鲢鱼酶解产物分子质量组成与抗氧化性

李向红，陈志军，刘永乐*，俞 健，王发祥，王建辉

(长沙理工大学化学与生物工程学院，湖南 长沙 410004)

摘 要：以脱脂鲢鱼粉为原料，采用复合蛋白酶(Protamex)及碱性蛋白酶(Alcalase)控制酶解制备不同水解度(DH)的酶解产物，研究不同水解度酶解产物的分子质量组成，并以总抗氧化能力、羟自由基(•OH)清除能力、抗脂质氧化能力、超氧阴离子自由基(O2－•)清除能力为指标研究酶解产物的抗氧化活性。结果表明：碱性蛋白酶酶解鲢鱼粉后获得的酶解产物分子质量均低于复合蛋白酶的酶解产物，在水解度为10%的体系中，95%以上肽的分子质量集中在1500u以下；两种蛋白酶控制酶解制备的酶解产物均具有良好的抗氧化能力，其中碱性蛋白酶酶解产物DH为10%时的总抗氧化能力和抑制•OH能力效果最好，分别为1.025U/mg pro和21.31U/mg pro；复合蛋白酶酶解产物DH 10%时的O2－•清除能力和抑制脂质氧化能力最好，O2－•清除能力为24.92U/mg pro，质量浓度5.0mg/mL时对脂质过氧化抑制率为27.88%；两种蛋白酶水解鲢鱼获得的酶解产物的分子质量组成与抗氧化性有一定关系，但相关性不显著。

关键词：鲢鱼；酶解产物；分子质量；抗氧化

Molecular Weight and Antioxidant Activity of Enzymatic Hydrolysates of Silver Carp

LI Xiang-hong，CHEN Zhi-jun，LIU Yong-le*，YU Jian，WANG Fa-xiang，WANG Jian-hui

(School of Chemistry and Biological Engineering, Changsha University of Science and Technology, Changsha 410004, China)

Abstract：The molecular weight (Mw) and antioxidant properties of enzymatic hydrolysates of silver carp with different degree of hydrolysis (DH) were studied. The antioxidant properties evaluated included total antioxidant capacity (T-AOC), radical scavenging activity against hydroxyl and superoxide anion free radicals and lipid oxidation inhibitory effect. The hydrolysates were prepared by respective use of protamex and alcalase. The results showed that the Mw of the hydrolysates produced by alcalase were generally lower than those of the hydrolysates obtained with Protamex, and at DH 10%, over 95% of peptides fractions had Mw lower than 1500 u. The hydrolysates prepared by each enzyme preparation had excellent antioxidant activities. The hydrolysates with DH 10% prepared by alcalase possessed the highest T-AOC and hydroxyl radical scavenging capacity, which were 1.025 U/mg pro and 21.31 U/mg pro, respectively. The hydrolysates with DH 10% prepared by protamex displayed the strongest superoxide anion radical scavenging ability and lipid oxidation inhibitory effect, which reached 24.92 U/mg pro and 27.88% at a concentration of 5.0 mg/mL, respectively. The antioxidant activities of these hydrolysates might be related to their molecular weights despite being not significant.

Key words：silver carp；hydrolysate；molecular weight；antioxidant activity

中图分类号：TS254.1 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)17-0028-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201317007

蛋白质酶解有助于改善其营养价值和功能特性，因为蛋白酶的水解作用将以休眠形式存在于母蛋白序列中的特异性蛋白片段释放，表现出多种生理功能，所以将其称为活性肽，这类活性肽通常由2～20个氨基酸组成[1]，分子质量小于6000D[2]。活性肽的生物效价和营养价值比游离氨基酸更高，更易于被人体吸收[3-5]；且对人体具有多种生理调节作用：可调节激素的分泌和免疫能力、抗菌、抗癌、促进矿物质的吸收、抗氧化、抗高血压以及抗疲劳等[6]。抗氧化肽是生物活性肽的一种，其分子质量小，易吸收，在体内能通过减少氧自由基、羟自由基和抑制脂质过氧化而达到抗衰老的功能[7]。天然抗氧化肽具有很高的安全性和强抗氧化性，在医药、食品等行业的应用中已显示出其优势，目前已经成为国内外的研究热点。

