苹果着色期花青苷和糖组分含量变化及关联性

刘玉莲，车 飞，郭延平，梁 俊，赵政阳*

(西北农林科技大学园艺学院，陕西 杨凌 712100)

摘 要：以红色苹果品种‘粉红女士’、‘红星’和绿色品种‘澳洲青苹’及黄色品种‘金冠’为试材，利用高效液相色谱(HPLC)测定不同色泽类型套袋果实除袋后着色过程中花青苷和可溶性糖的种类及含量变化，并分析两者间的相关性。结果表明：果实中花青苷种类存在差异，红色品种着色后果皮中含有矢车菊素-3-半乳糖苷(cy-3-gal)、矢车菊素-3-阿拉伯糖(cy-3-ara)和矢车菊素-3-葡萄糖苷(cy-3-glu)，绿色品种和黄色品种着色后果皮中含有cy-3-gal和cy-3-ara。果实中不同种类的花青苷含量差异显著，花青苷cy-3-gal在果皮中含量最高。果实中所含可溶性糖的种类相同，只是含量有所差异。果糖含量最高，蔗糖和葡萄糖次之，UDP-半乳糖和山梨醇含量较低。分析发现，苹果果实着色过程中，花青苷含量变化，尤其是cy-3-gal与蔗糖含量存在极显著的正相关，推测苹果果皮花青苷cy-3-gal代谢可能受蔗糖信号调节。

关键词：苹果；可溶性糖；花青苷；高效液相色谱法(HPLC)

Correlation between Changes in Soluble Sugars and Anthocyanins Contents during Fruit Coloration

LIU Yu-lian，CHE Fei，GUO Yan-ping，LIANG Jun，ZHAO Zheng-yang*

(College of Horticulture, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

Abstract：In this study, fruits from the red apple cultivars ‘Starking’ and ‘Pink Lady’, the green cultivars ‘Granny Smith’, and the yellow cultivars ‘Golden Delicious’ were analyzed by HPLC for changes in the kinds and amounts of soluble sugars and anthocyanins after bag removal during coloration and correlation between these two components. The results showed that the kinds of anthocyanins in apples varied among the different cultivars. Three anthocyanins, cyanidin 3-galactoside, cyaniding 3-glucoside chloride and cyaniding 3-arabinoside were identified in the skin of the red apple cultivars after the completion of coloration and two anthocyanins, cyanidin 3-galactoside and cyaniding 3-arabinoside in both green and yellow cultivars in different amounts. Various anthocyanins were identified in significantly different amounts in the fruit and cyanidin 3-galactoside was the most abundant in the skin. All the different apple cultivars contained the same soluble sugars in different amounts, with fructose being the most abundant followed by sucrose, glucose and the smallest amounts of galactose and sorbitol. Our analysis found that during the process of coloration, the changes in anthocyanin content, especially cy-3-gal had an extremely significantly positive correlation with sucrose content. This study speculates that sucrose might be responsible for the regulation of cy-3-gal biosynthesis in apple skin.

Key words：apple；soluble sugar；anthocyanin；high performance liquid chromatography (HPLC)

中图分类号：S661.1 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)17-0047-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201317011

色泽是评价果品质量和商品价值的重要指标，有关果实色泽调控机理的研究也一直为人们所关注。在果实色泽的形成过程中，花青苷(anthocyanins)发挥着重要作用，其种类和分布状况与果实色泽密切相关[1]。苹果果皮中所含花青苷的种类较多，其中含量最多的花青苷是矢车菊素-3-半乳糖苷(cy-3-gal)，还有少量的矢车菊素-3-阿拉伯糖苷(cy-3-ara)、花矢车菊素-3-葡萄糖苷(cy-3-glu)、矢车菊素-3-芸香糖苷(cy-3-rut)、矢车菊素-7-阿拉伯糖苷(cy-7-ara)、矢车菊素-3-木糖苷(cy-7-xyl)、矢车菊素-3-鼠李糖苷(cy-3-rha)和矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷(cy-3,5-di-glu)等[2-5]。花青苷的形成同时受到温度、光照等外界环境及糖、激素和矿质元素等多种因素的影响[6-8]。

苹果果实中的糖主要为果糖、蔗糖和葡萄糖[9-11]，还含有少量的山梨醇[12-13]。研究表明，可溶性总糖、果糖、葡萄糖和蔗糖与花青苷合成关系密切[14-18]。Smeekens等[17]的研究指出糖既是花青苷合成的前体物质，也是调节其合成的信号物质。也有人指出在可溶性糖中，只有蔗糖对花青苷的合成有促进作用[19-20]。但是，高华君等[21]认为多数情况下糖并不是花青苷合成的限制因素。可见，果实中糖分对果皮花青苷形成的影响，仍不明确，尚存在争议。尤其是苹果中花青苷的直接前体物质UDP-半乳糖还未被成功分离，其与花青苷合成的关系也未见报道。

