西藏、川西青藏高原牧区自然发酵牦牛酸奶中优良乳酸菌的筛选及鉴定

吴 均1，赵晓娟1，陈佳昕1，杜木英1,2,3,*，阚建全1,2,3

(1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆 400715；

3.农业部农产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(重庆)，重庆 400715)

摘 要：从西藏、川西青藏高原牧区自然发酵的牦牛酸奶样品中分离出56株乳酸菌菌株，通过初筛选出遗传稳定性好、凝乳时间短、感官性能好的乳酸菌10株，再通过对各种发酵性能的测定最终筛选出7株性能优良的乳酸菌。这7株菌的凝乳时间在6～8h之间，凝乳时的酸度在69.99～92.31°T之间，冷藏期间滴定酸度增加了8.46～20.94°T，活菌数为107～1011CFU/mL，产生的乙醛和双乙酰含量分别为14.21～30.76μg/mL和0.51～1.55μg/mL。通过16S rDNA分子鉴定得出：TG1-1为干酪乳杆菌或副干酪乳杆菌，TG1-11为副干酪乳杆菌，TG3-2和DLDQ2-1为干酪乳杆菌，TG2-4、KDLL-2为屎肠球菌，TG3-4为坚忍肠球菌。

关键词：牦牛酸奶；乳酸菌；发酵性能；鉴定

Isolation and Identification of Lactic Acid Bacteria from Natural Yak Yogurt in Tibet Plateau Pastoral Areas of

Tibet and Western Sichuan

WU Jun1，ZHAO Xiao-juan1，CHEN Jia-xin1，DU Mu-ying1,2,3,*，KAN Jian-quan1,2,3

(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China；

2. Chongqing Special Food Programme and Technology Research Center, Chongqing 400715, China；

3. Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Agro-products on Storage and Preservation (Chongqing),

Ministry of Agriculture, Chongqing 400715, China)

Abstract：Totally 56 strains of lactic acid bacteria were isolated from self-made yoghurt samples collected from Tibet plateau pastoral areas of Tibet and western Sichuan. Ten strains with better fermentation performance LAB were obtained through preliminary screening by genetic stability, coagulation time, titratable acidity and sensory evaluation. Finally, 7 trains of LAB with excellent fermentation performance were selected. Coagulation time and titratable acidity at the coagulation time of these 7 strains were 6－8 h and 69.99－92.31 °T. During cold storage, the titratable acidity was 8.46－20.94 °T, and the viable bacterial pollution was 107－1011 CFU/mL. The contents of produced acetaldehyde and diacetyl were 14.21－30.76 μg/mL and 0.51－1.55 μg/mL. Based on 16S rDNA sequence analysis, TG1-1 was identified as Lactobacillus casei or Lactobacillus paracasei; TG1-11 as Lactobacillus paracasei, TG3-2 and DLDQ2-1 as Lactobacillus casei, TG2-4 and KDLL-2 as Enterococcus faecium; and TG3-4 as Enterococcus durans.

Key words：yak yogurt；lactic acid bacteria；fermentation performance；identification

中图分类号：TS252.1 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)17-0150-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201317033

西藏、川西高原牧区具有丰富的牦牛奶资源，其营养成分比普通牛奶要高。当地的牧民世代沿用传统而古老的自然发酵方法制作酸奶，酸奶的组织细腻、风味独特、口感纯正且保持时间长久，表明牦牛酸奶中含有传代性好、凝乳状态好、风味独特的优良乳酸菌[1]。乳酸菌不仅可以改善食品的风味，提高食品营养价值，它还具有多种生理功能，如促进食物营养成分的分解和吸收、调节机体的胃肠道正常菌群、维持和改善机体的正常机能、降低胆固醇、增强机体免疫力、抗氧化活性等[2-4]，现已广泛应用于食品加工、医药保健和饲料发酵等方面[5]。乳酸菌的酸化能力、后酸化能力、香气物质等发酵性能对发酵乳产品的质地和风味起着至关重要的作用[6]。目前我国所采用的乳酸菌发酵剂多从国外引进，无论是在菌种的收集筛选、鉴定，还是在生理功能和作用机理研究方面尚处于初级阶段，因此，对国内自然发酵酸奶中乳酸菌进行收集和筛选，开发出具有自主知识产权的乳酸菌发酵剂具有重要的生产意义[7-8]。