鲢鱼在我国养殖量较大，每年的捕捞量达到3524800t[8]，鲢鱼的营养丰富，蛋白质含量高(最高可达到26.6%)，氨基酸模式接近人体需要[9]，是一种优质蛋白，经常食用具有抗衰老、养颜的功效，对肿瘤也有一定的预防作用[10]。但鲢鱼肉糙刺多，口感欠佳，鲜食不太受欢迎，市售价格低廉，而且鲢鱼在鲜销过程中腐败率高，造成了严重的资源浪费和环境污染。目前，以鲢鱼为原料的酶解研究有很多，但关于酶解产物的分子质量组成与抗氧化性间关系的研究在国内外还相对较少，因此对鲢鱼肉采用碱性蛋白酶和复合蛋白酶进行控制水解，获得不同水解度的酶解产物，研究其酶解产物的分子质量组成与抗氧化活性，对促进了解鲢鱼酶解产物抗氧化机理具有一定的参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

脱脂鲢鱼粉(蛋白含量为77.85%) 本实验室自制；碱性蛋白酶(Alcalase，粉末状，酶活力＞200U/mg)、复合蛋白酶(Protamex，酶活力＞120U/mg) 合肥博美生物科技有限责任公司；总抗氧化能力(T-AOC)测定试剂盒、羟自由基测定试剂盒、抗超氧阴离子自由基试剂盒 南京建成生物工程研究所；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

FD-1型冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；TGL-16B高速台式离心机 上海安亭科学仪器厂；85-2数显恒温磁力搅拌器 天津市泰斯特仪器有限公司；DELTA 320 pH计 梅特勒-托利多(上海)有限公司；UV2600紫外-可见分光光度计 上海舜宇恒平科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 常规成分的测定

蛋白质的测定：GB/T 5511—2008《谷物和豆类 氮含量测定和粗蛋白质含量计算 凯氏法》，氮换算为蛋白质的系数为7.5；水分的测定：GB 5009.3—2010《食品安全国家标准 食品中水分的测定》灰分的测定：GB/T 5505—2008《粮油检验 灰分测定法》；脂肪的测定：GB/T 5512—2008 《粮油检验 粮食中粗脂肪含量测定》。

1.3.2 不同水解度鲢鱼酶解物的制备

按照如下实验流程制备鲢鱼水解产物：脱脂鲢鱼粉→复合蛋白酶/碱性蛋白酶酶解→灭酶(90℃，10min)→离心(5000r/min，15min)→上清液→透析→浓缩→冷冻干燥→鲢鱼酶解产物。

水解度(DH)的测定：采用pH-Stat法[11]，按照式(1)计算。

(1)

式中：V为碱消耗量/mL；c为NaOH浓度/(mol/L)；m为底物中蛋白质质量/g；htot为每克蛋白质底物具有的肽键毫摩尔数，鲢鱼蛋白的htot为7.2meq/g；α为α-氨基的平均解离度。

1.3.3 不同水解度酶解产物分子质量组成的测定

称取不同水解度酶解产物，用添加了0.1mol/L Na2SO4的磷酸缓冲液(0.1mol/L，pH6.7)溶解配制成5mg/mL的蛋白溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤后，采用Shimadzu高效液相色谱系统和TSK gel 2000 SWXL(30mm×7.8mm)凝胶柱测定不同水解度下酶解产物的分子质量组成。

检测条件如下：流动相：0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(0.1mol/L Na2SO4，pH6.7)；洗脱速率：1.0mL/min；检测波长：UV 220nm；柱温：25℃。

1.3.4 不同水解度酶解产物抗氧化性的测定

1.3.4.1 不同水解度酶解产物总抗氧化能力(T-AOC)测定

采用T-AOC试剂盒测定不同水解度酶解产物的T-AOC，测定时用双蒸水调零1cm光径，520nm波长测定各管吸光度[12]。规定在37℃时每分钟每毫升样品使反应体系的吸光度每增加0.01时为1个总抗氧化能力单位。按照式(2)计算。

(2)

式中：A0为对照管吸光度；A1为测定管吸光度。

1.3.4.2 不同水解度酶解产物对•OH的清除作用

采用•OH测定试剂盒进行测试。用双蒸水调零，在550nm波长测试各管吸光度[13]。规定每毫克不同水解度酶解产物在37℃条件下反应1min，使反应体系中H2O2的浓度降低1mmol/L为1个抑制•OH能力单位。按照式(3)计算。

(3)

