黑糯玉米色素清除亚硝酸盐及阻断亚硝胺合成的研究

盛 玮1,2,3，高 翔2,3，薛建平2,3，谢笔钧1,*

(1.华中农业大学食品科技学院，湖北 武汉 430070；2.淮北师范大学生命科学学院，安徽 淮北 235000；

3.资源植物生物学安徽省重点实验室，安徽 淮北 235000)

摘 要：在2种模拟人体胃液条件下，采用分光光度法测定不同质量浓度的黑糯玉米色素及不同反应时间对亚硝酸钠的清除能力和对亚硝胺合成的阻断能力，并与VC进行比较。结果表明：随反应质量浓度提高，黑糯玉米色素对亚硝酸钠的清除能力和阻断亚硝胺合成能力有明显提高，不同的反应时间、模拟人体胃液条件下效果有一定差异。在模拟人体胃液B条件下，色素质量浓度为0.10mg/mL，时间为1h时对亚硝酸钠的清除率达到81.37%，对亚硝胺合成的阻断率达到57.03%。通过与VC的对照及分析，得出黑糯玉米色素具有较强的清除亚硝酸钠和阻断亚硝胺合成的能力。

关键词：黑糯玉米；色素；亚硝酸盐；亚硝胺；清除；阻断

Pigments from Black Glutinous Corn Eliminate Nitrite and Block Nitrosamine Synthesis

SHENG Wei1,2,3，GAO Xiang2,3，XUE Jian-ping2,3，XIE Bi-jun1,*

(1. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China；

2. College of Life Sciences, Huaibei Normal University, Huaibei 235000, China；

3. Anhui Key Laboratory of Plant Resources and Biology, Huaibei 235000, China)

Abstract：The influence of pigment concentration and exposure time on the effectiveness of pigments from black glutinous corn (PBGC) to eliminate nitrite and block nitrosamine synthesis was investigated in two kinds of simulated human gastric juices and the results obtained were compared those of VC. At higher concentrations, PBGC was more effective in eliminating nitrite and blocking nitrosamine synthesis. Both activities varied depending on reaction time and different simulated gastric juices. In the simulated gastric juice B, 81.37% of the nitrite was eliminated after 1 h of expoure to 0.10 mg/mL PBGC and nitrosamine synthesis was blocked by up to 57.03% by PBGC. Comparing it with VC, we concluded that PBGC have a strong capability of eliminating nitrite and blocking nitrosamine synthesis.

Key words：black glutinous corn；pigment；nitrite；nitrosamine；elimination；block

中图分类号：TS201.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)17-0092-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201317021

亚硝酸盐可与仲胺、叔胺等次级胺结合，形成N-亚硝胺，而亚硝胺是目前所知的最强的化学致癌物质之一，它能引起人和动物胃、肝脏等多种脏器的恶性肿瘤[1]。正常情况下，人们直接从食物中摄入的亚硝胺极少，但N-亚硝基化合物的前体物质(硝酸盐或亚硝酸盐和胺类)广泛存在于食物中以及产生于食物在体内的代谢中。当人体摄入硝酸盐和可亚硝基化的胺类后，胃中适合亚硝基化反应的有利条件可以明显地加快N-亚硝胺形成[2]。因此，在体内清除亚硝酸盐或阻断亚硝胺合成是防治恶性肿瘤产生的有效途径之一。

黑糯玉米属于禾本科玉米属，原产于秘鲁，后引进我国。本研究所用的超黑糯玉米是濉溪县农业科学研究所以美国普通黑玉米特殊黑色遗传性状，导入到自育普通黑糯玉米自交系中，天然黑色素的含量显著高于普通黑糯玉米，其穗轴亦为深紫黑色[3]，色素属花色苷类色素[4]。已研究表明黑糯玉米色素具有较强的抗氧化活性和清除活性氧自由基的能力[5-6]。但黑糯玉米色素对亚硝酸盐的清除作用及阻断亚硝胺合成则未见报道，因此本实验在体外模拟人体胃液体系，考察黑糯玉米色素在该模拟体系中对清除亚硝酸盐及阻断亚硝胺合成的作用，为进一步开发和利用黑糯玉米色素提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