本实验对从西藏、川西高原牧区采集的牦牛酸奶中分离的乳酸菌进行筛选及鉴定，以期获得发酵性能优良的乳酸菌菌株，将其应用于乳酸菌发酵剂的生产，为提高牦牛酸奶品质，降低生产成本和推动我国乳酸菌的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌种、试剂与培养基

菌种：从西藏、川西青藏高原不同地区牧民家庭自然发酵的牦牛酸奶中分离出56株乳酸菌菌种。

牦牛奶粉 西藏高原之宝牦牛乳业股份有限公司；牛肉膏、蛋白胨、琼脂粉、葡萄糖(生物试剂) 北京奥博星生物技术有限公司；酚酞、亚硫酸氢钠、碘、氢氧化钠、碳酸氢钠、邻苯二胺、牛胆盐、氯化钠(分析纯) 成都市克隆化工试剂厂；盐酸(分析纯) 重庆科试化学有限公司；DNA提取试剂盒 大连宝生物工程有限公司；Lambda DNA/HindⅢ Marker、1kb DNA MarkerⅠ 北京鼎国生物技术有限责任公司；引物 生工生物工程(上海)股份有限公司。

MRS培养基根据文献[9-10]中的方法进行配制；牦牛乳培养基：将牦牛奶粉和水按比例配成12%的牦牛乳，115℃灭菌10min。

1.2 仪器与设备

HPX-9052MBE电热恒温培养箱、YXQ-SG46-280S不锈钢手提式压力蒸汽灭菌锅 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SW-CJ-1FD型洁净工作台 中日合资苏州安泰空气技术有限公司；UV-2450S(E)型紫外分光光度计、Biospec-mini型DNA/RNA/蛋白质分析装置 日本岛津公司；S1000伯乐1000系列高性能PCR仪、164-5050伯乐基础电源电泳仪 美国Bio-Rad公司；Syngene GeneGenius凝胶成像系统 基因有限公司；GL-88B涡旋混合器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；HB031金属恒温加热器 上海博彩生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌筛选

1.3.1.1 菌株遗传稳定性测定

将充分活化的菌株按体积分数3%的比例接入牦牛乳培养基中，40℃发酵，记录凝乳时间(选择凝乳时间4～8h的菌株)，凝乳后置于4℃冰箱中冷藏24h，观察色泽和组织状态并测定酸度。如此连续转接20次，选择凝乳状态稳定的菌株进行下一步筛选。

1.3.1.2 酸度的测定

参照GB 5413.34—2010《乳和乳制品酸度的测定》方法测定，实验重复3次，取其平均值。

1.3.1.3 感官评价

由10名食品专业的师生对牦牛酸奶的色泽、气味和滋味、组织状态进行感官评价[11-12]。

表 1 发酵乳感官评价表

Table 1 Criteria for sensory evaluation of fermented milk

注：感官评分值均取整数。

1.3.2 乳酸菌发酵性能测定

1.3.2.1 酸化能力的测定

将充分活化的菌种按3%的比例接入牦牛乳培养基中，40℃培养0、1、2、3、4、5、6、7、8h，测定相应酸度。每次实验重复3次，求平均值。

1.3.2.2 后酸化能力的测定

将充分活化的菌种按3%的比例接入牦牛乳培养基中，40℃培养，凝乳后放入4℃冰箱冷藏。测定酸乳冷藏1、5、10、15、20d的酸度。每次实验重复3次，求平均值。

1.3.2.3 乳酸菌菌株生长特性测定

乳酸菌在MRS液体培养基中的生长曲线测定：将充分活化的菌株按3%的比例接入5mL MRS液体培养基中，37℃培养，在0、2、4、6、8、10、12、16、18、20h取样，于600nm波长处测定OD值，以未接种的液体培养基为空白调零。每次实验重复3次，求平均值。

