大肠杆菌YSY1产腐胺特性及相关基因分析

徐文娟1,2，刘 芳2，王道营2，诸永志2，周 涛1,*，徐为民2

(1.南京师范大学金陵女子学院，江苏 南京 210097；2.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏 南京 210014)

摘 要：利用高效液相色谱(HPLC)法对大肠杆菌YSY1菌体发酵过程中产生的腐胺和精胺进行分析，并进一步利用聚合酶链式反应(PCR)技术确定菌体基因组中存在的相关氨基酸脱羧酶基因，探讨基因表达产物对两种生物胺数量变化的影响。结果表明：精胺含量随着发酵时间的延长而减少，在1～6h内由初始的198.04μg/mL变为156.33μg/mL；腐胺含量随着发酵时间的延长而增加，在1～6h的变化范围为14.61～18.83μg/mL。菌株基因组携带有鸟氨酸脱羧酶基因，精氨酸脱羧酶基因等参与精胺和腐胺相互转化的相关酶基因并未检测出。

关键词：生物胺；腐胺；精胺；聚合酶链式反应；高效液相色谱

Putrescine-producing Property of Escherichia coli YSY1 and Related Genes

XU Wen-juan1.2，LIU Fang2，WANG Dao-ying2，ZHU Yong-zhi2，ZHOU Tao1,*，XU Wei-min2

(1. Ginling College, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China；

2. Institute of Agricultural Products Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China)

Abstract：HPLC was used to detect the levels of putrescine and spermine produced by Escherichia coli YSY1, and PCR was used to amplify decarboxylase gene. The results showed that the level of putrescine was increased during fermentation, but the level of spermine revealed a decrease at the same time. The content of spermine between 1 h and 6 h of fermentation changed from 198.04 μg/mL to 156.33 μg/mL, whereas the amount of putrescine varied from 14.61 μg/mL to 18.83 μg/mL. Ornithine decarboxylase gene was successfully amplified from Escherichia coli genome, while arginine decarboxylase gene and other related genes were not detected.

Key words：biogenic amines；putrescine；spermine；PCR；HPLC

中图分类号：TS201.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)17-0136-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201317030

大肠杆菌是人和动物体肠道内存在的正常菌群，具有很多中血清型，其中最常见的两种可以引起腹泻和肠道外的疾病[1]，食品如果被大肠杆菌污染可能会导致非常严重的疾病。

生物胺是一类含氮的碱性小分子有机化合物总称，是有机体内的正常活性成分，对动植物和微生物细胞活性具有重要的生理作用。摄入适量生物胺可以促进机体的生理活动，过量则会引起多种不适症状[2]。腐胺和精胺本身不具有毒性，但能通过与酪胺和组胺竞争解毒酶而增强其毒性[3]，二者作为生物体内重要的代谢调控物质，参与细胞内核酸和蛋白质的合成，并且与细胞的正常生长和分化以及肿瘤的发生密切相关[4-5]。生物体内的腐胺可以通过两种合成途径产生，一种是直接由鸟氨酸脱羧酶催化鸟氨酸反应产生，另一种是由精氨酸通过多种酶的作用间接反应产生；而精胺不仅仅是精氨酸的直接产物，也可以由腐胺转化而来[6]；腐胺和精胺在生物体内不仅可以相互转化，而且两者的产生可能是相同底物的不同酶反应产物。

生物胺的检测方法有很多，最常用的薄层层析(TLC)法[7]、高效液相色谱(HPLC)法[8]、气相色谱(GC)[9]法均为层析法，也有聚合酶链式反应(PCR)技术[10]和生物传感器[11]等方法。HPLC具有分析速度快、柱效高、检测灵敏度高、定量分析准确等特点，是目前测定食品中生物胺最常用的方法。本实验利用HPLC法检测菌体发酵液中不同时间点腐胺和精胺的含量，分析两种生物胺变化趋势。通过对相关基因的检测来验证腐胺和精胺产生的途径以及两种生物胺在产生过程中存在的内在联系。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大肠杆菌YSY1本实验室保存。

色胺(TRY)、2-苯乙胺(PHE)、腐胺(PUT)、尸胺(CAD)、组胺(HIS)、酪胺(TYR)、亚精胺(SPD)、精胺(SPM)标准品 美国Sigma公司；L-精氨酸、L-鸟氨酸 加拿大Bio Basic公司；营养肉汤 北京路桥技术有限责任公司；PCR Mix 广州东盛生物科技有限公司；PCR引物 生工生物工程(上海)股份有限公司；乙腈、丙酮(色谱纯)；其余试剂均为分析纯。