超黑糯玉米芯由安徽省濉溪县农业科学研究所提供，干燥、粉碎后过80目备用。

盐酸、亚硝酸钠、氯化钠、对氨基苯磺酸、碳酸钠、盐酸萘乙二胺、α-萘胺、95%乙醇均为国产分析纯，二甲胺水溶液(33%)为化学纯；胃蛋白酶(3500U/mg) 美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

JA1003型电子分析天平 上海奥豪斯仪器有限公司；SHH-W21-420型三用电热恒温水箱 北京东南仪诚实验室设备有限公司；Cary50紫外-可见双光束分光光度计 美国瓦里安公司；PHS-3C酸度计 上海雷磁仪器厂；FD5-3冻干机 美国SIM公司；中压快速梯度纯化层析系统 浙大智达信息工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑糯玉米色素的制备[7]

以50%的酸性乙醇为浸提剂，在50℃浸提1h，得黑糯玉米色素溶液，减压浓缩后，经大孔吸附树脂进行吸附，再用酸性乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩得后，真空冷冻干燥即得暗紫色黑糯玉米色素粉末。准确称取0.1000g黑糯玉米色素，用pH3缓冲液定容后，在最大吸收波长515nm处测定其吸光度，并按公式(1)计算花色苷含量。

(1)

式中：A515nm为吸光度；V为样品定容体积/mL；N为比色时的稀释倍数；98.2为花色苷在515nm波长处的平均消光系数；m为样品的质量/g。

按式(1)计算出黑糯玉米色素花色苷含量，并配成花色苷质量浓度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/mL的溶液，备用。

1.3.2 模拟人体胃液的制备

模拟人体胃液A：称取2.0g NaCl加蒸馏水溶解，移入1000mL容量瓶，加入7mL浓盐酸，用蒸馏水定容至刻度。

模拟人体胃液B：称取2.0g NaCl和胃蛋白酶3.2g，分别加蒸馏水溶解，移入1000mL容量瓶，加入7mL浓盐酸，用蒸馏水定容至刻度。

1.3.3 NaNO2标准溶液的制备

称取0.1000g于硅胶干燥器中干燥24h的NaNO2，加蒸馏水溶解，定容至250mL，即得NaNO2储备液(质量浓度为400μg/mL)。取储备液1.25mL稀释至100mL，即得NaNO2应用液(质量浓度为5μg/mL)，取储备液17.25mL稀释至100mL，即得NaNO2应用液B(浓度为1mmol/L)。

1.3.4 黑糯玉米色素溶液对亚硝盐清除率的测定[8-10]　

NaNO2在弱酸性条件下，与对氨基苯磺酸重氮化后，再与盐酸萘乙二胺偶合生成红色化合物，用分光光度计测出该化合物的吸光度，就可知道反应液中NaNO2含量多少。因此可通过测定相同条件下NaNO2含量的变化来反映黑糯玉米色素溶液清除能力的强弱。

取12支25mL比色管，均加入模拟胃液10.0mL，在37℃水浴保温10min，分别加入0.00、0.02、0.04、0. 06、0.08、0.10mg/mL的黑糯玉米色素溶液1.0mL，再加入5μg/mL的NaNO2标液2.0mL，分别在37℃的恒温水浴槽中恒温，10、30、60min取出，立即加入0.4%对氨基苯磺酸2.0mL，混匀，静置5min后，各加1.0mL 0.2%盐酸萘乙二胺溶液，静置15min，加水至刻度混匀，在波长538nm条件下测定吸光度A1，同时以蒸馏水代替NaNO2标准液作为空白对照实验测定吸光度A01，以蒸馏水代替黑糯玉米色素溶液的空白对照实验测定吸光度A02。

(2)

1.3.5 黑糯玉米色素对亚硝胺合成阻断率的测定[10-11]

二甲胺与NaNO2在模拟人体胃液的条件下，可生成二甲基亚硝胺。在黑糯玉米色素溶液中依次加入二甲胺与NaNO2时，黑糯玉米色素优先同NaNO2作用，使得二甲胺不能与NaNO2反应，达到阻止亚硝胺生成的目的。因此可通过比较相同条件下生成亚硝胺量的多少来反映黑糯玉米色素溶液阻断能力的强弱，生成亚硝胺量少，黑糯玉米色素溶液阻断能力就强，反之则弱。