式中：A0为空白管吸光度；A1为标准管吸光度；A2为对照管吸光度；A3为测定管吸光度。

1.3.4.3 不同水解度酶解产物对O2－•的清除作用

采用O2－•测定试剂盒进行测试。在1cm光径比色杯中，以蒸馏水调零，在波长550nm处比色[14]。在反应系统中，每克不同水解度酶解产物在37℃反应40min所抑制的O2－•相当于1mg的VC所抑制的O2－•的变化值为1个活力单位。按照式(4)计算。

(4)

式中：A0为标准管吸光度；A1为对照管吸光度；A2为测定管吸光度。

1.3.4.4 不同水解度酶解产物抗脂质氧化作用

参照文献[15]的方法测定不同水解度酶解产物抑制脂质过氧化能力：取新鲜卵黄与磷酸缓冲液(0.1mol/L，pH7.4)配成体积分数10%悬浮液，室温下采用手持式均质机高速乳化均质10min，然后经超声波处理20min。使用前采用磁力搅拌5min。在25mL具塞管中依次加入制备的脂质体0.5mL，质量浓度为5mg/mL的样品0.1mL后加去离子水至1mL，再加入70mmol/L的FeSO4溶液0.05mL，置于37℃恒温水浴反应30min。然后依次加入10%的三氯乙酸(TCA)0.5mL、1%的2-硫代巴比妥酸(TBA)1mL，沸水中水浴10min后4000r/min离心15min，取上清液于532nm波长处测定吸光度。用去离子水代替样品作对照。按照式(5)计算。

(5)

式中：A0为对照管吸光度；A1为样品管吸光度。

2 结果与分析

2.1 脱脂鲢鱼粉基本成分分析

采用异丙醇常温条件下2次萃取法对鲢鱼鱼糜脱脂，真空抽滤回收溶剂，将脱脂鱼糜自然风干，粉碎后过40目筛。表1列出了所制备的脱脂鲢鱼粉的基本成分(干基)。

表 1 脱脂鲢鱼粉的成分分析

Table 1 Chemical ccomposition of defatted silver carp powder

2.2 不同水解度酶解产物分子质量组成

图 1 酶种类及水解度对酶解产物分子质量组成的影响

Fig.1 Effect of enzyme type and degree of hydrolysis on molecular weight of hydrolysates

图1是采用复合蛋白酶和碱性蛋白酶酶解鲢鱼粉后获得的不同水解度酶解产物的分子质量组成。随着水解度的增加，大分子质量的部分逐渐被酶解成更低分子质量的短肽。复合蛋白酶酶解获得的DH 10%的样品中包含了8.3%的大分子部分(669000u)以及20.6%的分子质量为2542u的部分；其他样品中分子质量为669000u的百分含量在3.4%～6.9%间，同时不包含分子质量为2542u的部分；此外，所有样品的主要峰的分子质量都低于1500u。Zhong等[16]发现水解鲢鱼加工副产物获得的肽中，分子质量＜1ku的部分显示出最高的清除DPPH自由基、•OH和O2－•的能力；Wu等[17]证实鲭鱼水解产物中分子质量大约为1400u的部分具有较强的抗氧化活性；Mendis等[18]表明美洲大赤鱿皮的水解产物中分子质量＜3000u的肽拥有最强的抗氧化性。所以，采用复合蛋白酶和碱性蛋白酶酶解鲢鱼后获得的不同水解度的酶解产物在食品和食用后也可能具有潜在的抗氧化活性。

实验结果也表明，碱性蛋白酶酶解鲢鱼鱼糜后获得的酶解产物分子质量均低于复合蛋白酶的酶解产物，其酶解产物中不包含分子质量为2542u的部分，而且在水解度仅为10%时体系中95%以上肽的分子质量均在1500u以下，这与Alcalase这类碱性蛋白酶在酶解蛋白质时比酸性和中性蛋白酶(Protamex)显示出较高的催化活性有关[13,19]。

