沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌共增菌培养基的研制

王永志1，余以刚1，黄秀丽2，肖性龙1,*，吴 晖1

(1.华南理工大学食品安全与检测中心，广东 广州 510640；2.广东省惠州市质量计量监督检测所，广东 惠州 516003)

摘 要：为研制出一种能够同时选择性富集沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的培养基，对多种抑制剂和促进剂进行筛选。实验优化出的最佳培养基配方为：胰蛋白胨15g、大豆蛋白胨5g、磷酸二氢钾2.5g、葡萄糖2.5g、氯化钠35g、氯化锂0.5g、牛胆盐0.1g、甘露醇2g、亚碲酸钾0.3mg，蒸馏水1000mL。沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌等目标细菌在此共增菌培养基中均能快速生长，以103CFU/mL为初始菌浓，18h后菌浓能达到107CFU/mL，而非目标菌在此肉汤中的生长受到抑制。结果表明，此培养基可以用于沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的选择性共增菌。

关键词：选择性共增菌；沙门氏菌；志贺氏菌；金黄色葡萄球菌

An Enrichment Broth for Simultaneous Growth of Salmonella, Shigellosis and Staphylococcus aureus

WANG Yong-zhi1，YU Yi-gang1，HUANG Xiu-li2，XIAO Xing-long1,*，WU Hui1

(1. Detection Centre for Food Safety, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China；

2. Huizhou Quality and Measuring Supervision Testing Institute, Huizhou 516003, China)

Abstract：In order to develop an enrichment broth for the simultaneous growth of Salmonella, Shigellosis and Staphylococcus, several candidate agents were added to pre-formulated broth to observe their growth speeds. The optimal performance was obtained with the enrichment broth composed of 15 g of tryptone, 5 g of soya peptone, 2.5 g of monopotassium phosphate, 2.5 g of glucose, 35 g of sodium chloride, 0.5 g of lithium chloride, 0.1 g of bile salt, 2 g of mannitol and 0.3 g of potassium tellurite in 1000 mL of distilled water. Results showed that Salmonella, Shigellosis and Staphylococcus aureus could concurrently enrich in this broth and the concentration of bacteria could increased from 103 CFU/mL to 107 CFU/mL during 18 h. The growth of non-target bacteria was suppressed in this broth. Therefore, it may be a promising broth for simultaneous detection of the three pathogens in a single platform.

Key words：selective enrichment；Salmonella；Shigellosis；Staphylococcus aureus

中图分类号：Q93.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)17-0171-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201317037

由食源性微生物导致的疾病一直是食品安全的最大隐患之一。据世界卫生组织统计，全球每年死于饮食被污染的食物或水而引发的肠胃疾病的人数高达220万[1]。全球各国也都投入了大量的人力物力监管和控制食源性微生物的传播和危害。其中，沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌都是重点的监控对象。作为肠道致病菌，沙门氏菌和志贺氏菌存在广泛、危害巨大。沙门氏菌在世界范围内都是最主要的食物和水的污染源之一[2]，而志贺氏菌主要是困扰着发展中国家，据统计亚洲每年1000人中平均有2.1个感染者[3]。值得注意的是，这两种细菌的儿童发病率都显著高于成人[3-4]。金黄色葡萄球菌不仅能给污染食品，还对临床病人的健康造成很大危害。与志贺氏菌类似，金黄色葡萄球菌污染情况在贫困国家更为严重[5]。在中国，沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌也对居民健康带来巨大隐患。一份关于中国1994—2005年发生的食源性疾病的报告显示，超过30%的相关案例都与这3种细菌有关，沙门氏菌更是高居首位[6]。为了降低这3种食源性疾病对民众健康带来的隐患和政府财政带来的负担，一套快速有效的监控系统应该尽快被建立。

