高产DHA寇氏隐甲藻突变株的筛选

佘 隽1,2，田 华1，陈 涛3，何东平1,2,*

(1.武汉轻工大学食品科学与工程学院，湖北 武汉 430023；2.湖北百信食品有限公司研发中心，湖北 武汉 430040；

3.中国科学院武汉病毒研究所，湖北 武汉 430071)

摘 要：以寇氏隐甲藻ATCC30772(C. cohnii ATCC30772)为出发菌株，经60Co-γ射线辐照诱变，根据生长发育、苏丹黑B染色镜检、生物量、含油率和DHA含量等指标，经初筛、复筛，选出最佳突变株2.4k-2A2-5，其平均DHA含量达到39.04%，比出发株提高了3.39%，油脂产量和含油率比出发株分别提高了51.66%和63.37%，其DHA产量为7.14g/L发酵液，比出发株提高了近56.92%。

关键词：寇式隐甲藻；60Co-γ射线；DHA

Screening of High-yield DHA-producing Crypthecodium cohnii Mutant

SHE Jun1,2，TIAN Hua1，CHEN Tao3，HE Dong-ping1,2,*

(1. College of Food Science and Technology, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China；2. Hubei Pashun Foods

Co. Ltd., Wuhan 430040, China；3. Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430071, China)

Abstract：The original strain C. cohnii ATCC 30772 was irradiated by 60Co-γ ray. Mutant 2.4k-2A2-5 was selected as a desired positive mutant according to its growth and development, Sudan black B staining, biomass, oil content and DHA content, following screening and rescreening. The average DHA production was 39.04%, which was 3.39% higher than the original strain. The yield and content of oil produced by this mutant was 51.66% and 63.37%, respectively, which were also higher than those by the original strain. The DHA yield (measured in 7.14 g/L fermented liquid) was increased by 56.92% compared to that produced by the original strain.

Key words：Crypthecodium cohnii；60Co-γ rays；DHA

中图分类号：TS222.1 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)17-0230-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201317049

寇氏隐甲藻是生产二十二碳六烯酸(DHA)的良好藻种，其突变株可以通过生物发酵产生DHA，DHA是人体必需脂肪酸，对维持人体大脑和视力(包括老人、胎儿和婴幼儿等)的生长发育有促进作用及延缓衰老的作用，并防治心脑血管疾病，调节免疫功能，抑制肿瘤，防治恶性疾病，缓解心理和行为异常等方面也有积极作用，在保健食品和医学上具有重要的价值[1]。Swaaf等[2]利用乙醇为碳源对C. cohnii ATCC30772进行分批补料培养220h后，藻细胞的生物量、总脂及DHA产量分别达到85、35g/L和11.7g/L。湖北福星生物科技有限公司利用寇氏隐甲藻工业化发酵生产含甘油三酯型DHA油脂的方法，经发酵制得DHA含量高于50%的油脂，DHA生产率达到4.6g/(L•d)。福建师范大学工业微生物工程研究中心利用寇氏隐甲藻FJU-145进行微生物发酵法生产DHA，其DHA含量高达48%～50%；并分别通过亚硝基胍、硫酸二乙酯和氯化锂复合诱变，DHA生物合成量提高了4.7倍。

利用寇氏隐甲藻藻株作为出发菌株，通过60Co-γ射线辐照致使出发株发生突变，筛选出突变株，以期改善培养条件，优势生长，增加生物量，累积更多的油脂和DHA。利用突变株进行培养发酵，工艺简单可控，所用物料来源丰富，容易操作，经济指标好和制剂性能稳定的亮黄色至金黄色的油脂，无异味，适合于液体发酵大规模批量生产。诱变育种不仅可以提高藻株的生产能力，而且还可以改进产品质量，扩大品种，简化生产工艺。其方法简便，收效显著。因此，在科学实验和生产上得到了广泛应用。

1 材料与方法

1.1 藻种

寇氏隐甲藻ATCC30772(C.cohnii ATCC30772)由广东微生物菌种保藏中心提供。

1.2 培养基

固体培养基、一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基均为常用的藻类培养基。

1.3 试剂与仪器

酵母浸膏 北京奥博星生物技术有限公司；苏丹黑B 国药集团化学试剂有限公司；三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris Buffer) 天津市博迪化工股份有限公司；纤维素酶、碱性蛋白酶 南宁庞博生物工程有限公司；DHA甲酯化标准品(纯度≥99%)、十七烷酸甲酯标准品(纯度≥99%) 美国Sigma公司。