乳酸菌在牛乳培养基中生长曲线测定：将充分活化的菌株按3%的比例接入5mL牦牛乳培养基中，40℃培养，在0、2、4、6、8、10、12、16、18、20h取样。直接测定牛乳的OD值是不行的，但用NaOH和EDTA处理使其变透明后可进行测定。取2mL待测液加入18mL 0.2% EDTA溶液，用0.25mol/L的NaOH调pH值至12.5，于410nm波长处测定OD值，以未接种的灭菌乳经相同处理后作空白调零[13]。每次实验重复3次，求平均值。

1.3.2.4 产乙醛能力测定[14]

将充分活化的菌株按3%的比例接入牦牛乳培养基中，40℃培养，凝乳后放入4℃冰箱冷藏。测定冷藏12、24、36h样品的乙醛含量。每次实验重复3次，求平均值。

(1)

式中：V1为碘标准溶液用量/mL；c为碘标准溶液的浓度，取0.1mol/L；V2为空白实验碘标准溶液用量/mL；0.022为每毫升克当量乙醛的质量/g；100为试样量/mL。

1.3.2.5 产双乙酰能力测定[15]

将将充分活化的菌株按3%的比例接入牦牛乳培养基中，40℃培养，凝乳后放入4℃冰箱冷藏。测定冷藏12、24、36h样品的双乙酰含量。每次实验重复3次，求平均值。

双乙酰含量/(mg/mL)=4×(1.2E－0.01) (2)

式中：E为OD值；1.2为光密度和双乙酰含量的换算关系；0.01为校正值。

1.3.2.6 冷藏期间活菌数的变化

采用平板菌落计数法[16]。将凝固牦牛酸奶于4℃冷藏1、5、10、15、20d，取样品经系列梯度稀释后采用平板计数法，测定活菌数。每次实验重复3次，求平均值。

1.4 分子生物学鉴定

1.4.1 基因组DNA的提取

将乳酸菌按3%的接种量接种到MRS液体培养基中，37℃厌氧培养至对数生长期，用试剂盒提取各实验菌株的DNA，具体操作参照说明书。并进行0.8%琼脂糖凝聚电泳检测DNA纯度，目标片段应在23kb左右。

1.4.2 16S rDNA PCR扩增

采用细菌16S rDNA基因的通用引物做PCR扩增[17]，正向引物为27f(5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’)，反向引物为1541r(5’-AAG GAG GTG ATC CAG CC-3’)，目标产物约为1500bp，产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.4.3 16S rDNA序列同源性分析

将菌株测序结果用DNAMAN软件双向拼接后，采用BLAST软件对拼接结果与GenBank数据库中已知序列进行相似性分析，并用MEGA 5软件包将所测菌株序列与模式菌株序列以Clustal W进行序列比，采用Neighbor-Joining法绘制系统发育树。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌菌株的筛选

由表2可知，经转接20次后从56株乳酸菌中筛选出发酵时间短、凝乳状态好、性能稳定的10株菌：TG1-1、TG1-11、TG2-4、TG3-2、TG3-4、TG1-8、TG1-10、DLDQ2-1、KDLL-2、KDGG-2。这10株乳酸菌均有较好的感官性状，其中TG1-1和TG1-11的凝乳时间短、产酸能力较强且具有爽口的酸味；TG3-4和KDLL-2凝乳时间较长、产酸能力稍弱，有浓厚的酸奶香味；其余6株菌株产酸能力适中。所有菌株发酵的牦牛酸奶均无明显乳清析出现象。在酸奶生产过程中，凝乳时间太短或太长，都对酸奶的品质有一定影响。因此本实验选取凝乳时间为6～8h的乳酸菌。用这10株乳酸菌发酵的牦牛酸奶在4℃冷藏24h后的滴定酸度为85～101°T，酸乳产品要求的酸度是70～110°T，这完全符合生产标准要求。