2.3 不同水解度酶解产物抗氧化活性

2.3.1 不同水解度酶解产物总抗氧化能力

图 2 酶种类及水解度对酶解产物总抗氧化能力的影响

Fig.2 Effect of enzyme type and degree of hydrolysis on T-AOC of hydrolysates

由图2可知，两种蛋白酶不同水解度的酶解产物都有不同程度的抗氧化能力，碱性蛋白酶4个水解度样品间的T-AOC差异比较明显，在DH 10%、DH 40%时的总抗氧化能力较好，约为DH 20%和DH 30%的两倍左右，最高达到1.025U/mg pro；复合蛋白酶4个不同水解度样品间的T-AOC差异并不大，基本维持在0.4～0.6U/mg pro之间。总体上，碱性蛋白酶酶解产物的T-AOC要优于复合蛋白酶酶解产物，但两种蛋白酶酶解所得各样品的总抗氧化能力并未表现出与酶解程度间的明显的相关性，因此，虽然Rajapakse等[20]表明低分子质量的肽显示出较强的抗氧化能力，可从目前所得结果只能说明抗氧化能力的高低与分子质量的大小可能存在关系。此外，其抗氧化能力还可能与复合蛋白酶和碱性蛋白酶作用底物的特异性及酶解过程中酶解产物产生的随机性(不同酶使蛋白质肽链水解断开形成的肽的种类由于氨基酸组成及序列的差异而有所不同[21-22])有关。

2.3.2 不同水解度酶解产物对•OH的清除作用

图 3 酶种类及水解度对酶解产物抑制•OH能力的影响

Fig.3 Effect of enzyme type and degree of hydrolysis on hydroxyl radical scavenging activity of hydrolysates

由图3可知，两种蛋白酶酶解制备的酶解产物均有抑制•OH的能力，而碱性蛋白酶各个水解度产物的抑制•OH的能力均高于复合蛋白酶酶解产物；随着两种酶酶解鲢鱼蛋白水解度的不断增加，酶解产物对•OH的抑制能力逐渐减弱，这可能是由于抑制羟自由基产生的主要功能成分是多肽，当水解度过大时部分活性多肽被进一步水解为氨基酸，从而失去抑制•OH能力。

2.3.3 不同水解度酶解产物对O2－•的清除作用

图 4 酶种类及水解度对酶解产物O2－•清除活力的影响

Fig.4 Effect of enzyme type and degree of hydrolysis on superoxide anion radical scavenging activity of hydrolysates

由图4可知，水解度与O2－•清除活力的关系呈“V”形，两种蛋白酶酶解产物均在DH 30%时对O2－•清除活力最低；复合蛋白酶酶解物的O2－•清除活力在各水解度都优于碱性蛋白酶酶解物，从上述结果很难得出肽的分子组成与O2－•清除能力的高低具有相关性。

2.3.4 不同水解度酶解产物的抗脂质氧化能力

由图5可知，两种蛋白酶不同水解度酶解产物在相同质量浓度(5mg/mL)条件下对脂质过氧化都有不同程度的抑制作用，碱性蛋白酶各水解度样品间对脂质过氧化的抑制率变化不大，基本都维持在20%以上；复合蛋白酶DH10%时的酶解物对脂质过氧化抑制效果是所有样品中最好的，达到27.88%，其余3个水解度的样品的抑制率都在15%左右。

图 5 酶种类及水解度对酶解产物抗脂质氧化能力的影响

Fig.5 Effect of enzyme type and degree of hydrolysis on anti-lipid oxidation activity of hydrolysates

3 结 论

在碱性蛋白酶及复合蛋白酶各自最优的酶解工艺条件下，对脱脂鲢鱼粉进行酶解，制备不同水解度酶解产物，进一步研究了不同水解度样品的分子质量分布及在4种化学体系中的体外抗氧化作用。结果表明，碱性蛋白酶酶解鲢鱼粉后获得的酶解产物分子质量均低于复合蛋白酶的酶解产物，在水解度为10%的体系中，95%以上肽的分子质量均在1500u以下；抗氧化性的结果表明碱性蛋白酶酶解产物除了对O2－•的清除能力低于复合蛋白酶酶解产物外，在总抗氧化能力、抑制•OH能力、抑制脂质过氧化能力方面整体上都优于复合蛋白酶酶解物。本研究的结果说明肽的分子质量亦即肽段大小与其抗氧化有一定的关系，但肽的氨基酸序列、肽键本身以及肽的构象可能对肽的抗氧化性具有更加显著的影响[23-27]，陈洁等[28]也表明具有抗氧化能力的肽段结构不断被发现，其结构与功能的关系也在不断探索中，但是目前除了肌肽和谷胱甘肽以外，蛋白质酶解物或者其他抗氧化肽结构与功能相关性远未达到明了的程度。因此，对于鲢鱼酶解产物来说，其抗氧化性与其肽的结构、组成等的关系还有待进一步研究。

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