产纤维素酶的金橙黄微杆菌YT9分离鉴定及其培养条件优化

缪 静，李坦坦，程仕伟*，梁会会，崔海洋

(鲁东大学生命科学学院应用微生物研究所，山东 烟台 264025)

摘 要：从渤海近海土壤中分离1株产纤维素酶菌株，经形态、生理生化指标和16S rDNA分析鉴定为金橙黄微杆菌。对该产酶菌株进行碳源、氮源、金属盐、培养温度、pH值和诱导物质量浓度的优化，确定最佳培养基组分和条件为：果糖20g/L、羧甲基纤维素钠(CMC) 0.5g/L、蛋白胨8g/L、硫酸亚铁铵2g/L、K2HPO4 2g/L、NaH2PO4 2g/L、MnSO4 1g/L、pH6.5、培养温度30℃、接种量4%。优化后纤维素酶系中以羧甲基纤维素酶活力为最高，为226.27U/mL，其次是β-葡萄糖苷酶和微晶纤维素酶。

关键词：金橙黄微杆菌；纤维素酶；培养条件优化；分离；鉴定

Isolation, Identification and Culture Characteristics of Cellulase-producing Exiguobacterium sp. YT9

MIAO Jing，LI Tan-tan，CHENG Shi-wei∗，LIANG Hui-hui，CUI Hai-yang

(Institute of Applied Microbiology, College of Life Sciences, Ludong University, Yantai 264025, China)

Abstract：Strain YT9 with high-yield cellulase was screened from coastal soil samples, and the morphological, physiological and biochemical characteristics as well as 16S rDNA sequence homology of the selected strain were studied. Finally, the strain was identified as Exiguobacterium sp. Meanwhile, medium composition and culture conditions for cellulase production were optimized. The optimal medium for higher production of cellulase consisted of 20 g/L glucose, 0.5 g/L CMC, 8 g/L tryptone, 2 g/L ferrous alum, 2 g/L K2HPO4, 2 g/L NaH2PO4, and 1 g/L MnSO4. The maximum activity of CMCase was 226.27 U/mL at pH 6.5, 30 ℃ and 4% inoculum. At the same time, the activities of cellobiohydrolase and β-glucosidase were lower than the endoglucanase activity.

Key words：Exiguobacterium sp.；cellulase；optimization；isolation；identification

中图分类号：Q556.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)17-0210-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201317045

纤维素酶是一类可以水解β-1,4葡萄糖苷键，使纤维素分解成纤维二糖和葡萄糖的一个酶系的总称[1]，包括内切葡萄糖苷酶(endoglucanase，EC 3.2.1.4)，又称羧甲基纤维素酶(CMCase)，作用于纤维素分子内部的非结晶区；外切葡萄糖苷酶(cellobiohydrolase，EC 3.2.1.91)，又称微晶纤维素酶(C1酶)，作用于纤维素线状分子末端；β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，EC 3.2.1.21)，将纤维二糖水解和短链寡糖成葡萄糖[2-6]。纤维素酶在酿造、饲料、食品加工、纺织、造纸和洗涤等行业具有广泛的应用，特别是近年来随着能源和环境问题的日益严峻，利用纤维素酶降解秸秆原料生产燃料乙醇等新能源，以及辅助秸秆还田等研究课题收到日益关注[7-12]。

纤维素酶主要由真菌和细菌产生，目前研究集中于以木霉(Trichoderma)和曲霉属(Aspergillus)等真菌产生的纤维素酶[13]，然而这些菌株仍存在着产酶成本高、酶活性不稳定、作用pH值范围狭窄等问题[14-15]。细菌来源的纤维素酶具有真菌所不具备的特性，如耐碱性、耐热性等，并且细菌易于培养且生长和产酶周期短[16-17]，因此对于细菌的研究是整个纤维素微生物降解研究中非常重要的环节。本实验对筛选的一株产纤维素酶的细菌菌株进行分离鉴定与培养条件研究，以期为纤维素酶的研究提供新的种质资源。

1 材料与方法

1.1 菌株筛选

采集山东烟台近海的有机质丰富土壤，稀释后涂布筛选培养基：CMC 10g/L、酵母粉5g/L、NaHCO3 3g/L(单独灭菌)、MgSO4•7H2O 0.1g/L、FeSO4•7H2O 5mg、MnSO4 5mg、琼脂20g/L，pH9.0。在30℃培养72h后，用0.2%的刚果红染色并用1mol/L的NaCl溶液脱色20min后测定透明圈与菌落直径比，挑取直径比较大菌落接种复筛培养基(在初筛培养基基础上添加20g/L葡萄糖，pH7.0)发酵24h后测定酶活力。

1.2 试剂与仪器

3,5-二硝基水杨酸 美国BBI公司；羧甲基纤维素钠盐(CMC) 天津科密欧化学试剂公司，其余试剂均为分析纯或生物纯。

TU-1810紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；SW-CJ-1B超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；H1850R离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；HZQ-Q全温摇床 哈尔滨东联电子技术开发有限公司。