在紫外灯照射下，二甲基亚硝胺可分解成二甲基仲胺和亚硝酸根，亚硝酸根与对氨基苯磺酸重氮化后，再与α-萘胺偶合生成红色化合物，用分光光度计测出该化合物的吸光度，就可知道上述反应液中亚硝胺含量多少。

在12支25mL比色管中均加入模拟胃液10.0mL，分别加入0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/mL的黑糯玉米色素溶液1.0mL，再加入1mmol/L的二甲胺溶液1mL，1mmol/L的NaNO2溶液1.0mL，用蒸馏水稀释至刻度，在37℃的恒温水浴槽中恒温1h。取出后，用移液管吸取1.0mL上述溶液加到直径7cm的培养皿中，加入0.5% Na2CO3溶液0.5mL，于紫外灯下照射15min。取出后立即加入1%对氨基苯磺酸1.5mL、0.1% α-萘胺1.5mL、蒸馏水0.5mL，摇匀静置15min在波长530nm处测定吸光度A1，同时做以蒸馏水代替NaNO2标液的空白对照实验测定吸光度A01与以蒸馏水代替黑糯玉米色素溶液的空白对照实验测定吸光度A02。

(3)

1.4 数据统计

实验数据使用Minitab15软件处理，进行一般线性模型分析与拟合线图分析。

2 结果与分析

2.1 黑糯玉米色素对亚硝酸盐的清除

2.1.1 黑糯玉米色素质量浓度对亚硝酸盐清除率的影响

图 1 不同黑糯玉米色素质量浓度对亚硝酸盐的清除率的影响

Fig.1 Effect of PBGC concentration on the elimination rate of nitrite

在模拟胃液A及B的反应体系中，分别加入不同质量浓度的黑糯玉米色素溶液，在37℃保温，其黑糯玉米色素对亚硝酸钠的清除效果如图1。黑糯玉米色素对亚硝酸钠的清除率呈规律性变化，即随着黑糯玉米色素质量浓度的增加而增强，且在模拟胃液B中清除效果优于模拟胃液A。当加入色素质量浓度为0.10mg/mL反应60min时，黑糯玉米色素在模拟胃液A、B中对亚硝酸钠的清除率分别为78.20%和81.37%，说明黑糯玉米色素能有效清除亚硝酸盐。

2.1.2 黑糯玉米色素反应时间对亚硝酸盐清除率的影响

图 2 反应时间对亚硝酸盐清除率的影晌

Fig.2 Effect of reaction time on the elimination rate of nitrite

在模拟胃液A及B的反应体系中，加入黑糯玉米色素溶液，在37℃分别保温不同的时间，其黑糯玉米色素对NaNO2的清除效果如图2。随着反应时间的延长，黑糯玉米色素对亚硝酸盐的清除率提高，且在模拟胃液B中清除效果优于模拟胃液A。在2种模拟胃液中，对亚硝酸盐的清除率均随黑糯玉米色素浓度的增加而增加。

2.1.3 黑糯玉米色素亚硝酸盐清除结果

表 1 亚硝酸盐清除率方差分析

Table 1 Analysis of variance for the elimination rate of nitrite by PBGC

由表1、2可知，亚硝酸盐清除率与黑糯玉米色素的质量浓度及反应时间具有线性关系，清除率随着浓度的提高和反应时间的延长而提高；亚硝盐清除率与不同模拟人体胃液亦具有线性关系，但是差异不显著。根据回归分析，R2表示清除率变异的42.5%由色素质量浓度导致的，50.0%由反应时间导致的，不同模拟人体胃液小于1.0%。

表 2 亚硝酸盐清除率回归分析

Table 2 Regression analysis for the elimination rate of nitrite

2.2 黑糯玉米色素质量浓度对亚硝胺合成阻断能力的影响结果

图 3 不同色素质量浓度对亚硝胺合成阻断率的影响

Fig.3 Effect of PBGC concentration on the blocking rate of nitrosamine synthesis

由图3可知，黑糯玉米色素对亚硝胺合成的阻断率随着其质量浓度的增加而增强，当色素质量浓度达到0.10mg/mL时，黑糯玉米色素在模拟胃液A、B中对亚硝胺合成的阻断率分别为55.65%和57.03%，说明黑糯玉米色素能有效地阻断亚硝胺的合成。