XB-K-25血球计数板 上海市求精生化试剂仪器有限公司；XSP-BM-2CA生物显微镜 上海上光新光学科学有限公司；7890A气相色谱仪 美国安捷伦科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 藻种的活化

将寇氏隐甲藻ATCC 30772藻种接种于富集培养基，于26℃恒温培养箱中静止培养2～3d，藻种经富集后，在分离平板上划线分离，每个样品划3个平板，26℃恒温培养，经多次分离获得单藻落藻株。挑取纯的单藻落镜检，选择特征典型的作为活化种子，转接液体培养基扩大培养。

1.4.2 种子培养[3]

1.4.2.1 一级种子培养

从平板中寇氏隐甲藻纯的单藻落处挑取一环，接种于一级种子培养基，置于全温摇床上，26℃、180r/min条件下培养48h。

1.4.2.2 二级种子培养

将一级种子按10%的接种量转接到二级种子培养基中，26℃、180r/min条件下培养48h。

1.4.2.3 发酵培养

将二级种子按10%的接种量接种到发酵培养基中，26℃、180r/min条件下培养7d。

1.4.3 制备出发藻液

从活化后的寇氏隐甲藻ATCC 30772种子中挑选出藻落较大、较纯，生长较快的进行镜检，选择藻细胞较大，特征典型的经一、二级种子培养后，转接至发酵培养基，培养至对数期[4]。由于该藻种常常有大小两种孢囊混合生长，而只有大孢囊有高的DHA产量和油脂含量，因此，镜检时还要注意尽量选择大孢囊较多，小藻较少的作为出发藻液。

1.4.4 60Co-γ辐照诱变[5]

取9支灭菌的试管，每管分别装入1.4.3节中培养至对数生长期的寇氏隐甲藻ATCC 30772藻液5mL。每3个为1组，共分为3组，进行60Co-γ射线辐照，辐照剂量分别为0.8、1.6、2.4kGy。留取一部分原藻液作为对照组。

1.4.5 PDA平板观察

取不同培养时期的藻细胞培养液，用移液枪吸取少许滴在干净的载玻片上，盖上盖玻片，并用乳酸石炭酸棉蓝染色液和碱性复红涂片，测量直径，比较藻落大小。在显微镜下观察藻细胞的形态并照相记录[6]。

1.4.6 初筛

1.4.6.1 测量藻落直径

在对照组及经0.8、1.6、2.4kGy共3个剂量60Co-γ射线辐照处理组所涂平板中各随机挑选10个单藻落，测量藻落直径。

1.4.6.2 扩大培养[7-8]

选择3个辐照处理组中经测量直径大于7mm的藻落，每组选10个，共30个，各挑取一环加入到装有9mL无菌水的试管中，在无菌条件下制成悬浮液。各吸取1mL喷涂于琼脂平板上，每管涂2个平板，每组20个，共60个平板。每组20个平板分别标记为：0.8k-1～0.8k-10(辐照剂量为0.8kGy的处理组)、1.6k-1～1.6k-10(辐照剂量为1.6kGy的处理组)、2.4k-1～2.4k-10(辐照剂量为2.4kGy的处理组)，置于恒温恒湿培养箱培养3d。

1.4.6.3 第一轮初筛

在以上60个平板中挑选生长快速、无污染、单藻落多且直径大的平板30个：0.8k-1平板2个、0.8k-2平板2个、0.8k-4平板2个、0.8k-8平板2个、0.8k-9平板2个、1.6k-1～1.6k-5平板各2个、2.4k-1～2.4k-3平板各2个、2.4k-5平板2个、2.4k-8平板2个。每个平板选出2个较纯的单藻落，各接一个平板，作为一株单株，共60株，标记为平板号+A1/A2/B1/B2，如0.8k-1A1/A2/B1/B2，每株进行平板观察和涂片镜检。通过比较藻落大小、形状、颜色、长势以及光滑与粗糙度、镜检藻细胞大小、密度、纯度、生物学特征等指标，并与对照组藻落对比，筛选较好的单株20株。其中包括0.8kGy处理组6株，1.6kGy处理组6株，2.4kGy处理组8株，作为20株诱变株进行下一轮筛选[9]。

