成

Table 1 Amino acid composition of collagens from different sources

‰

注：氨基酸组成分析采用氨基酸残基数占1000个氨基酸残基的比例。

由表1胶原蛋白样品的氨基酸组成分析可知，所有的提取样品均具有胶原蛋白的特征性氨基酸组成，即样品中富含甘氨酸、脯氨酸和胶原蛋白的特征性氨基酸——羟脯氨酸。与哺乳动物来源的猪皮胶原蛋白相比，鱼源胶原蛋白样品中的丙氨酸和蛋氨酸含量明显偏高，而组氨酸含量明显偏低。在两种鱼源胶原蛋白之间，其氨基酸组成亦存在一定差异性。乌鳢鱼皮胶原蛋白的丝氨酸和精氨酸含量明显低于草鱼皮胶原蛋白，而组氨酸的含量情况则正好相反。该实验结果提示，尽管均具有天然胶原蛋白的氨基酸组成特征，但不同种属来源的胶原蛋白在其氨基酸组成上仍存在明显差异。

2.2 红外光谱分析结果

图 1 胶原蛋白样品的红外光谱图

Fig.1 IR spectra of collagens from different sources

由图1可知，5种胶原蛋白样品的红外光谱特征基本一致，均具有天然Ⅰ型三螺旋结构胶原蛋白的特征红外吸收带。其中，酰胺A带(3316～3326cm-1)归属于蛋白肽链中游离的N—H伸缩振动；酰胺B(2930～2944cm-1)归属于－CH2的不对称伸缩振动；酰胺Ⅰ带(1652～1653cm-1)与C＝O的伸缩振动有关；酰胺Ⅱ和Ⅲ带出现在1558cm-1和1238cm-1附近，归属于蛋白肽链的N—H弯曲振动和C—N的伸缩振动。对比5个胶原蛋白样品，除酰胺A带外，其他4个波带的吸收波数基本一致。红外光谱分析结果提示，尽管5种胶原蛋白的来源和提取方法不相同，但他们却具有相似的二级结构。研究表明[17]，酰胺A带的吸收波数位置与肽链N—H基团的氢键键合程度有关。当N—H的氢键键合程度较高时，其吸收波数蓝移。乌鳢鱼皮ASC和PSC在酰胺A带的吸收波数(3326、3320cm-1)明显高于草鱼鱼皮ASC和PSC(3318、3316cm-1)，提示草鱼鱼皮胶原蛋白分子间能形成更为广泛的氢键键合。

2.3 SDS-PAGE和肽谱分析结果

0. Markers；1.乌鳢鱼皮ASC；2.乌鳢鱼皮皮PSC；3.草鱼鱼皮ASC；4.草鱼鱼皮PSC；5.猪皮PSC。图3同。

图 2 SDS-PAGE凝胶电泳分析图谱

Fig.2 SDS-PAGE of collagens from different sources

由图2 SDS-PAGE凝胶电泳的分析结果可知，所有5个胶原蛋白样品中均包含两种α肽链(α1和α2)和一条β肽链(α肽链的二聚体)，其中α1谱带的色度明显高于α2，提示该胶原蛋白是由2条α1和1条α2肽链组成的三聚体，该肽链组成特征与Ⅰ型胶原蛋白的肽链组成高度一致，说明提取所得的胶原蛋白样品均属Ⅰ型胶原。对照电泳图谱中的蛋白质分子质量标准计算得到5种胶原蛋白样品的分子质量分别为：乌鳢鱼皮ASC、PSC(356、347kD)；草鱼鱼皮ASC、PSC(351、344kD)；猪皮PSC(352kD)。从胶原蛋白的分子质量可知，相同提取来源的胶原蛋白样品中，ASC的分子质量均略高于PSC，这可能与酶水解法提取过程中胃蛋白酶对肽链端基的剪切作用有关。

胶原蛋白样品经赖氨酰肽链内切酶作用后用SDS-PAGE进行水解样品的电泳分析，得到胶原蛋白样品的肽谱图。由图3可知，经肽链内切酶作用后，所有胶原蛋白样品均被酶解为多个分子质量大小不一的肽链片段。同源胶原蛋白样品之间(ASC和PSC)的肽链片段分布高度一致，说明同一提取来源的酸溶性胶原蛋白和酶溶性胶原蛋白之间在肽链一级结构(氨基酸序列)上并无差异。但是，不同提取来源的胶原蛋白肽链片段分布的差异明显，且其差异主要集中在分子质量为60～120kD的肽链片段之间，该结果提示，不论是哺乳动物与淡水鱼之间还是不同品种的淡水鱼之间，其胶原蛋白的一级结构均存在一定的差异，这种差异显然与其氨基酸组成上的差异化有关。同时，这种蛋白一级结构的差异也必然导致其相关理化性能的不同。