表 2 乳酸菌筛选结果

Table 2 Primary screening of LAB strains

2.2 酸化能力的测定

图 1 发酵过程中乳酸菌酸度的变化

Fig.1 Change in yoghurt acidity during fermentation by various LAB strains

由图1可知，TG1-8和TG1-10在发酵8h时的滴定酸度分别为41.43、43.12°T，说明它们的产酸能力很弱，不适合再做进一步筛选；TG1-11的产酸速度最快且酸度增加最多，酸度增加了69.99°T；TG1-1、TG3-2和DLDQ2-1酸度增加也较多，酸度最终达到92.31、89.66、86.92°T。虽然产酸速率大有利于发酵时间的缩短，但酸奶会因酸度增加过快而使组织收缩，容易析出乳清，但是以上4株乳酸菌的乳清析出量很少，说明它们的发酵性能非常好；KDGG-2的最大滴定酸度为64.12°T，没有达到70°T，但实际生产中一般会采用两种或两种以上的菌株混合发酵，可以弥补单菌株产酸不足的缺陷。

2.3 后酸化能力的测定

图 2 冷藏期间乳酸菌酸度的变化

Fig.2 Change in yoghurt acidity during cold storage

由图2可知，7株乳酸菌发酵的牦牛酸奶在冷藏期间的酸度都呈上升趋势。KDGG-2的酸度增加最大，增加了30.96°T，说明其后酸化能力强，不适合再做进一步筛选；TG2-4在冷藏期间酸度增加的最小，酸度仅增加了8.46°T，TG3-4、KDLL-2的酸度分别增加了10.90、13.69°T，说明它们有很好的抗后酸化能力；TG1-1、TG1-11、TG3-2和DLDQ2-1在冷藏期间的酸度变化不是最大，但由于初期酸度较高，因此它们酸度一直较高。由此可知，除KDGG-2外的其余7株菌均具有很好的抗后酸化的能力。

2.4 乳酸菌的生长曲线测定

图 3 乳酸菌在MRS培养基中的菌体OD600nm值变化曲线

Fig.3 Change in OD600 nm during growth of various LAB strains in MRS medium

图 4 乳酸菌在牦牛乳中的菌体OD410nm值变化曲线

Fig.4 Change in OD410nm during growth of various LAB strains in yak milk

由图3可知，所菌株的在前2h没有大的变化，在经过较短的延滞期后进入指数生长期，在10h左右到达生长高峰进入稳定期；在衰亡期，包含活菌以及一部分被自身代谢产物抑制甚至杀死的菌，从该曲线并不能确定稳定期和衰亡期的界限，只能确定菌体的最佳收获时间为10h。由图4可知，牦牛乳中所有菌株都遵循了对数生长曲线的规律，延滞期为2h左右。菌株在培养过程中经过较短的延滞期进入指数生长期，在10h左右达到生长高峰进入稳定期。

2.5 产乙醛能力

图 5 冷藏期间乙醛含量的变化

Fig.5 Change in acetaldehyde content in fermented milk during cold storage

由图5可知，在冷藏过程中，乙醛含量的变化趋势随菌株的不同而不同。TG1-1发酵的酸奶有较高的乙醛含量，高达30.76μg/mL，TG1-11菌株次之为28.33μg/mL。根据前面酸度测定的结果，这两株菌的产酸量也较大。这与Guzel-Seydim等[18]的研究一致，乙醛的产生与酸度有很显著的正相关，酸度越大，乙醛含量也越大。据文献[19]报道，乙醛的产生主要依赖菌体内的苏氨酸醛缩酶，但一般来说乳杆菌的酶活性较高，产乙醛也越多，这与后面DNA测定结果一致。

2.6 产双乙酰能力

图 6 冷藏期间双乙酰含量的变化

Fig.6 Change in diacetyl content in fermented milk during cold storage

由图6可知，酸奶中双乙酰含量变化很小。TG2-4的双乙酰含量最多且增加的也最多，最高为1.55μg/mL，36h增加了0.53μg/mL；TG1-1的双乙酰含量变化最小，增加了0.21μg/mL。这种微小变化可能会使酸奶的风味发生很大变化，但是酸奶的风味不是由某一种物质决定，而是多种风味物质综合作用的结果。因此不能将一种物质的含量作为衡量酸奶风味好坏的绝对条件，必须要综合各种物质的呈味效果。

