大肠杆菌和假单胞菌在猪背最长肌上混合预测模型的建立

金 鑫，禹迎迎，吴菊清，徐幸莲，周光宏*

(南京农业大学 教育部肉品加工与质量控制重点实验，江苏 南京 210095)

摘 要：将大肠杆菌和假单胞菌混合接种到猪背最长肌上，分别贮藏在10、15、20、25℃条件下，并做13℃和22℃两个验证温度。结果表明：修正的Gompertz方程能很好地拟合大肠杆菌和假单胞菌的生长曲线；采用Belehradek模型能很好地描述温度对最大比生长速率(μmax)和延滞时间(Lag)的影响；采用13℃和22℃两个验证温度验证模型的可靠性，表明模型是可靠性的。

关键词：大肠杆菌；假单胞菌；混合；预测模型

Predictive Modeling of Simultaneous Growth of Escherichia coli and Pseudomonas spp. in Inoculated Pork longissimus dorsi Muscle

JIN Xin，YU Ying-ying，WU Ju-qing，XU Xing-lian，ZHOU Guang-hong*

(Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control, Ministry of Education, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Abstract：Pork longissimus dorsi muscle was inoculated with both Escherichia coli and Pseudomonas spp., and then stored at 10, 15, 20 ℃ or 25 ℃. The results showed that growth curves of E. coli and Pseudomonas spp. at different temperatures could be well described by a modified Gompertz model. The influence of temperature on growth rate (μmax) and lag phase (Lag) was well described by Belehradek model. The model developed in this study was confirmed to be reliable by validation experiments at 13 ℃ and 22 ℃.

Key words：Escherichia coli；Pseudomonas；mixed strains；predictive modeling

中图分类号：TS251.51 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)17-0087-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201317020

预测食品微生物学(predictive food microbiology，PFM)是一门建立在食品微生物学、数学、统计学和计算机科学基础上的新兴学科，通过计算机技术对食品中微生物的延迟、生长、残存和死亡进行数量化的预测，为食品行业提供数据库和软件包，目的是在不进行传统微生物检测的条件下快速对食品的安全性和货架期进行预测，实现从原料到生产流通整个过程的计算机智能化管理和监控，保证食品的质量和安全[1-3]。

传统的微生物检测技术一直依赖于对原材料及最终产品的微生物检验[4]，不能很好的监测肉品在整个生产流通过程中的微生物变化规律。微生物预测技术通过建立数学模型，可以在不进行传统微生物检测的条件下快速对食品的安全性和货架期进行预测。可以高效的监测肉品在生产流通过程中的微生物安全问题，保障肉品的质量和安全[5]。

肉类的菌相复杂，且细菌之间存在复杂的群体感应现象，单一优势腐败菌模型不能很好地反映肉类真实的腐败情况。目前，国外已有很多混合预测模型的研究[6-7]，而国内大部分的预测模型主要还是选用一种优势腐败菌或致病菌来建立预测模型。李苗云等[8]通过选用4种冷却肉的优势腐败菌建立动力学生长预测模型。本研究选择鲜猪肉的主要优势腐败菌大肠杆菌和假单胞菌，建立混合预测模型，以期为将来的混合预测模型研究提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

取宰后4h内，pH值为5.8～6.2的第6～11根肋骨处的三元猪猪背最长肌；大肠杆菌和假单胞菌菌种均分离于猪肉；营养琼脂 北京陆桥技术有限公司；所用常规化学试剂均为分析纯。

SterilGARD生物安全柜 美国Baker公司；低温生化培养箱(控温精度±0.1℃，温度均匀度±1℃) 上海Stik设备有限公司。

1.2 菌种活化

菌种在实验时分别接种活化3次以上，得到活化的大肠杆菌和假单胞菌菌液。

1.3 样品处理

在无菌生物安全柜内用燃烧的酒精棉球擦拭整块鲜肉表面两次，再用紫外线杀菌25min。用无菌手术刀剔除表面的肉，将内部的肉分割成25g(大小约4cm×4cm×1cm)的肉样，放入无菌培养皿内，将肉样4cm×4cm的两面再用紫外线各杀菌25min，平板计数法稀释10倍检测肉样上的微生物，未发现微生物生长。

1.4 接种

接种前使用生理盐水分别稀释大肠杆菌和假单胞菌的菌液，混合菌液，使大肠杆菌与假单胞菌的数量之比约为1:1，移液枪吸取200µL接种液，在肉样4cm×4cm的两个面各均匀取9个点滴加100µL接种液，使肉样的细菌数约为4(lg(CFU/g))。

1.5 肉样贮藏和微生物计数

将盛有接种肉样的平皿表面包一层保鲜膜(氧气透过率：0.143cm3/(m2•24h•Pa)，水蒸气透过量：54g/(m2•24h))，分别贮藏在10、15、20、25℃的低温生化培养箱内，并选取中间温度13℃和22℃两个验证温度。适时取出肉样，用无菌剪刀剪碎，倾入装有225mL无菌生理盐水的锥形瓶内，摇床上充分振荡15min，梯度稀释，平板计数法计数(营养琼脂培养基，培养温度30℃，培养时间48h)。每个温度做3个重复，每个重复做3个平行。