1.4.6.4 第二轮初筛

将以上挑选出的20株单株各取一环接入装有5mL液体培养基的试管中，每株接5管，共100个试管，置于摇床上，26℃、180r/min条件下振荡培养8d后，进行涂片及苏丹黑B染色镜检。根据有无污染、培养物大小、典型性状、生长积累量、培养液澄清度、显微镜涂片纯度等指标筛选出综合各指标较好的27株突变株，作为初筛藻株，准备复筛。其中包括0.8kGy处理组8株，1.6kGy处理组10株，2.4kGy处理组9株[10]。

1.4.7 复筛

1.4.7.1 摇瓶培养[11]

将1.4.6.4节中筛选的突变株及出发株，分别经一、二级种子培养后，以10%接种量转接于装有100mL培养液的500mL的三角瓶中，每株接8瓶，置于摇床上，26℃、180r/min条件下振荡培养7d。放瓶后分别取样进行苏丹黑B染色镜检。每株突变株的8瓶藻液每瓶取10mL共80mL在40～55℃干燥测干质量，其余培养液5000r/min离心20min，收集湿藻体[6]。根据生长发育、苏丹黑B染色镜检、生物量、油脂产量、含油率和DHA产量等指标，筛选优良突变株进行下一轮摇瓶培养。

1.4.7.2 后处理

将湿藻体按湿质量:纯清水为1:1～1:3的比例，制成悬浮液，加碱性蛋白酶和纤维素酶，(60±1)℃水浴湿培，同时搅拌8h，镜检藻体破壁后，加入95%乙醇脱水30～60min，静置分层，使乙醇-水相与藻泥分层。将乙醇-水相和藻泥分别加入4号溶剂油，分装2个分液漏斗中，静置分层。取出上层4号溶剂油藻油相提萃。反复浸提，至藻泥变白无油为止。把4号溶剂油提萃液经旋转蒸发，获得粗藻油，粗藻油经脱胶除杂等过程后获得金黄色精藻油[12-14]。

1.4.7.3 连续发酵实验[12]

根据1.4.7.1节中筛选出突变株生长发育、苏丹黑B染色镜检、生物量、油脂产量、含油率和DHA产量等指标，选出3株进行3批次连续发酵实验研究，从中选出最佳藻突变株。

1.5 细胞生物量的测定

寇式隐甲藻的生物量以收集的藻体细胞干质量计。取一定体积藻液装入预先称质量的离心管中5000r/min离心20min，沉淀用蒸馏水清洗3次，置于干燥箱中，45℃条件下烘干，称质量(至恒质量)[15-16]。

1.6 活藻计数

对辐照后的藻液进行梯度稀释后涂平板，稀释倍数分别为：0、102、103、104、105、106、107。同样对原藻液进行梯度稀释后涂平板，稀释倍数分别为：105、106、107，每个稀释度涂3个平板，每个平板取0.2mL涂布。在26℃恒温培养箱中静置培养48～72h后，取出平板，选择平板上长有30～300个菌落的稀释度计算每毫升的藻落形成单位(CFU)[17-18]。原藻液CFU记为A0，3个不同剂量60Co-γ射线照射后的藻液CFU分别记为：A1、A2、A3。致死率按式(1)进行计算。

(1)

1.7 DHA含量及油脂组成成分及含量的分析[19-20]

1.7.1 脂肪酸甲酯化

取0.1g藻油于容量瓶中，加入2mL 0.5mol/L甲醇钠溶液和一定量的内标物十七烷酸(C17:0)，在50℃水浴中保留10min；再加入0.1mL醋酸和4mL水，充分振荡2min；加入一定量的正己烷作溶剂萃取3次；收集所有的正己烷溶剂，用氮气吹干，重新定容至1mL。样品即可进行气相色谱分析。

1.7.2 毛细管气相色谱法分析

色谱条件：检测器：氢火焰离子化检测器(FID)；色谱柱：DB-23(30m×0.32mm，0.25μm)；载气与流速：载气为氮气，流速为30.0mL/min；汽化室温度：250℃；检测器温度：280℃；程序升温：初温160℃(保留5min)，以3℃/min速率升到230℃，保留8min；进样量：1μL；进样方式：分流进样。

1.7.2.1 DHA含量计算

以十七烷酸为内标物进行DHA含量的计算。

(2)