图 3 胶原蛋白样品的肽谱图

Fig.3 Peptide mapping of collagens from different sources

2.4 热变性温度测定

采用差示扫描量热仪测定不同胶原蛋白的热变性温度(Td)，测定结果如图4所示。3种不同来源胶原蛋白的热变性温度大小依次为猪皮胶原蛋白＞草鱼鱼皮胶原蛋白＞乌鳢鱼皮胶原蛋白，而相同提取来源的胶原蛋白(ASC和PSC)之间其蛋白变性温度差异不大。该结果说明，不同种属来源的胶原蛋白之间在热稳定性方面存在一定差异，而提取方法(酸提取或酸-酶提取)对胶原蛋白产物的热稳定性影响不大。国外学者的研究表明，天然胶原蛋白的热稳定性与其氨基酸组成存在一定的内在关联，但具体是哪一种氨基酸直接影响胶原蛋白的热稳定性能，不同学者得出的研究结论略有不同。Ikoma等[18]的研究表明，脯氨酸和羟脯氨酸中的吡啶环状结构对胶原蛋白的三螺旋结构的稳定性起重要作用，因此胶原蛋白中脯氨酸和羟脯氨酸含量与其热变性温度间存在正相关性。而Nagai等[19]的研究表明，脯氨酸的羟基化率与胶原蛋白的热变性温度间存在正相关性，因为羟脯氨酸中的羟基结构有助于形成分子内的氢键键合，从而提升三螺旋结构的稳定性。乌鳢鱼皮ASC和PSC中脯氨酸和羟脯氨酸含量最高(242‰和234‰)，而脯氨酸的羟基化率最低(43.28%和40.15%)，但是其对应的热变性温度却低于草鱼鱼皮和猪皮胶原蛋白，该结果更接近于Nagai等[19]的研究结论，即导致乌鳢皮胶原蛋白热稳定性较低的主要因素是其较低的脯氨酸羟基化率。但是，猪皮PSC的脯氨酸羟基化率(43.9%)显著低于草鱼鱼皮ASC和PSC(52.07%和49.09%)，但其热变性温度却是最高，说明除脯氨酸羟基化率之外，不排除存在其他未知因素影响胶原蛋白的热稳定性能。

图 4 不同胶原蛋白样品的DSC测定结果

Fig.4 DSC thermograms of collagens from different sources

2.5 体外酶降解性能

图 5 胶原蛋白样品的体外酶降解性能分析

Fig.5 Enzymatic hydrolyzability of collagens from different sources

酶解稳定性是胶原蛋白在生物材料中应用的最主要评价指标之一。为了让生物材料在体内有充分的时间发挥生物功效，往往要求胶原蛋白具有足够好的抗酶降解性能。不同胶原蛋白样品的体外酶降解性能测定结果如图5所示，随着酶处理时间的延长，所有胶原蛋白样品的酶降解率均逐步增加并在酶降解80h左右时达到平衡。酶降解终点时几种胶原蛋白样品的酶降解率依次为乌鳢鱼皮PSC(63.1±1.6)%＞草鱼鱼皮PSC(53.3±1.2)%＞乌鳢鱼皮ASC(50.2±0.9)%＞草鱼鱼皮ASC(47.0±1.1)%＞猪皮PSC(30.0±1.6)% (P＜0.05)。表明在同一提取来源的胶原蛋白之间，酸溶性胶原蛋白的酶解稳定性均高于酶溶性胶原蛋白。Silver等[20]的研究表明，由于酸溶性胶原蛋白分子结构中具有完整的肽端，这部分肽端是非螺旋的松散结构，对水解酶能产生空间阻碍，因此其酶解稳定性一般略高于酶溶性胶原蛋白(其肽端结构在酶水解提取过程中被部分或完全水解切除)，实验结果证实了Silver等[20]的这一推论。在3种胶原提取来源中，猪皮胶原蛋白的酶解稳定性最好，其次为草鱼皮胶原蛋白，而乌鳢皮胶原蛋白的酶解稳定性最弱。目前，对于影响胶原蛋白酶解稳定性的分子学机制尚不完全明晰，胶原蛋白的氨基酸组成、肽端的完整性、胶原分子间的交联等均可能对其酶解稳定性产生影响。根据红外光谱的分析结果(图1)，在3种提取来源的胶原蛋白中，乌鳢皮胶原蛋白分子间的氢键键合能力最弱，这可能是导致其酶解稳定性较差的原因之一，但其他因素的影响尚需更深入的研究。