1.6 数学模型的建立和验证

1.6.1 一级模型的建立

采用修正的Gompertz函数[9]拟合一级模型：

N(t)=N0＋(Nmax－N0)×exp{－exp[2.718μmax/(Nmax－N0)×(Lag－t)]＋1} (1)

式中：t为时间/h；N(t)为t时所对应的微生物数量(lg(CFU/g))；Nmax、N0为最大和初始微生物量(lg(CFU/g))；μmax为细菌的最大比生长速率/h-1；Lag为细菌生长延滞时间/h。

实验数据采用Statistica 8.2统计分析软件，采用高斯迭代法(Gauss iterative)，进行回归分析。

1.6.2 二级模型的建立

为了描述温度对一级模型的生长动力学参数的影响，采用Belehradek(平方根)模型[10]描述：

(2)

(3)

式中：T是培养温度/℃；Tmin是一个假设概念，指微生物没有代谢活动时的温度，此时最大比生长速率为零；b是方程的常数。

将公式(1)求得的μmax、Lag和对应的温度代入方程式(2)和(3)，求得bmaxμ、Tminμ、bLag、TminLag这4个参数值，建立二级模型。

实验数据采用SPSS 13.0统计分析软件，进行回归分析。

1.6.3 模型的验证

为了评价模型的可靠性，采用建立的生长动力学模型求得13℃和22℃的预测值，与实际贮藏实验值比较，采用准确因子(Af)和偏差因子(Bf)来验证所建预测模型的可靠性[11]。Af和Bf分别表示为：

(4)

(5)

式中：Nobs是实验实测值；Npre是采用预测模型得到的与Nobs同一时间所对应的预测值；n是实验次数。

2 结果与分析

2.1 一级模型的构建

图 1 10 (a)、15 (b)、20℃(c)和25℃(d)条件下大肠杆菌和

假单胞菌的生长曲线

Fig.1 Grown curves of Escherichia coli and Pseudomonas at 10, 15, 20 ℃ or 25 ℃

根据在10、15、20、25℃贮藏条件下，大肠杆菌和假单胞菌在肉样上生长实验的实测值，采用修正的Gompertz函数拟合得到图1生长曲线和如下方程式。

10℃：

15℃：

20℃：

25℃：

表 1 10、15、20、25℃贮藏条件下大肠杆菌和假单胞菌在

猪背最长肌上的生长动力学参数

Table 1 Kinetic parameters of Escherichia coli and Pseudomonas grown in longissimus dorsi muscle at 10, 15, 20 ℃ or 25 ℃

由表1可知，修正的Gompertz方程能较好的拟合本研究中大肠杆菌和假单胞菌的生长曲线，在10、15、20、25℃贮藏条件下所得到的回归相关系数(R2)分别为0.998、0.999、0.995和1.000，说明拟合效果较好。在10、15、20、25℃贮藏条件下的μmax分别为0.119、0.188、0.228、0.366h-1，Lag分别为13.871、3.662、1.991、1.490h，说明贮藏温度升高，μmax越大，微生物生长速率越快，同时Lag越小，微生物生长的延滞时间越短。

2.2 二级模型的构建

二级模型描述温度对一级模型的生长动力学参数的影响，采用Belehradek(平方根)模型描述[10]，得到Belehradek模型如下：

(6)

(7)

由图2、3可知，采用Belehradek模型能很好地描述温度对μmax和Lag的影响，方程呈现良好的线性关系，两个方程的回归相关系数(R2)值分别为0.970和0.923。

图 2 温度与最大比生长速率的关系

Fig.2 Temperature dependence of µmax

图 3 温度与延滞期的关系

Fig.3 Temperature dependence of Lag

2.3 模型验证

根据公式(6)和(7)，可分别求出13℃和22℃条件下大肠杆菌和假单胞菌在热鲜猪肉上的生长动力学参数μmax和Lag，再将μmax和Lag代入公式(1)中可得到大肠杆菌和假单胞菌在13℃和22℃条件下的生长预测曲线，并由公式(4)和(5)得出Af分别为1.237、1.068，Bf分别为0.926、1.031(表2)。图4、5分别为预测生长曲线和实测生长曲线的对比图，可以直观的看出预测模型可以很好的预测大肠杆菌和假单胞菌的生长曲线。

表 2 13℃和22℃条件下大肠杆菌和假单胞菌生长预测值的Af和Bf

Table 2 Af and Bf of predicted values of Pseudomonas and Escherichia coli grown in pork at 13 ℃ or 22 ℃

图 4 13℃条件下的预测值与实测值

Fig.4 Growth curves predicted and observed at 13 ℃

图 5 22℃条件下的预测值与实测值

Fig.5 Growth curves predicted and observed at 22 ℃

3 讨 论

微生物行为是导致鲜肉腐败的主要原因之一，温度是影响鲜肉腐败最重要的因素[12]。有研究表明在不同的温度范围内，鲜肉的优势腐败菌是不同的，低温下假单胞菌是主要的优势腐败菌，当温度超过25℃时，则是由其他细菌占据优势地位，如大肠杆菌[13]，同时，国内已有大量关于大肠杆菌和假单胞菌预测模型的研究，所以本研究选择假单胞菌及大肠杆菌作为研究对象，建立大肠杆菌和假单胞菌混合预测模型。