式中：ADHA为脂肪酸组分的峰面积；AIS为内标物的峰面积；CFDHA为DHA和十七烷酸之间的相对校正因子，在实验所用的甲酯化方法和色谱条件下，该数值为3.8226；mIS为内标物质量/mg；mS为干藻粉质量/mg；f为二十二碳六烯酸甲酯转换为二十二碳六烯酸的系数，该数值为0.9590。

1.7.2.2 组分占总脂肪酸含量的计算

(3)

式中：Ax为不同脂肪酸组分的峰面积；At为样品中脂肪酸成分的色谱峰总面积；AIS为内标物的峰面积。

1.7.2.3 DHA产量

DHA产量/(g/L发酵液)=生物量/(g/L)×DHA含量/% (4)

2 结果与分析

2.1 60Co-γ射线辐照对寇氏隐甲藻ATCC 30772的致死效应

寇式隐甲藻ATCC 30772经60Co-γ射线剂量0.8、1.6、2.4kGy条件下分别辐照处理后，得出不同剂量60Co-γ射线辐照处理与藻细胞致死率与之间的关系见图1。可知，随辐照剂量的增大，寇式隐甲藻ATCC 30772的致死率增大。当辐照剂量为0.8kGy时，致死率为99.8277%，辐照剂量为2.4kGy时致死率达到99.9967%。

图 1 不同剂量60Co-γ射线辐照对寇式隐甲藻ATCC 30772的致死效应

Fig.1 Effect of 60Co γ-ray irradiation at different doses on the death rate of C.cohnii ATCC

2.2 60Co-γ射线辐照对寇式隐甲藻ATCC 30772藻落直径的影响

表 1 对照组与各诱变处理组各随机测量10个单藻落的直径

Table 1 Microscopic images of smears of control group and each treatment group after 2-day growth

mm

由表1可知，在培养条件、生长时间完全相同的情况下，3个辐照处理组平板内藻落密度均大于对照组，藻落直径明显大于对照组，说明辐照处理组藻细胞生长繁殖速度明显快于对照组、个体明显大于对照组。

2.3 寇式隐甲藻细胞的形态观察

将同时生长2d的寇氏隐甲藻ATCC 30772对照组及0.8、1.6、2.4kGy这3个辐照处理组于平板上划线分离，涂片观察，显微涂片照片分别见图2。

由图2可知，显微涂片观察发现，寇氏隐甲藻原藻ATCC 30772对照组(图2a)藻细胞大小孢囊混合，大孢囊极少。大孢囊呈球形或橄榄形，细胞较混浊，外围轮廓较模糊，颜色为淡绿色。3个辐照处理组(图2b、c、d)藻细胞虽也有大小孢囊混合，但不论是大孢囊的数量还是其在大小孢囊中所占比例均明显远大于对照组。大孢囊呈规则圆球状，细胞清澈，外围轮廓清晰，颜色较对照组深。并且通过观察对比可知，随着辐照剂量的增大，藻细胞分裂能力明显增强，大孢囊密度越来越大，大孢囊的数量及其在大小孢囊中所占比例越来越大，小孢囊越来越少。可能是因为高剂量辐照造成大孢囊生长繁殖能力超过小孢囊[21-22]。

2.4 初筛

2.4.1 挑选藻落

60株单株形态观察及涂片镜检，并与对照组藻落对比，筛选较好的藻落20个。其中包括0.8kGy处理组6个，1.6kGy处理组6个，2.4kGy处理组8个。

2.4.2 挑选突变株单株

将以上挑选出的20个藻落各取1环接入装有5mL液体培养基的试管中，每个接5管，共100个试管，置于摇床上，26℃、180r/min条件下振荡培养8d后，进行涂片及苏丹黑B染色镜检。根据有无污染、培养物大小、典型性状、生长积累量、培养液澄清度、显微镜涂片纯度等指标筛选出综合各指标较好的27株突变株，作为初筛藻株，准备复筛。其中包括0.8kGy处理组8株，1.6kGy处理组10株，2.4kGy处理组9株。

2.5 复筛

2.5.1 摇瓶培养

将初筛获得的27株突变株和出发菌株，经摇瓶发酵培养获得生物量、油脂产量、含油率和DHA含量的结果见表2。

表 2 寇氏隐甲藻ATCC 30772的27株突变株发酵培养结果

Table 2 Results of fermentation of 27 mutants of C.cohnii ATCC 30772

从表2的突变株中选出6株加上ATCC30772出发株，再进行一轮摇瓶培养，其结果如表3所示，经各项指标比较分析，最终选出实验号16的2.4k-8B1-4、实验号23的1.6k-5B1-3和实验号24的2.4k-2A2-5这3个突变株作下步研究和保藏的藻株。