研究人员已经提出了多种方法来检测和监控食源性微生物。依赖于基因的检测方法——PCR以及衍生方法由于其快速、高效获得了广泛的应用[7]。多重荧光PCR的应用更是大大提高了同时检测多种细菌的效率。一般说来，多重荧光PCR检测需要一个前增菌的过程，在此过程中如何有效体现特异选择性，成为当前共增菌培养基研究的热点之一。至今已有许多关于选择性共增菌培养基的研究。俞彩娥[8]研究了沙门氏菌和志贺氏菌共增技术。

Kim等[9]提出并评估了一种能够同时增菌培养沙门氏菌、大肠杆菌O157和单增李斯特菌的培养基。本课题组也曾研制了一种能够同时培养沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌的共增菌培养基[10]以及一种可用于水产品中沙门氏菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌前增菌的培养基[11]。

本实验提出一种能够同时培养沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的增菌培养基。在设计好的基础培养基中，添加各种促进剂和抑制剂等各种添加剂，通过测定这3种细菌在添加了各种物质的培养基中生长情况并加以进行筛选。确定最终配方之后，再对这个新的共增菌培养基进行初步的评估和验证。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)(CMCC 47731)、鲍氏志贺氏菌(Shigellosis boydii)(CMCC 51346)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(CMCC 41002) 本实验室保藏；小肠耶尔森氏菌(CMCC 52225)、大肠杆菌O157:H7(ADCPC 931)、绿脓杆菌(CMCC 10211)、副溶血性弧菌(CMCC 20015)、变形杆菌(CMCC 40150)、单增李斯特菌(CMCC 34761)、蜡样芽孢杆菌(CMCC 70331)等来自东莞出入境检验检疫局馈赠。

1.1.2 培养基与试剂

胰蛋白胨大豆肉汤、Baird-Parker氏培养基、HE琼脂、沙门氏菌显色培养基、志贺氏菌显色培养基、营养琼脂、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、卵增液、多黏菌素B等 广东环凯微生物科技有限公司；甘氨酸、柠檬酸钠、丙酮酸钠、水杨酸、甘露醇、煌绿水、牛胆盐、叠氮化钠、萘啶酮酸、亚碲酸钾等 上海阿拉丁生物科技有限公司；其余试剂皆为分析纯。

1.1.3 仪器与设备

752S紫外分光光度计 上海棱光技术有限公司；THZ-92C气浴振动培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；PHS-3C pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；LRH-250A生化培养箱 韶关市泰宏医疗器械有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基础培养基的选择

根据3种细菌的不同特性以及生长的不同条件，考虑简便性和经济性，选择沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌的共增菌培养基的基础成分。基础培养基的配方和制作方法为：称取胰蛋白胨15g、大豆蛋白胨5g、磷酸二氢钾2.5g、葡萄糖2.5g、氯化钠35g加入到1000mL蒸馏水中，混匀，调节pH值至7.2～7.4，灭菌后存于4℃备用。

1.2.2 共增菌培养基中添加成分的筛选

参考之前的研究[10-11]和3种目标菌各自选择培养基中的特异成分，选择可能的抑制剂和促进剂进行实验。甘氨酸、柠檬酸铁铵、氯化锂、柠檬酸钠、丙酮酸钠、水杨酸、甘露醇、煌绿水、牛胆盐、叠氮化钠、萘啶酮酸、乳糖等被列为添加成分，以一定的质量浓度加入基础培养基中，接种后37℃、180r/min培养24h，在600nm波长处测定其光密度(OD)值。确定该共增菌培养基的配方和制作方法。

1.2.3 目标菌在此培养基中的生长评估

已确定的培养基中分别接入一定量的目标菌，使其初始菌浓为103CFU/mL，37℃培养18h。用可见分光光度计测定600nm波长处的OD值。以营养肉汤为空白对照，实验重复3次。

1.2.4 非目标菌在此培养基中的生长

观察大肠杆菌O157、单增李斯特菌、小肠耶尔森氏菌、副溶血性弧菌、绿脓杆菌、变形杆菌和蜡样芽孢杆菌等在此培养基中的生长情况。在制备的培养基中分别接入菌浓为103CFU/mL的沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌3种目标菌及杂菌，37℃培养18h。用可见分光光度计测定600nm波长处的OD值。以营养肉汤为空白。实验重复3次。