一级模型使用修正的Gompertz模型函数[9]，能很好地拟合混合菌种大肠杆菌和假单胞菌的生长曲线，在10、15、20、25℃条件下所得到的回归相关系数R2分别为0.998、0.999、0.995和1.000，拟合效果非常好。二级模型描述温度对μmax和Lag的影响，采用Belehradek模型[10]描述呈现良好的线性关系，两个方程的回归相关系数(R2)值分别为0.970和0.923。

模型的验证对于模型的建立和评价具有重要意义。为了验证模型的可靠性，本研究采用建立的生长动力学模型得到的预测值，与实际在13℃和22℃条件下贮藏实验值进行比较，得到的动力学参数的Af分别为1.237、1.068，Bf分别为0.926、1.031，表明采用Gompertz函数和Belehradek模型建立的优势腐败菌的预测模型具有较高的可靠性和实用性。

随着贮藏温度的升高，细菌的µmax从0.119h-1上升到0.366h-1，说明贮藏温度越高，细菌生长速率越快。在类似的实验方法下，姜英杰等[14-15]建立的单一的优势腐败菌假单胞菌及大肠杆菌在猪背最长肌上生长预测模型，结果表明：假单胞菌的生长预测模型显示，T=10℃时，µmax=0.062h-1，T=16℃时，µmax=0.154h-1；大肠杆菌的生长预测模型显示，T=10℃时，µmax=0.068h-1，T=16℃时，µmax=0.154h-1；同时，李苗云等[16]建立的冷却肉的优势腐败菌的混合生长预测模型显示：T=10℃时，µmax=0.131h-1，T=20℃时，µmax=0.486h-1；而本研究中的混合预测模型结果显示：T=10℃时，µmax=0.119h-1，T=15℃时，µmax=0.188h-1，T=20℃时，µmax=0.228h-1。本研究的µmax明显高于姜英杰等[14]的实验结果而低于李苗云等[16]的结果，呈现接种菌种种类越多，µmax越大的现象。这可能主要与实验接种的混合菌种产生的群体感应有关。群体感应是指细菌通过分泌自诱导物信号分子进行交流，当信号分子达到一定的浓度时，可以与群体中细胞表面或者细胞内的受体结合，调节基因的表达，协调群体中所有细菌细胞的行为，从而使细菌群体表现出单个细菌无法具有的生理功能或行为[17]。细菌中常见的自诱导物信号分子有多肽(oligopeptide)、酰基高丝氨酸内酯(acylated homoserine lactone，AHL)和LuxS/Autoinducer-2 (AI-2)，它们介导的信号传递系统分别存在于革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及两类细菌之间[18]。上述建模的鲜肉优势腐败菌之间的群体感应可能相互促进了生长[19-20]。

随着贮藏温度的升高，细菌的延滞时间(Lag)从13.871h下降到1.490h，说明贮藏温度越高，细菌生长的延滞时间越短。对比姜英杰[14]和李苗云[16]等的实验结果，前者建立的假单胞菌的生长预测模型显示：T=10℃时，Lag=20.221h，T=16℃时，Lag=13.510h；大肠杆菌的生长预测模型显示：T=10℃时，Lag=29.189h，T=16℃时，Lag=5.607h；后者建立的预测模型显示：T=10℃时，Lag=7.640h，T=20℃时，Lag=1.750h；而本研究的混合预测模型结果显示：T=10℃时，Lag=13.871h，T=15℃时，Lag=3.662h，T=20℃时，Lag =1.991h。本研究的Lag明显比姜英杰等[14]的实验结果短，而比李苗云等[16]的实验结果长，基本呈现接种菌种种类越多，Lag越短的现象。这可能主要与实验接种的混合菌种有关，单一的优势腐败菌不能快速适应周围的环境，无法快速生长繁殖，所以Lag较长；在菌种种类较多的情况下，鲜肉的优势定腐败菌之间的群体感应可能促进了生长，缩短了对外部环境的适应时间，所以Lag相对较短[21]。

同时3组实验之间也存在初始接种量、接种方式、菌种来源和活性等实验条件和方法的差异，也会导致µmax和Lag存在一定的差异。

4 结 论

采用修正的Gompertz函数拟合了10、15、20、25℃贮藏条件下的混合菌种大肠杆菌和假单胞菌的生长曲线，回归相关系数(R2)分别为0.998、0.999、0.995和1.000，拟合效果非常好。

采用Belehradek模型能很好地描述温度对μmax和Lag的影响，两个方程的回归相关系数(R2)值分别为0.970和0.923。

采用13℃和22℃两个验证温度下得到的实测值与预测值进行比较，验证模型的可靠性，Af分别为1.237、1.068，Bf分别为0.926、1.031，表明模型的可靠性较好。

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