表 1 与腐胺代谢相关酶基因的扩增引物

Table 1 Primers used in this study

1.2 仪器与设备

细菌基因组DNA提取试剂盒 天根生化科技(北京)有限公司；琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒、TP600梯度PCR扩增仪 宝生物工程(大连)有限公司；JS-600W电泳仪、上海培清科技有限公司；2695型高效液相色谱系统 美国Waters公司；XDB-C18色谱柱 美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 HPLC法[15]

1.3.1.1 标准曲线制备

准确称量色胺、2-苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺标准品各50mg，用0.4mol/L的高氯酸(HClO4)定容至50mL，制成1mg/L的标准储备液备用。

分别量取标准储备液1mL，用0.4mol/L的HClO4配制终质量浓度分别为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0μg/mL的生物胺混合标准溶液，采用铝箔避光，4℃冰箱保存待用。

分别量取1mL不同质量浓度的生物胺混合标准溶液进行衍生：加入200μL 2mol/L NaOH溶液使其呈碱性，然后加入300μL饱和NaHCO3溶液进行缓冲，再加入1mL 10mg/L丹黄酰氯的丙酮溶液，40℃水浴中暗反应30min，加入100μL氨水终止反应，并除去多余的丹黄酰氯。最后用乙腈定容至5mL，0.45μm有机滤膜过滤后待测。

1.3.1.2 样品及样品处理

准确称取L-精氨酸、L-鸟氨酸各0.1g，加入到100mL营养肉汤中15℃灭菌20min。将活化好的菌液按照1%接种量接种到灭好菌的培养基中，220r/min振荡培养，每隔1h定时取样。取5mL菌体发酵液，15℃超声30min，加入HClO4定容至50mL，取1mL的酸提液加入200μL 2mol/L NaOH溶液使其呈碱性，然后加入300μL饱和NaHCO3溶液进行缓冲，再加入1mL 10mg/L丹黄酰氯的丙酮溶液，40℃水浴中暗反应30min，加入100μL氨水终止反应，并除去多余的丹黄酰氯。最后用乙腈定容至5mL，0.45μm有机滤膜过滤后待测。

1.3.1.3 色谱条件

采用Waters高效液相色谱系统。色谱柱：XDB-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；紫外检测波长为254nm；流动相：流动相A、B(水-乙腈)；流速：1mL/min；柱温：35℃；进样量：20μL。

1.3.2 细菌基因组DNA提取方法

参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行操作。

1.3.3 目的基因的PCR扩增、回收及测序

PCR反应体系：DNA模版2μL；引物各1μL；PCR Mix 25μL；补水至50μL。引物PUT1-F/PUT1-R、PUT2-F/PUT2-R、speC-F/speC-R反应程序：95℃预变性5min；94℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸1min，40个循环；72℃(使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链)10min。引物aguA-F/aguA-R反应程序：95℃预变性5min；94℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸1min，40个循环；72℃(使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链)10min。引物pctA-F/ptcA-R反应程序：95℃预变性5min；94℃变性1min，53℃退火0.5min，72℃延伸1min，40个循环；72℃(使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链)10min。引物speA-F/speA-R反应程序：95℃预变性5min；94℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸1min，40个循环；72℃(使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链)10min。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。参照琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒说明书进行目的基因的纯化操作。目的基因测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

2 结果与分析

2.1 HPLC法测定菌体发酵产生的腐胺和精胺结果分析

在实验选取的色谱条件下，8种常见的生物胺能够有效分离。将不同质量浓度的混合标准液依次进样并最终得到8种生物胺的标准曲线，曲线的回归方程及相关系数如表2所示。8种生物胺的峰面积与其相应质量浓度呈现线性关系，相关系数均大于0.999。以信噪比(RSN)大于3作为判断标准，苯乙胺和酪胺的检测限均为0.1μg/mL。

由图1可知，随着发酵时间的延长，发酵液中腐胺的量不断增加，由最初1h的14.61μg/mL升至6h时18.83μg/mL；而精胺的量则随着时间的延长而减少，由最初的198.04μg/mL降至156.33μg/mL。Halász等[16]对猪肉的研究中也发现了在贮藏过程中精胺和亚精胺的量会随着贮藏时间的延长而降低，腐胺、尸胺的量则会增高。Komprdá等[17]提出过腐胺和精胺代谢途径并不是单一的，可以通过其他路径合成。Krausová等[18]指出腐胺在特定酶的作用下可以转变为亚精胺，进而转化为精胺，腐胺也可以由精胺的前体物质精氨酸通过相关酶的催化而产生。由图1可知，在菌株的发酵过程中精胺的量减少的同时，腐胺的含量有明显的增加，造成这种现象的原因可能在于菌株基因组中相关酶的存在导致精氨酸在发酵过程中被竞争性的用于产生腐胺的代谢。