本实验立足黄土高原果实易着色的地理条件，选取红色苹果品种‘红星’、‘粉红女士’和黄色品种‘金冠’以及绿色品种‘澳洲青苹’为试材，通过套袋处理，加速红色品种花青苷合成进程，提高花青苷的含量，并使非红品种也出现了不同程度的着色现象。本实验比较了各色泽类型品种在果实着色过程中可溶性糖、花青苷组分及含量变化的差异，探讨可溶性糖对花青苷积累的作用，为深入研究苹果花青苷合成的调控机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验于2010年在西北农林科技大学进行，材料为5年生的红色品种‘红星’、‘粉红女士’和黄色品种‘金冠’及绿色品种‘澳洲青苹’，中间砧和基砧分别为M26和新疆野苹果(Malus sieversii(Ldb.)Roem.)，取自白水苹果实验站(海拔850m，年均温11.4℃，年日照时数2397.3h)。实验的每个品种随机选取生长状况较一致的树9株，果实负载量基本一致。4个品种在6月1日(盛花期后35d左右)套‘鸿泰’牌(鸿泰)优质双层三色纸袋；脱袋时分两组，‘红星’和‘金冠’于9月1日(盛花期后135d)脱袋，‘粉红女士’和‘澳洲青萍’于10月11日(盛花期后175d)脱袋。依据李秀菊等[22]的苹果脱袋8d后果皮花青苷含量达最高值并到采收时基本维持稳定的经验，选择脱袋后0、2、4、6、8、10 d采样，每次采样时在树体相同部位随机取4个均匀一致的果实作混合样品，重复4次。

甲醇(色谱纯) 美国Tedia公司；甲酸(色谱纯) 中国科密欧公司；果糖、葡萄糖、蔗糖、UDP-半乳糖、山梨醇、花青苷标准样为矢车菊素-3-半乳糖苷(cyaniding-3-galactoside chloride，cy-3-gal)、矢车菊素-3-葡萄糖苷(cyaniding-3-glucoside chloride，cy-3-glu) 美国Sigma公司；矢车菊素-3-阿拉伯糖苷(cyaniding-3-arabinoside chloride，cy-3-ara)、矢车菊素-3-芸香苷(cyaniding-3-rutinoside，cy-3-rut) 挪威Polyphenols A.S.公司。

1.2 仪器与设备

Waters 1525高效液相色谱仪(配Breeze数据处理系统)、1525型高精度二元高压梯度泵、2707型自动进样器、花青苷测定用2998光电二极管阵列检测器、2414示差折光检测器、Suger PakTM Ⅰ柱(6.5mm×300mm)、外加保护柱Suger-PakTMⅡ美国Waters公司；Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5μm)、外加保护柱XBridge Shield RP18(4.6mm×20mm，5μm) 迪马公司；Milli-Q Reference超纯水系统 美国Millipore公司；Eppendorf 5804 R离心机 德国Eppendorf公司。

1.3 花青苷的组分和含量测定

取1.00g果皮样品，液氮研磨成匀浆，溶解于5mL的HCl-甲醇(0.5:99.5，V/V)溶液中，4℃及黑暗条件下提取24h，然后在4℃条件下，12000×g离心10min，将1.5mL上清液转移至自动进样瓶中，用高效液相色谱仪检测。检测波长530nm，柱温35℃，流速1.0mL/min，进样5μL，梯度洗脱，溶液A(甲醇)和溶液B (10%甲酸水溶液)。洗脱条件参照Rudell等[23]的方法，略有改动：利用溶液A进行梯度洗脱，0min，17%；1min，17%；8min，35%；25min，37%；30min，17%。花青苷标准样为矢车菊素-3-半乳糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-阿拉伯糖苷和矢车菊素-3-芸香苷。配制混合标样cy-3-gal、cy-3-glu、cy-3-rut和cy-3-ara质量浓度均为1.0mg/mL，倍比稀释为0.1、0.2、0.6、0.8、1.0mg/mL标准溶液，制作标准曲线，计算测定样品中的花青苷含量。