2 结果与分析

2.1 共增菌各成分的确定

2.1.1 抑制剂的选择

由表1可知，甘氨酸对志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的抑制强于对沙门氏菌，18g/L质量浓度条件下3种细菌几乎完全不能生长。选择加入氯化锂较低剂量时，3种细菌的生长状况在可接受的范围之内。结果发现一定质量浓度的柠檬酸钠对沙门氏菌具有促进作用，对志贺氏菌生长影响较低，却显著抑制金黄色葡萄球菌的生长。硫代硫酸钠对金黄色葡萄球菌和志贺氏菌抑制强烈，较低的剂量就会完全抑制这两种菌生长。煌绿水对金黄色葡萄球菌的抑制作用要远远大于另外两种菌。叠氮化钠对3种细菌的抑制作用都非常强烈，而多黏菌素B和萘啶酮酸一样，只对沙门氏菌和志贺氏菌有抑制作用，对金黄色葡萄球菌的作用较为温和。在较低剂量之下，牛胆盐对3种菌的抑制作用均不强烈。亚碲酸钾对沙门氏菌和志贺氏菌的抑制作用较低。由于金黄色葡萄球菌能够产生凝固酶且其染色体上存在cysM，亚碲酸钾的抑制作用便不能发挥[12]。事实上，含有亚碲酸钾的琼脂培养基往往被用来分离金黄色葡萄球菌。实验也表明，在含有0.3mg/L亚碲酸钾的培养基中，沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的生长情况良好。

表 1 各促进剂和抑制剂对3种细菌生长的影响

Table 1 Effect of candidate agent on the growth speed of three bacteria

注：－.未检测出。表2同。

2.1.2 促进剂的选择

丙酮酸钠可为微生物生提供必需的碳源，对3种细菌的作用都比较温和。卵增液能够显著地促进金黄色葡萄球菌的生长，对志贺氏菌有强烈的抑制作用。水杨酸对3种菌都有一定的促进生长作用。与沙门氏菌和志贺氏菌不同的是，金黄色葡萄球菌能够分解乳糖，故其在含有乳糖的培养基中生长状况更好。实验表明，低剂量的甘露醇对3种细菌都具有促进作用，在一定质量浓度条件下对鲍氏志贺氏菌的促进作用尤为明显。

综合考虑以上添加物质对沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌生长情况的作用，以能够使3种菌同时快速的生长以及对其他杂菌有抑制作用为标准，选择牛胆盐、氯化锂作为抑制剂，选择甘露醇作为促进剂。

2.1.3 共增菌选择培养基的制备

称取胰蛋白胨15g、大豆蛋白胨5g、磷酸二氢钾2.5g、葡萄糖2.5g、氯化钠35g、氯化锂0.5g、牛胆盐0.1g、甘露醇2g添加到990mL蒸馏水中，加热溶解。冷却至室温后矫正pH值为7.2。称取0.3mg亚碲酸钾溶解入10mL已灭菌的蒸馏水中，得到亚碲酸钾溶液。在无菌条件下，亚碲酸钾溶液加入原溶液中。所得培养基分装贮存于4～6℃。命名该培养基为SSS肉汤。

2.2 目标菌在复合培养基(SSS)中增菌效果的验证

沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌在SSS肉汤和营养肉汤(nutrient broth，NB)中的生长情况分别如图1～3。沙门氏菌在SSS中生长时，12h就能达到近109CFU/mL的浓度，与在营养肉汤中的生长情况类似，说明在SSS肉汤中沙门氏菌扩增效率高。由于氯化锂带来的一定的抑制作用，志贺氏菌在SSS肉汤中的生长速率要慢于在营养肉汤中的速率，可以看出，在SSS肉汤中生长12h后，志贺氏菌菌浓接近105CFU/mL，生长20h时可达108CFU/mL。与营养肉汤相比，金黄色葡萄球菌在SSS肉汤的生长曲线呈现出滞后性，大约需要6h才能进入对数生长期。12h后金黄色葡萄球菌的菌液浓度可达到106CFU/mL，18h可达109CFU/mL。综上所述，沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌在SSS肉汤中均能快速生长，18h能分别达到菌液浓度107CFU/mL，能够满足后续检测的需要。