2.7 冷藏期间活菌数的变化

图 7 冷藏期间乳酸菌活菌数的变化

Fig.7 Change in viable bacterial number in fermented milk during cold storage

根据国标GB19302—2010《发酵乳》规定，发酵乳中的乳酸菌活菌数应大于106CFU/mL。乳酸菌对人体有一定的保健作用，因此酸奶中应大量存在活性乳酸菌。由图7可知，活菌数呈现先增大后降低的趋势，在冷藏期间所有菌株的活菌数均符合国家标准。前5d的活菌数呈上升趋势，在冷藏的第5天达到最高，这与Mutlub[20]的研究结果一致。TG1-11的活菌数下降幅度很大，从最初的109CFU/mL左右下降到107CFU/mL左右；4℃冷藏20d后，KDLL-1的活菌数最低，而TG1-1一直保持很高的活菌数，最终活菌数为108CFU/mL。活菌数随时间的增加而减少，是因为酸奶的酸度持续增加和代谢产物不断累积从而抑制甚至杀死乳酸菌[21]。

2.8 基因组DNA提取结果

1. TG1-1；2. TG1-11；3. TG2-4；4. TG3-2；

5. TG3-4；6. DLDQ2-1；7. KDLL-2。图9同。

图 8 DNA凝胶电泳图

Fig.8 Agarose gel electrophoresis of genomic DNA

由图8可知，Marker为Lambda DNA/HindⅢ Marker，各菌株基因组DNA凝胶电泳在目标位置处均有亮带，说明该方法具有可行性。

2.9 16S rDNA PCR扩增结果

由图9可知，Marker为1000bp DNA MarkerⅠ，各菌株16S rDNA扩增产物在1500bp左右均有条带，说明各菌株目标片段均被成功扩增。

图 9 16S rDNA片段扩增图

Fig.9 Agarose gel electrophoresis of 16S rDNA amplified products

2.10 16S rDNA序列同源性分析

为了确定7株菌的种属，因此对其16S rDNA序列进行分析。将拼接序列结果与GenBank中已知序列进行对比，并做1000次的Bootstraps检验，删除两端未对齐的碱基，用拼接序列结果与其同源性标准序列构建进化树，结果见图10。

1. TG1-1；2. TG1-11；3. TG2-4；4. TG3-2；5. TG3-4；6. KDLL-2；8. DLDQ2-1。

图 10 7株菌与6株标准菌株的16S rDNA系统发育树

Fig.10 Phylogenetic tree of 7 LAB strains and 6 standard stains based on 16S rDNA sequences

由图10可知，系统发育树呈现2个较大分支，其中TG1-1与JN5609.24.1和EU780145.1处于同一分支，同源性为100%，由于干酪乳杆菌与副干酪乳杆菌亲缘性很高[22]，因此，菌株TG1-1为副干酪乳杆菌或干酪乳杆菌；TG1-11与EU780145.1处于同一分支，同源性为98%，为副干酪乳杆菌；TG3-2和DLDQ2-1与JN5609.24.1处于同一分支，同源性为98%和99%，为干酪乳杆菌；TG3-4与HM057978.1处于同一分支，同源性为98%，为坚忍肠球菌；TG2-4、KDLL-2与JN560912.1处于同一分支，同源性为100%，因此，菌株TG2-4、KDLL-2为屎肠球菌。

3 结 论

西藏、川西青藏高原不同地区牧民家庭自然发酵的牦牛酸奶样品中分离出56株乳酸菌菌株，通过初筛和复筛选出了发酵性能优良4株杆菌和3株球菌。这7株菌具有凝乳时间短、酸化能力强、后酸化能力弱、产乙醛能力强的特点。通过16S rDNA分子鉴定得出：TG1-1为干酪乳杆菌或副干酪乳杆菌，TG1-11为副干酪乳杆菌，TG3-2和DLDQ2-1为干酪乳杆菌，TG2-4、KDLL-2为屎肠球菌或坚忍肠球菌，TG3-4为坚忍肠球菌。肠球菌不像大多数的乳酸菌一样，它不被认为是“安全可靠”(GRAS)。对于肠球菌的安全评价仍存有争议，对具体的菌株需要进一步的研究，因此，只有4株杆菌具有乳制品发酵剂的开发潜力。

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