表 3 第一轮复筛获得的6株突变株发酵培养结果

Table 3 Results of fermentation of the 6 mutants from primary screening

2.5.2 连续发酵实验

寇氏隐甲藻ATCC30772的3株突变株3批连续发酵培养后，生物量、油脂产量、含油率和DHA含量见表4。

表 4 寇氏隐甲藻ATCC 30772出发株及3株突变株连续发酵培养结果(n=3)

Table 4 Results obtained after the third batch of continuous fermentation for the 3 selected mutants and the original strain of C.cohnii ATCC 30772 (n=3)

通过从表4的记录综合比较分析，优良突变株依次为24号2.4k-2A2-5、23号1.6k-5B1-3和16号2.4k-8B1-4。3个突变株藻体生物量与出发株(对照株)基本相近，2.4k-2A2-5、1.6k-5B1-3、2.4k-8B1-4突变株的油脂产量比分别对照株增加51.66%、41.04%和37.31%；它们的含油率比对照株分别增加63.37%、46.84%和50.93%。突变株的油脂产量和含油量均比对照株有大的提高。2.4k-2A2-5突变株为适宜突变株。

2.5.3 藻油脂肪酸组成分析

将2.4k-2A2-5突变株发酵培养产生的藻油进行气相色谱分析，结果见图3，脂肪酸组成的分析结果见表5。

如图3和表5结果所示，藻油中含有棕榈油酸、油酸、α-亚麻酸、DHA等不饱和脂肪酸，不饱和脂肪酸总量达40.39%，其中DHA含量为39.931%。

图 3 藻油气相色谱图

Fig.3 Gas chromatogram of algal oil

表 5 藻油脂肪酸组成分析结果

Table 5 Analysis of fatty acid composition of algae oil

3 讨 论

3.1 寇式隐甲藻ATCC 30772在60Co-γ射线0.8、1.6、2.4kGy剂量条件下分别辐照处理后，致死率随辐照剂量增大而升高，致死率最高达到99.9967%，说明寇式隐甲藻ATCC 30772对2.4kGy以下低剂量的60Co-γ射线辐照敏感程度较高。60Co-γ射线辐照剂量为2.4kGy的诱变处理组寇氏隐甲藻的生物量较高，可能在2.4kGy以下剂量的60Co-γ射线辐照下，藻细胞内某些与生长有关的内源物质(如酶、生长刺激因子等)被60Co-γ射线激活，产生了刺激藻细胞生长的效应。

3.2 本实验在提取隐甲藻脂肪酸时采用了酶法破壁与有机溶剂萃取相结合的方法取得了较理想的结果，并且脂肪酸的提取和甲酯化是分步进行的，减少了提取过程中的有机溶剂对脂肪酸甲酯化时的影响，提高了酯化效果，更有利于色谱分析的准确性。

3.3 本研究设计了DHA高产藻株选育的育种思路及较定向的突变株筛选方法，减少了育种工作的盲目性，得到了性能稳定的高产突变株。如果能对60Co-γ射线辐照引起的刺激、诱变、损伤及修复机制进行深入研究，将可能使辐射育种效率进一步提高。

4 结 论

本实验在2.4kGy的辐照剂量下获得了高产DHA的寇氏隐甲藻ATCC 30772突变株2.4k-2A2-5，其平均DHA含量达到39.04%，比出发株提高了3.39%，另外，该突变株发酵浸提后的油脂产量和含油率均比出发株有了很大程度的提高，其油脂产量和含油率比出发株分别提高了51.66%和63.37%，即其DHA产量为7.14g/L发酵液，比出发株提高了近56.92%。因此，寇氏隐甲藻ATCC30772突变株2.4k-2A2-5是在本实验条件下获得的理想的正突变藻种。

利用该突变株发酵生产的产品具有质量可控，为安全的食品添加剂。该突变株的发酵产物可用于食品工业、婴幼儿食品和奶类制品、保健品及医药品。同时藻体可用于家禽、畜和水产饲料。另外还可以用于制备生物柴油[23]。发酵产物包括DHA、油脂和藻体都有重要的应用价值。因此，寇氏隐甲藻ATCC30772的突变株发酵生产DHA具有广阔的市场前景。

参考文献：

[1] 赵玉巧, 浦寅芳. 产DHA菌株的诱变育种[J]. 微生物学杂志, 2007, 12(6): 24-26.