表 2 8种生物胺标样的回归方程、相关系数及其检测限

Table 2 Regression equation, correlation coefficients and detection limits of eight biogenic amine standards

注：X为生物胺质量浓度/(μg/mL)；Y为峰面积。

图 1 腐胺和精胺含量随时间的变化趋势

Fig.1 Changes in putrescine and spermine contents with fermentation time

2.2 大肠杆菌基因组PCR扩增结果

1. MarkerⅢ；2. MarkerⅠ；3～8.分别代表PUT1-F/PUT1-R、PUT2-F/PUT2-R、speA-F/speA-R、speC-F/speC-R、aguA-F/aguA-R、ptcA-F/ptcA-R共6种引物扩增后结果。

图 2 大肠杆菌基因组PCR扩增产物

Fig.2 PCR products of total DNA genome from Escherichia coli

以大肠杆菌基因组为模版，用不同引物进行扩增，反应体系经体积分数1%的琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示。de las Rivas等[12]针对肠道菌和乳酸菌鸟氨酸脱羧酶基因设计的引物PUT1-F/PUT1-R扩增出的条带预计在1400bp左右，第3泳道在1400bp处有很明显的条带，经基因序列分析确定是鸟氨酸脱羧酶基因。第4泳道中，引物PUT2-F/PUT2-R没有扩增出任何条带，对比de las Rivas等[12]的研究，原因可能在于引物PUT2-F/PUT2-R是针对假单胞菌鸟氨酸脱羧酶基因设计的，对于大肠杆菌鸟氨酸脱羧酶基因的特异性不强。第5泳道为引物speA-F/speA-R扩增结果，图中有明显的两条条带，经测序分析后均不是精氨酸脱羧酶基因。第6泳道中speC-F/speC-R扩增基因与PUT1-F/PUT1-R同为鸟氨酸脱羧酶基因，扩增条带长度不同，图中目的条带明显，经测序分析为鸟氨酸脱羧酶基因片段。第7、第8泳道为引物aguA-F/aguA-R、ptcA-F/ptcA-R的PCR结果，两种引物对应基因参与鲱精胺腐胺的转化过程，扩增条带经分析均不是目的条带。由此看出菌株基因组携带有鸟氨酸脱羧酶基因，精氨酸脱羧酶基因等参与精胺和腐胺相互转化的相关酶基因并未检测出。

2.3 目的基因序列分析

表 3 鸟氨酸脱羧酶基因片段与其他基因片段同源性比较

Table 3 Homology alignment of amplified fragments from putrescine and other related genes

菌株基因组通过多对引物的PCR扩增，确定携带一段约1400bp的鸟氨酸脱羧酶基因片段，测序后NCBI上的BLAST进行比对分析，由表3可知，扩增出的基因片段与大肠杆菌TB182A的鸟氨酸脱羧酶基因序列部分吻合，同源性达到97%；与解鸟氨酸拉乌尔菌鸟氨酸脱羧酶基因的相似度达到84%，说明经引物PUT1-F/PUT1-R扩增得到的鸟氨酸脱羧酶基因片段是大肠杆菌鸟氨酸脱羧酶基因的一部分。由表4可知，扩增出的基因片段编码的氨基酸序列与多种菌株的鸟氨酸脱羧酶氨基酸序列部分吻合，相似度可达99%。虽然碱基片段存在有部分的差异，但是由于密码子的简并性，碱基片段编码蛋白的相似度可以达到很高。

表 4 鸟氨酸脱羧酶氨基酸序列与其他鸟氨酸氨基酸序列同源性比较

Table 4 Homology alignment of amplified fragments from putrecine and amino acid sequences of other ornithine decarboxylase genes

3 讨 论

在对大肠杆菌YSY1发酵液中生物胺的HPLC检测中发现有大量的腐胺和精胺产生，进而用PCR法扩增出鸟氨酸脱羧酶基因。说明发酵液中腐胺主要途径是通过鸟氨酸脱羧酶途径产生的。Komprdá等[17]认为精氨酸脱羧不仅可以产生精胺和亚精胺，也可以产生鲱精胺，而鲱精胺在特定酶的作用下可以转变为腐胺，可以认为在腐胺的产生过程中精氨酸很有可能被利用作为腐胺的前体物质，从而竞争性抑制精胺的产生。这样也就解释了在实验中精氨酸的量不断减少而腐胺的量不断增加。对于腐胺代谢路径中多种酶相应基因的检测结果均为阴性，除了引物本身特异性不好的原因存在外，基因组本身不携带相应基因也可能是原因之一。