表 3 亚硝胺合成阻断率的方差分析

Table 3 Analysis of variance for the blocking rate of nitrosamine synthesis by PBGC

表 4 亚硝胺合成阻断率的回归分析

Table 4 Regression analysis for the blocking rate of nitrosamine synthesis by PBGC

由表3、4可知，亚硝胺合成的阻断率与黑糯玉米色素的质量浓度有线性关系，阻断率随着色素质量浓度的提高而提高；亚硝胺合成的阻断率与不同模拟人体胃液亦具有线性关系，差异极显著。根据回归分析，R2表示阻断率变异的99.5%由色素质量浓度导致的，0.1%由不同模拟人体胃液导致的。

黑糯玉米色素对亚硝胺合成的阻断率低于对亚硝酸盐的清除率。据已研究表明[10-15]某些抗氧化剂对亚硝胺合成的阻断率高于对亚硝酸盐的清除率，有的则相反，这可能是由于不同抗氧化剂和二甲胺竞争性与亚硝酸盐反应能力不同的原因。

2.3 黑糯玉米色素与抗坏血酸在清除亚硝酸盐与阻断亚硝胺合成能力的比较

VC具有抗氧化作用，不仅对亚硝酸盐能有效的清除，而且对亚硝胺合成的阻断能力亦很强，因此以VC为对照物，比较黑糯玉米色素溶液对亚硝酸盐的清除能力及阻断亚硝胺合成能力，其结果如表5。当黑糯玉米色素为0.10mg/mL时，对亚硝酸盐的清除率及亚硝胺合成阻断率为VC的60%左右，说明在模拟人体胃液条件下，黑糯玉米色素能有效地清除亚硝酸盐和阻断亚硝胺的合成，提示黑糯玉米色素具有一定的防癌功能。

表 5 黑糯玉米色素与VC对亚硝酸盐的清除率及对亚硝胺合成阻断率的比较

Table 5 Comparative elimination rate of nitrite and blocking rate of nitrosamine synthesis by PBGC and vitamin C

3 结 论

在2种模拟人体胃液条件下，黑糯玉米色素能有效的清除亚硝酸盐和阻断亚硝胺的合成。亚硝酸盐的清除率和亚硝胺合成的阻断率与黑糯玉米色素及作用时间成正比关系。其中黑糯玉米色素的浓度对亚硝酸盐的清除率和亚硝胺合成的阻断率的相关性较大。在模拟胃液B条件下，黑糯玉米色素清除亚硝酸盐与阻断亚硝胺合成的效果均要好于在模拟胃液A条件下。在模拟胃液B条件下，色素质量浓度为0.10mg/mL和反应时间为1h时，对亚硝酸盐的清除率达到81.37%，对亚硝胺合成的阻断率达到57.03%。

黑糯玉米色素主要是花色苷，对亚硝酸盐的清除作用和阻断亚硝胺合成可能与其抗氧化性有关。黑糯玉米花色苷分子中存在自由羟基，可与氧自由基发生反应，具有很强的抗氧化性。在模拟胃酸体系中，随花色苷浓度增大，则自由羟基增多，其清除亚硝酸盐和阻断亚硝胺合成的能力也越强[2]。

清除体内亚硝酸盐和阻断亚硝胺的合成是防癌的有效途径，黑糯玉米色素能有效地清除亚硝酸盐和阻断亚硝胺的合成。因此，黑糯玉米系列功能食品的开发对防治癌症病因的产生及心脑血管疾病可能具有更重要的价值。同时黑糯玉米加工产生籽粒果皮及穗轴等副产物进行综合利用，用于天然黑色素的生产。因此黑糯玉米用于功能食品的开发，前景可观，将会有极大社会、经济效益。黑糯玉米极有可能成为一种经济、高效、具有抗癌作用的功能食品新资源。

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