3 结 论

本研究分别从草鱼鱼皮和乌鳢鱼皮中提取并分离纯化酸溶性胶原蛋白和酶溶性胶原蛋白，在此基础上开展了两种淡水鱼胶原蛋白分子结构、热稳定性和体外酶降解性的相关分析并与哺乳动物来源的猪皮胶原蛋白相比较，结果表明：提取所得的胶原蛋白样品均为典型的Ⅰ型胶原并具有完整的三螺旋结构。不同提取来源的胶原蛋白样品之间在氨基酸组成、蛋白质一级结构等方面存在一定的差异性。与鱼源胶原蛋白相比，哺乳动物来源的猪皮胶原蛋白展现出更好的热稳定性能和酶解稳定性。草鱼鱼皮胶原蛋白在热稳定性能和耐酶降解性能方面优于乌鳢鱼皮胶原蛋白。

参考文献：

[1] BIRK D E, BRUCKNER P. Collagen suprastructures[J]. Topics in Current Chemistry, 2005, 247: 185-205.

[2] FRIESS W. Collagen-biomaterial for drug delivery[J]. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 1998, 45(2): 113-136.

[3] ZENG S K, ZHANG C H, LIN H, et al. Isolation and characterization of acid-solubilised collagen from the skin of Nile tilapia (Oreochromis niloticus)[J]. Food Chemistry, 2009, 116: 879-883.

[4] SWATSCHEK D, SCHATTON W, KELLERMANN J, et al. Marine sponge collagen: isolation, characterization and effects on the skin parameters surface-pH, moisture and sebum[J]. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 2002, 53: 13-107.

[5] KAWAGUCHI Y, KONDO E, KITAMURA N, et al. in vivo effects of isolated implantation of salmon-derived crosslinked atelocollagen sponge into an osteochondral defect[J]. Journal of Materials Science-Materials in Medicine, 2011, 22: 397-404.

[6] LIN Y K, LIU D C. Comparison of physical-chemical properties of type Ⅰ collagen from different species[J]. Food Chemistry, 2006, 99: 244-254.

[7] KITTIPHATTANABAWON P, BENJAKUL S, VISESSANGUAN W, et al. Characterisation of acid-soluble collagen from skin and bone of bigeye snapper (Priacanthus tayenus)[J]. Food Chemistry, 2005, 89: 363-372.

[8] NAGAI T, SUZUKI N. Isolation of collagen from fish waste material-skin, bone and fins[J]. Food Chemistry, 2000, 68: 277-281.

[9] NAGAI T, WORAWATTANAMATEEKUL W, SUZUKI N, et al. Isolation and characterization of collagen from the outer skin waste material of cuttlefish (Sepia lycidas)[J]. Food Chemistry, 2001, 72: 425-429.

[10] 汪海波, 汪海婴, 梁艳萍, 等. 草鱼鱼鳞胶原蛋白的凝胶性能研究[J]. 功能材料, 2012, 43(4): 433-438.

[11] 汪海波, 梁艳萍, 汪海婴, 等. 草鱼鱼鳞胶原蛋白的提取及其部分生物学性能研究[J]. 水产学报, 2012, 36(4): 553-561.

[12] ZHANG J, DUAN R, TIAN Y, et al. Characterisation of acid-soluble collagen from skin of silver carp (Hypophthalmichthys molitrix)[J]. Food Chemistry, 2009, 116: 318-322.

[13] SAITO M, KUNISAKI N, URANO N, et al. Collagen as the major edible component of sea cucumber (Stichopus japonicus)[J]. Journal of Food Science, 2002, 67: 1319-1322.

[14] NAM K, KIMURA T, KISHIDA A. Preparation and characterization of cross-linked collagen-phospholipid polymer hybrid gels[J]. Biomaterials, 2007, 28: 1-8.

[15] REDDY G K, ENWEMEKA C S. A simpli?ed method for the analysis of hydroxyproline in biological tissue[J]. Clinical Biochemistry, 1996, 29: 225-229.

[16] FOEGEDING E A, LANIER T C, HULTIN H O. Collagen[M]// FENNEMA O R. Food chemistry. New York: Marcel Dekker, 1996: 902-906.

[17] DOYLE B B, BENDIT E G, BLOUT E R. Infrared spectroscopy of collagen and collagen-like polypeptides[J]. Biopolymers, 1975, 14: 937-957.

[18] IKOMA T, KOBAYASHI H, TANAKA J, et al. Physical properties of type Ⅰ collagen extracted from ?sh scales of Pagrus major and Oreochromis niloiicas[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2003, 32: 199-204.

[19] NAGAI T, SUZUKI N, NAGASHIMA T. Collagen from common minke whale (Balaenoptera acutorostrata)[J]. Food Chemistry, 2008, 111: 296-301.

[20] SILVER F H, FREEMAN J W, SEEHRA G P. Collagen self-assembly and the development of tendon mechanical properties[J]. Journal of Biomechanics, 2003, 36: 1529-1553.