[2] SWAAF M E, PRANK J T, SIJTSMA L. Fed-batch cultivation of the docosahexaenoic acid producing marine alga Crypthecodinium cohnii on ethanol flppl[J]. Microbiol Biotechnol, 2003a, 61: 40-43.

[3] 林本农, 刘飞鹏, 林赛芝. 真菌油脂菌种选育与发酵试验研究[J]. 福州大学学报: 自然科学版, 2002(增刊1): 22-23.

[4] 胡燕红, 姜绍通, 罗水忠. 米根霉产L-乳酸耐温菌株60Co-γ射线诱变选育[J]. 食品科学, 2008, 29(12): 22-23.

[5] 胡小文, 马帅, 付莉莉. 紫外诱变热带微藻选育高油脂藻株[J]. 热带农业科学, 2011, 3(7): 12-13.

[6] de SWAAF M E, PRONK J T, SIJTSMA L. Fed-batch cultivation of the docosahexaenoic acid producing marine alga Crypthecodinium cohnii on ethanol[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2003, 61: 40-43.

[7] 何东平, 陈涛. 微生物油脂学[M]. 北京: 化学工业出版社, 2006: 97-134.

[8] 张秋会, 马莺. 高产EPA和DHA藻株的筛选[J]. 西部粮油科技, 2003, 31(6): 47-49.

[9] 刘学铭, 梁世中. 微藻培养生产多不饱和脂肪酸研究进展[J]. 中国油脂, 1999, 22(3): 29-30.

[10] RATLEDGE C, ANDERSON A J, KANAGACHANDRAN K. Method of culturing of Crypthecodinium cohnii: GB Patent 103301[P]. 2003.

[11] KYLE D J, REEB S E, SICOTTE V J. Dinoflagellate biomass, methods for its production, and compositions containing the same. Martek Bioscience Corporation, US Patent 5711983[P]. 1998.

[12] YOKICHI T, HONDA D, HIGA T. Optimization of docosahexaenoic acid production by Schizochytrium limacinum SR21[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 1998, 49: 72-74.

[13] YAN X H, FUJITA Y. Induction and characterization of pigmentation mutants in Porphyra yezoensis(Bangiales Rhodophyta)[J]. Journal of Applied Phycology, 2000, 12: 69-81.

[14] 廖启斌, 李文权. 海洋微藻脂肪酸的气相色谱分析[J]. 海洋通报, 2000, 19(6): 66-71.

[15] 叶磊, 张惟广, 曹利群. 微生物发酵法生产DHA[J]. 江苏食品与发酵, 2008, 12(2): 31-32.

[16] BAJPAI P, BAJPAI P K, WARD O P. Production of docosahexaenoic acid by Thraustochytrium[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 1991, 35: 706-710.

[17] CHEN F, JOHNS M R. Effect of C/N ration and aeration on the fatty acid composition of heterotrophic Chlorella sorokinim 7a[J]. Appl Phycol, 1991, 3: 203-209.

[18] 田燕. 激光辐照微藻生物学效应及其诱变育种的研究[D]. 福州: 福建师范大学, 2008.

[19] METCALFE L D, SCHMITZ A A. The rapid preparation of fatty acid esters for gaschrmatographic analysis[J]. Anal Chem, 1961, 33(3): 363-364.

[20] WEETE J D, KIM H, GANDHI S R, et al. Lipids and ultrastructure of Thraustochytrium sp. ATCC 26185[J]. Lipids, 1997, 32: 839-845.

[21] 王立新. PEG诱导的雨生红球藻细胞融合与变异株的筛选[D]. 南京: 南京农业大学, 2011.

[22] BOURRE J M. Where to find ω-3 fatty acids and how feeding animals with diet enriched in ω-3 fatty acids to increase nutritional value of derived products for human: what is actually useful[J]. J Nutr Health Aging, 2005, 9: 232-242.

[23] 梁英, 陈书秀. 微藻育种的研究现状及前景[J]. 海洋通报, 2008, 15(3): 36-38.