1.4 糖的组分和含量测定

准确称取5.0g果肉，研磨成匀浆后转入30mL离心管中，加入25mL超纯水，80℃水浴超声提取30min，冷却后12000r/min离心10min，上清液转移到50mL容量瓶中，残渣加入15mL超纯水再次于80℃水浴超声提取15min，冷却后12000r/min离心10min，合并上清液，用超纯水定容至刻度，取定容后的溶液1mL，稀释10倍后取1.5mL，经0.45μm滤膜过滤，滤液用高效液相色谱仪分析，柱温80℃，检测池温度35℃，流速0.6mL/min，进样10μL。用双蒸水配制果糖、葡萄糖、蔗糖、UDP-半乳糖和山梨醇的单标溶液，使各自的质量浓度均为50mg/mL，分别取5种单标溶液制备成0.05、0.1、0.2、0.8、1.0mg/mL的混标溶液，取各质量浓度的混标溶液进行液相色谱分析，进样量为10μL，以标准品质量浓度为横坐标(X)、标准品峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线。将处理后的样品溶液进行液相色谱分析，进样量为10μL，采用外标法定量，测定果糖、葡萄糖、蔗糖、UDP-半乳糖和山梨醇含量。

1.5 数据分析

采用Excel 2003进行基础数据的整理和作图。 利用 SPSS 17.0进行相关性分析。相关系数显著性利用Pearson双侧检验的方法进行检验。

2 结果与分析

2.1 不同色泽类型苹果果实着色过程中花青苷组分及含量的变化

a.澳洲青苹；b.金冠；c.红星；d.粉红女士；峰1.矢车菊素-3-半乳糖苷；峰2.矢车菊素-3-葡萄糖苷；峰3.矢车菊素-3-阿拉伯糖苷。

图 1 果皮中花青苷高效液相色谱图

Fig.1 HPLC profiles of anthocyanins in apple peel

由图1可知，除袋后，在红色品种‘粉红女士’和‘红星’果皮中均检出cy-3-gal、cy-3-glu和cy-3-ara 3种花青苷；但非红色品种‘澳洲青苹’、‘金冠’却只检测出cy-3-gal和cy-3-ara 两种花青苷。cy-3-gal在4个品种中含量均最高，说明cy-3-gal是苹果果皮中花青苷的主要组分。

图 2 不同色泽类型品种果实着色过程中花青苷组分及含量变化

Fig.2 Changes in anthocyanin content and composition in different cultivars of apple during coloration

图2给出了不同色泽类型品种果实着色过程中花青苷组分及含量变化关系，果实除袋后，各品种花青苷含量均呈现持续增长趋势，其中除袋后1～6d的变化尤为明显，这与果实中蔗糖含量的变化趋势基本一致。cy-3-gal作为苹果果皮中花青苷的主要组分，各品种间含量差异较大，除袋后10d红色品种‘粉红女士’、‘红星’的含量分别为70.109mg/100g和62.978mg/100g，而非红色品种‘澳洲青苹’、‘金冠’的含量分别仅为29.559mg/100g和19.588mg/100g。

2.2 不同色泽类型苹果果实着色过程中糖组分及含量的变化

a.澳洲青苹；b.粉红女士；c.金冠；d.红星；峰1.UDP-半乳糖；峰2.蔗糖；峰3.葡萄糖；峰4.果糖；峰5.山梨醇。

图 3 苹果果实中可溶性糖高效液相色谱图

Fig.3 HPLC profiles of soluble sugars in apple

图 4 不同色泽类型品种果实着色过程中糖组分及含量变化

Fig.4 Changes in soluble sugar content and composition in different cultivars of apple during coloration

由图3、4可知，4个苹果品种的果实中均可分离出果糖、蔗糖、葡萄糖、UDP-半乳糖和山梨醇5种可溶性糖，不同品种果实糖组分含量有差异。依据色谱图中各糖分的峰值面积计算出果糖含量最高，蔗糖、葡萄糖含量次之，UDP-半乳糖和山梨醇含量最少。在除袋后的着色期，比较不同品种各种可溶性糖含量变化得出，果糖含量最高的为‘金冠’，含量为64.88～71.73mg/g，含量最低的‘澳洲青苹’为42.30～50.13mg/g；蔗糖含量最高的为‘粉红女士’，‘澳洲青苹’最低，分别为41.83～50.00mg/g和22.82～28.06mg/g，含量相差近1倍；葡萄糖含量最低的为‘粉红女士’，8.80～10.55mg/g，其他3个品种相差不大，含量比‘粉红女士’的高1倍左右；4个品种果实中‘红星’UDP-半乳糖含量最低，含量为其他3个品种的1/2。山梨醇的含量虽然有所差异，但含量值总体处于较低水平。各种可溶性糖含量在着色过程中表现出不同的变化趋势。葡萄糖含量先下降后上升；UDP-半乳糖和山梨醇先上升后下降；蔗糖和果糖含量在着色过程中表现出明显的增加趋势。其中红色品种‘粉红女士’、‘红星’的蔗糖含量增幅较大，为10mg/g左右，而非红色品种‘澳洲青苹’、‘金冠’的增幅相对较小。