图 1 沙门氏菌在共增菌培养基肉汤和营养肉汤中的生长情况

Fig.1 Growth curve of Salmonella in SSS and nutrient broths

图 2 志贺氏菌在共增菌培养基肉汤和营养肉汤中的生长情况

Fig.2 Growth curve of Shigellosis in SSS and nutrient broths

图 3 金黄色葡萄球菌在共增菌培养基肉汤和营养肉汤中的生长情况

Fig.3 Growth curve of Staphylococcus aureus in SSS and nutrient broths

2.3 非目标菌在SSS肉汤中的生长情况

表 2 目标菌和非目标菌在SSS肉汤中的生长情况

Table 2 Growth speed of target and non-target bacteria in SSS broth

以营养肉汤作对照，其他的食源性致病菌在SSS肉汤中的生长情况也被测定。由表2可知，目标菌株沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌在该复合增菌肉汤中均能快速生长，18h培养情况下的生长情况能够满足检测的要求。非目标菌株大肠杆菌O157、蜡样芽孢杆菌、小肠耶尔森氏菌、变形杆菌、副溶血性弧菌和绿脓杆菌的生长则受到抑制。其中蜡样芽孢杆菌、小肠耶尔森氏菌和绿脓杆菌完全不能生长，大肠杆菌O157、副溶血性弧菌和绿脓杆菌生长受到抑制，18h生长后菌液浓度低，不会对目标菌的检测等造成干扰。

3 讨 论

当前的食品安全问题愈演愈烈，引起社会和媒体的极大关注，也给相关监管部门带来了巨大的压力。单平台、高通量、高效率是给食源性致病菌检测提出的新挑战，也推动了一系列相关新技术的发展，如多重PCR[13]、多重荧光PCR技术[14]、DNA微阵列杂交技术[15]、免疫微阵列技术[16]等。

本实验讨论了一种能够同时富集沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的共增菌培养基。应用SSS肉汤可以对可能含有多个菌株污染的样品进行增菌检测。该培养基除含有微生物生长必需的碳源、氮源等外，还有牛胆盐、氯化锂、亚碲酸钾等，可以有效对除沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌之外的非目标菌进行抑制[17]。研究显示，氯化锂对单增李斯特菌具有较强烈的抑制作用[18]，而牛胆盐可以抑制革兰氏阳性菌的生长。亚碲酸钾对霍乱弧菌、肠杆菌的生长有着广泛的抑菌作用[11,19]，较高浓度的氯化钠也可以带来一定的抑菌作用[20]，从而有效保证了SSS肉汤的选择性。

本实验表明在应用SSS肉汤的情况下，初始浓度为103CFU/mL的3种细菌在培养18h之后浓度可达107CFU/mL，可以满足PCR检测限的要求。非目标菌株在此培养基中的生长受到抑制，表现为完全不生长或者生长活性低。常规的PCR检测前增菌包括两个过程，一是所有可能污染微生物的增菌过程，然后再有相应的选择性增菌过程。SSS肉汤的应用可以合并两个过程为一，增菌后能够直接应用于后续的检测中，提高了检测效率。

今后的研究可以深入探讨各种抑制剂的抑菌机理和3种目标菌同时存在的生长情况，并研究SSS肉汤对压力损伤细菌和酸损伤细菌的恢复能力。通过人工污染的方法进行实际样品的检验，探讨如何消除培养基的存在对检测结果的影响。

参考文献：

[1] World Health Organization. WHO fact sheet N.237: Food safety and foodborne illness[EB/OL]. (2007-08-08) [2012-04-30]. http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs237/en/index.html.

[2] TODD E C. Epidemiology of foodborne diseases: a worldwide review[J]. World Health Statistics Quarterly, 1997, 50(1/2): 30-50.