现阶段，对于腐胺和精胺两种生物胺的研究多集中在多胺的生理活性方面。例如，多胺对植物生长调节的重要作用[18]，腐胺对动植物的保护作用[19-20]等真核生物中多胺的研究。在食品微生物方面由于腐胺和尸胺在一定程度上可以作为食品腐败程度的指标，因此对于腐胺的研究也多在其定量研究方面，而对于腐胺和精胺这两种生物胺之间的相互转化关系的研究则很少，因此，在基于确定鸟氨酸脱羧酶基因的实验上，进一步研究菌体腐胺、精胺相关的脱羧酶基因以及酶本身特性的重要性不言而喻。所以，对于菌体中腐胺代谢相关基因有待进一步研究。

参考文献：

[1] ORSKOV F, ORSKOV I. Escherichia coli serotyping and disease in man and animals[J]. Canadian Journal of Microbiology, 1992, 38(7): 699-704.

[2] SHALABY A R. Significance of biogenic amines to food safety and human health[J]. Food Research International, 1996, 29(7): 675-690.

[3] EDWARDS S T, SANDINE W E. Public health significance of amines in cheese[J]. Journal of Dairy Science, 1981, 64(12): 2431-2438.

[4] BALASUNDARAM D, TYAGI A K. Polyamine-DNA nexus: structural ramifications and biological implications[J]. Molecular and Cellular Biochemistry, 1991, 100(2): 129-140.

[5] PEGG A E. Polyamine metabolism and its importance in neoplastic growth and as a target for chemotherapy[J]. Cancer Research, 1988, 48(4): 759-774.

[6] LANDETE J M, ARENA M E, PARDO I, et al. The role of two families of bacterial enzymes in putrescine synthesis from agmatine via agmatine deiminase[J]. International Microbiology, 2010, 13(4): 169-177.

[7] SHALABY A R. Simple, rapid and valid thin layer chromatographic method for determining biogenic amines in foods[J]. Food Chemistry, 1999, 65(1): 117-121.

[8] MARCÉ M, BROWN D S, CAPELL T, et al. Rapid high performance liquid chromatographic method for the quantification of polyamines as their dansyl derivatives: application to plant and animal tissues[J]. Journal of Chromatography B, Biomedical Applications, 1995, 666(2): 329-335.

[9] FERNANDES J O, JUDAS I C, OLIVEIRA M B, et al. A GC-MS method for quantitation of histamine and other biogenic amines in beer [J]. Journal of Chromatography A, 2001, 53(1): 327-331.

[10] LANDETE J M, de las RIVAS B, MARCOBAL A, et al. PCR methods for the detection of biogenic amine-producing bacteria on wine[J]. Ann Microbiology, 2011, 61(1): 159-166.

[11] LANGE J, WITTMANN C. Enzyme sensor array for the determination of biogenic amines in food samples[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2002, 327(2): 276-283.

[12] de las RIVAS B, MARCOBAL A, CARRASCOSA A V, et al. PCR detection of food bacteria producing the biogenic amines histamine, tyramine, putrescine and cadaverine[J]. Journal of Food Protection, 2006, 69(10): 2509-2514.

[13] de las RIVAS B, MARCOBAL A, MUNOZ L, et al. Gene organization of the ornithine decarboxylase encoding region in Morganella morgaii[J]. Journal of Applied Microbiology, 2007, 102: 1551-1560.

[14] NAKADA Y, ITOH Y. Identification of the putrescine biosynthetic genes in Pseudomonas aeruginosa and N-carbamoylputrescine amidohydrolase of the arginine decarboxylase pathway[J]. Microbiology, 2003, 149(Pt3): 707-714.

[15] 路永梅, 董明盛, 吕欣, 等. 高效液相色谱法测定黄酒中生物胺的含量[J]. 食品科学, 2006, 27(1): 196-199.

[16] HALÁSZ A, BARÁTH Á, SARKADI L S, et al. Biogenic amines and their production by microorganisms in food[J]. Trends Food Science Technology, 1994, 5(2): 42-48.

[17] KOMPRDÁ T, BURDYCHOVÁ R, DOHNAL V, et al. Some factors influencing biogenic amines and polyamines content in Dutch-type semi-hard cheese[J]. European Food Research and Technology A, 2008, 227(1): 29-38.

[18] KRAUSOVÁ P, KALA? P, K???EK M, et al. Content of polyamines in beef and pork after animal slaughtering[J]. European Food Research and Technology, 2006, 223(3): 321-324.

[19] GALSTON A W, SAWHNEY R K. Polyamines in plant physiology[J]. Plant Physiology, 1990, 94(2): 406-410.

[20] 张昭其, 李雪萍, 洪汉君, 等. 外源腐胺减轻芒果冷害的研究[J]. 福建农业学报, 2000, 15(2): 32-36.