1.3 菌株鉴定

观察菌落形态，经简单染色、革兰氏染色和芽胞染色后镜检。菌株生理生化鉴定方法参照《工业微生物实验技术》[18]，结果与《常见细菌系统鉴定手册》[19]对照。菌株YT9序列由上海美吉生物医药科技有限公司测定。细菌基因组抽提试剂盒提取菌株基因组，得到DNA进行电泳分析。PCR引物：16S-F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，16S-R：5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’。PCR程序设定：预变性95℃ 5min；循环95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 90s，35个循环；延伸10min。电泳检测，切胶测序。将获得序列提交NCBI，通过BLAST进行同源性比较，构建系统发育树。

1.4 发酵产酶培养优化

活化菌种按体积分数4%的接种量接入不同发酵培养基(pH7.0)中，30℃、200r/min摇床培养24h后测定酶活力，确定对菌株产酶有较大影响的碳源、氮源和金属离子，用于后续发酵工艺的优化。

采用优化培养基组分，在不同培养温度、pH值和诱导物质量浓度条件下测定纤维素酶的活力。

1.5 纤维素酶活性测定

取1mL发酵液，在4℃、5000r/min离心5min，取其上清液用于酶活力测定，培养条件优化过程以测定羧甲基纤维素酶活力为主。

1.5.1 羧甲基纤维素酶(CMCase)活力[20]

取适当稀释度的酶液1mL，加入0.1mol/L pH8.0磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液溶解的1g/100mL CMC 1mL，50℃水浴催化反应15min。反应结束后加入3mL的DNS试剂，混合均匀煮沸5min使样品显色。冷却后加水25mL使其混合均匀，在540nm波长处测定OD540nm。空白管：取等量酶液煮沸10min后灭活，再加入底物溶液和DNS液，测定过程同样品测定。根据标准曲线的回归方程，计算出反映体系的酶活力。酶活力定义为：每分钟水解纤维素生成1μg葡萄糖的量为1个酶活力单位(U)。

1.5.2 滤纸酶(FPase)活力[21]

将50mg的滤纸浸入1mL 0.1mol/L pH8.0磷酸盐缓冲液中，后加入1mL适当稀释的酶液，在50℃的水浴条件下反应60min，加入3mL DNS试剂终止反应，沸水浴中煮沸5min，用蒸馏水稀释至5倍后于530nm波长处比色。扣除酶液和底物的空白后，通过标准曲线计算酶的活力，以每分钟水解滤纸生成1μg葡萄糖的量为1个酶活力单位(U)。

1.5.3 β-葡萄糖苷酶(β-Gase)活力[22]

以1mL 0.5%的用0.1mol/L pH8.0磷酸盐缓冲液配制的水杨素为底物，其余同CMCase。

1.5.4 微晶纤维素酶(C1)活力[23]

取1mL用0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH8.0)配制的1g/100mL微晶纤维素溶液，加入1mL适当稀释的酶液，于50℃反应120min后，5000r/min离心10min除去不溶物。然后取1mL反应上清液用DNS法测定还原糖。酶活力单位定义为：以每毫升酶液每分钟产生1μg葡萄糖为1个酶活力单位(U)。

2 结果与分析

2.1 菌株筛选与鉴定

采用刚果红染色法从烟台芝罘岛近海区域筛选到产生透明圈菌株107株。选取透明圈与菌落直径比较大的18株菌进行发酵产酶复筛，其结果见表1，直径比与CMCase酶活性测定值基本呈现正相关，其中9号菌产酶量较大，为61.30U/mL，故选取进行下一步研究。

表 1 产酶菌株筛选

Table 1 Secondary screening of 18 selected strains

由图1可知，菌株YT9呈点状小菌落，圆形扁平，表面光滑，边缘齐整，金橙黄，不透明。简单染色发现前期培养物中菌体呈细长、不规则的杆状。后期培养物杆状缩短，呈现球状，但无明显的杆-球变换周期。芽孢染色未见芽孢，革兰氏染色呈阳性(图2)。对菌株YT9进行各项生理生化实验，结果见表2，对照《常见细菌系统鉴定手册》确定应为微小杆菌属。

图 1 菌株YT9的菌落形态

Fig.1 Colony morphology of strain YT9

20.0μm

图 2 菌株YT9革兰氏染色显微形态

Fig.2 Microscopic morphology of strain YT9 after Gram staining

表 2 菌株YT9生理生化实验结果

Table 2 Physiological and biochemical characteristics

注：＋.反应呈阳性；－.反应呈阴性。

由图3可知，以菌株YT9的总DNA为模板，采用16S rDNA通用引物进行PCR扩增，检验得到一条1431bp的条带，切胶测序得到16S rDNA序列。将序列在NCBI上提交(GenBank序列号：JX274652)并进行同源性比较，结果显示同源性较高的为Exiguobacterium sp. BCH4、Exiguobacterium sp. BTAH1等8个菌株，同源性大于99%。采用MEGA软件进行系统发育树分析，结果如图4所示。由于细菌分类学家认为当16S rDNA序列的同源性高于97%时，可以认为是属内同种；低于95%则认为是属外种，因此可判定目标菌株为金橙黄微杆菌。