[3] von SEIDLEIN L, KIM D R, ALI M, et al. A multicentre study of Shigella diarrhoea in six Asian countries: disease burden, clinical manifestations, and microbiology[J]. PLoS Medicine, 2006, 3(9): e353.

[4] United States Department of Agriculture. Report to Congress 1998. FoodNet: an active surveillance system for bacterial foodborne diseases in the United States[EB/OL]. (2008-06-02) [2012-04-30]. http://www.fsis.usda.gov/ophs/ rpcong98/rpcong98.html.

[5] World Health Organization. Assuring food safety and quality: WHO and FAO[EB/OL]. (2006) [2012-04-30]. http://www.who.int/publications/list/guidelines_food_control/zh/.

[6] WANG S J, DUAN H L, ZHANG W, et al. Analysis of bacterial foodborne disease outbreaks in China between 1994 and 2005[J]. FEMS Immunology & Medical Microbiology, 2007, 51(1): 8-13.

[7] DE-DIN. ISO 20838—2006 Microbiology of food and animal feeding stuffs - polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens - Requirements for amplification and detection for qualitative methods.

[8] 俞彩娥. 沙门菌和志贺菌通用增菌液增菌效果实验观察[J]. 预防医学情报杂志, 2006, 22(3): 369-370.

[9] KIM H, BHUNIA A K. A SEL, a selective enrichment broth for simultaneous growth of Salmonella enterica, Escherichia coli O157:H7, and Listeria monocytogenes[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2008, 74(15): 4853-4866.

[10] YU Yigang, WU Hui, LIU Yuanyuan, et al. A multipathogen selective enrichment broth for simultaneous growth of Salmonella enterica serovar Enteritidis, Staphylococcus aureus, and Listeria monocytogenes[J]. Canadian J Microbiol, 2010, 56(7): 585-597.

[11] XIAO Xinglong, LI Yijuan, QIN Yiying, et al. A multipathogen selective enrichment broth for simultaneous growth of Salmonella spp., Vibrio parahaemolyticus, and Vibrio cholerae[J]. J General and Applied Microbiology, 2010, 56(6): 465-474.

[12] 庞慧, 叶长芸, 徐建国. 一些细菌的亚碲酸钾抗性[J]. 疾病监测, 2007, 22(5): 350-352.

[13] XU Y G, CUI L C, TIAN C Y, et al. A multiplex polymerase chain reaction coupled with high-performance liquid chromatography assay for simultaneous detection of six foodborne pathogens[J]. Food Control, 2012, 25: 778-783.

[14] OSCAR F D, PALMIRO P, SANTO M, et al. A filtration-based real-time PCR method for the quantitative detection of viable Salmonella enterica and Listeria monocytogenes in food samples[J]. Food Microbiology, 2009, 26: 311-316.

[15] CHIANG Y C, YANG C Y, LI C, et al. Identification of Bacillus spp., Escherichia coli, Salmonella spp., Staphylococcus spp. and Vibrio spp. with 16S ribosomal DNA-based oligonucleotide array hybridization[J]. Int Food Microbiol, 2006, 107: 131-137.

[16] CHEN C S, DURST R A. Simultaneous detection of Escherichia coli O157:H7, Salmonella spp. and Listeria monocytogenes with an array-based immunosorbent assay using universal protein G-liposomal nanovesicles[J]. Talanta, 2006, 69: 232-238.

[17] JACOBSEN C N. The influence of commonly used selective agents on the growth of Listeria monocytogenes[J]. International Journal of Food Microbiology, 1999, 50: 221-226.

[18] TAORMINA P. Comparison of growth of a combined strain Listeria monocytogenes challenge study inoculum in different chloride salt solutions[C]//Sabin St: International Association for Food Protection, 2012.

[19] 朱敏, 梅玲玲, 程苏云. 改良李斯特菌增菌液的研究[J]. 中国卫生检验杂志, 2007, 17(2): 293-295.

[20] 孙之南, 王娟, 鲁梅芳, 等. 氯化钠对几种常见菌的抑制作用[J]. 盐业与化工, 2006, 36(1): 12-15.