2.3 果实着色过程中花青苷与糖含量的相关性

苹果着色过程中，果皮中的花青苷与葡萄糖、果糖、UDP-半乳糖、山梨醇及蔗糖含量之间的相关性如表1所示。4个品种果皮中花青苷均与果实中的蔗糖含量存在显著的相关，其中花青苷cy-3-gal与蔗糖的相关系数最高，达0.96以上；与果糖的相关性在0.86以上；而与葡萄糖、UDP-半乳糖、山梨醇不明显相关。

表 1 苹果着色过程中花青苷与糖含量的相关性分析

Table 1 Correlation analysis between anthocyanin and soluble sugar contents in different cultivars of apple during coloration

注：*.差异显著(P＜0.05)；**.差异极显著(P＜0.01)。

3 讨 论

3.1 花青苷与不同苹果品种着色的关系

苹果果皮中所含花青苷的种类较多，除cy-3-gal外，还有少量的cy-3-ara、cy-3-glu、cy-7-ara、cy-3-xyl、cy-3-rut、cy-3-rha[2-5]，其中cy-3-gal、cy-3-ara和cy-3-glu在前人研究中报道较多[2,5]。在本研究中，红色品种‘红星’和‘粉红女士’果皮中同样测出上述3种花青苷，而非红色品种‘澳洲青苹’和‘金冠’果皮中含有cy-3-gal和cy-3-ara 2种花青苷，这也可能是其他几种花青苷含量微少所致。

在本实验中，不论是红色品种还是非红色品种，cy-3-gal含量均最高，而且其在红色品种中的含量也远远大于非红色品种，可见在影响苹果“红色”色泽的3种花青苷cy-3-gal、cy-3-ara及cy-3-glu中，cy-3-gal是最主要的。本研究和Rudell等[23]均发现了非红色苹果‘澳洲青苹’着色时果皮中含有的cy-3-gal。由此可以推测，通过改进栽培措施，可以调节cy-3-gal的合成。

3.2 花青苷积累与糖代谢的关系

在植物生长、发育及代谢过程中，糖作为重要的调控物质已被许多生物化学、分子生物学和遗传学实验所证明[24]。在花青苷合成过程中，糖既是其合成的前体物质，也是调节其合成的信号物质[17]。一些学者研究表明苹果着色过程中果皮内花青苷与果实中可溶性总糖、果糖、葡萄糖、蔗糖及山梨醇等都具有密切的关系[14-17,25]。在本研究中，红色品种‘粉红女士’与‘红星’、非红色品种‘澳洲青苹’与‘金冠’中可溶性糖种类相同，均含有果糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇和UDP-半乳糖5种可溶性糖，苹果色泽类型的形成与果实中可溶性糖的种类并不相关；进一步分析发现花青苷积累与蔗糖和果糖含量变化正相关，而与葡萄糖、山梨醇和UDP-半乳糖的含量变化相关性不明显，其中也包括花青苷合成的直接前体物质——UDP-半乳糖。UDP-半乳糖含量在非红色品种‘澳洲青苹’中远高于红色品种‘红星’应属于品种特性，不过由此也能进一步说明UDP-半乳糖的含量与花青苷的合成并不存在明显的关系。果糖是苹果中含量最高的可溶性糖，其与花青苷合成的相关性在前人的研究中有所报道[12,15]，但是对其影响花青苷合成的机理目前尚不明确。

从果实着色过程中糖含量的变化来看，红色品种‘粉红女士’和‘红星’的花青苷含量迅速增加的同时，蔗糖含量增加且增幅较大，而非红色品种‘澳洲青苹’和‘金冠’的花青苷含量虽有所增加，但总体含量低，且蔗糖增幅也较小，说明蔗糖在苹果果实着色过程中对促进花青苷的合成可能有重要作用，这一结果与拟南芥的相关研究报道有些类似[19-20]。Hara等[16]研究发现蔗糖能显著促进红色小萝卜(Raphanus sativus)6种与花青苷合成相关基因的表达，而不能促进白色小萝卜中这6种基因的表达。白色小萝卜低水平的花青苷积累是由于其体内花青苷合成的相关基因对蔗糖的反应能力弱所致。在我们的研究中，非红色苹果品种与红色苹果品种果皮中cy-3-gal的积累与果肉中蔗糖含量均存在极显著正相关关系。结合Hara的萝卜实验，推测，红色品种与cy-3-gal相关的基因表达可能对蔗糖信号反应非常强烈，而非红品种与cy-3-gal相关的基因表达可能对蔗糖信号反应弱，这有待进一步验证。

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