图 3 菌株YT9的16S rDNA的PCR产物电泳分析

Fig.3 Electrophoretic analysis of 16S rDNA PCR products from strain YT9

图 4 菌株YT9基于16S rDNA的系统发育树

Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence

2.2 培养组分对菌株YT9产酶的影响

图 5 碳源对菌株YT9发酵产酶的影响

Fig.5 Effect of carbon resource on CMCase production

图 6 氮源对菌株YT9发酵产酶的影响

Fig.6 Effect of nitrogen resource on CMCase production

不同碳源对金橙黄微杆菌YT9产酶的影响见图5，发酵培养基(g/L)：碳源20、CMC 3、蛋白胨10、酵母粉5、K2HPO4 2、NaH2PO4 2、MgSO4•7H2O 1。可知，果糖是该菌株所利用的最佳碳源，其次是葡萄糖和麦芽糖，其余碳源均不理想。氮源对菌株YT9产酶的影响见图6，发酵培养基(g/L)：果糖20、CMC 3、氮源10、K2HPO4 2、NaH2PO4 2、MgSO4•7H2O 1。可知，蛋白胨和硫酸亚铁铵的产酶率比其余氮源高。有机氮源有利于细菌生长，综合考虑利用蛋白胨和硫酸亚铁铵作为后续发酵培养基氮源。

图 7 金属盐对菌株YT9发酵产酶的影响

Fig.7 Effect of metal salt on CMCase production

金属盐对金橙黄微杆菌YT9产酶的影响见图7，发酵培养基(g/L)：果糖20、CMC 3、蛋白胨8、硫酸亚铁铵2、K2HPO4 2、NaH2PO4 2、金属盐1。可知，添加MnSO4的产酶率最高，其次是ZnSO4和NaCl较高，剩余的金属盐与空白组比较都处于相差不大的水平。

2.3 培养条件对菌株YT9产酶的影响

图 8 初始pH值对菌株YT9发酵产酶的影响

Fig.8 Effect of initial pH on CMCase production

图 9 培养温度对菌株YT9发酵产酶的影响

Fig.9 Effect of culture temperature on CMCase production

发酵培养基初始pH值对菌株YT9产酶的影响见图8，采用的培养基(g/L)：果糖20、CMC 3、蛋白胨8、硫酸亚铁铵2、K2HPO4 2、NaH2PO4 2、MnSO4 1。可知，最佳产酶pH值为6.5，在pH6～9范围内酶活力变化较小，当pH值高于9时，酶活性急剧下降，因此过高pH值不利于菌株YT9产酶。

金橙黄微杆菌YT9在30℃培养时产酶较高(图9)，低于30℃和高于32℃时菌株的产酶均较低，由此可看出菌株的适宜产酶温度为30～32℃，其中在30℃时酶活性最大。

图 10 诱导物质量浓度对菌株YT9产酶活性的影响

Fig.10 Effect of inducer concentration on CMCase production

诱导物CMC质量浓度对金橙黄微杆菌产纤维素酶的影响见图10，在0.5g/L的CMC添加时获得最大纤维素酶活性，为226.27U/L。随着CMC质量浓度超过0.5g/L，酶活性呈现逐渐降低趋势。

2.4 菌株YT9的纤维素酶系活性比较

图 11 菌株YT9纤维素酶系中各酶组分活性比较

Fig.11 Comparison of cellulase activity

将纤维素降解为葡萄糖是3种纤维素酶协同作用的结果，因此保证纤维素酶系均衡是纤维素的降解利用的重要因素[24-25]。金橙黄微杆菌YT9发酵24h后纤维素酶系活性比较见图11。羧甲基纤维素酶活性最高，β-葡萄糖苷酶和微晶纤维素酶分别为CMCase活性的82.19%和9.85%，微晶纤维素酶活性略偏低，纤维素降解能力的评价因素——滤纸酶(FPase)活力为CMCase活力的23.74%。金橙黄微杆菌来源纤维素酶还未见报道，有关该来源酶的纯化和酶学性质研究正在深入进行，对扩展纤维素酶的种质来源具有积极意义。

3 结 论

通过对近海土壤分离的产纤维素酶菌株进行鉴定，确定为金橙黄微杆菌YT9。菌株YT9发酵生产纤维素酶的最优碳源是果糖，氮源为蛋白胨、硫酸亚铁铵，MnSO4为纤维素酶的激活因子。金橙黄微杆菌YT9产纤维素酶的最适培养温度30℃、初始pH6.5、CMC诱导物质量浓度0.5g/L。最优条件下获得的羧甲基纤维素酶活力为226.27U/mL，且β-葡萄糖苷酶和微晶纤维素酶均有一定量存在，本研究为今后纤维素酶的研究提供新的种质资源。

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