花椒精灌胃剂量对去势大鼠肠道健康的影响

刘庆庆，任文瑾，吕 娇，刘 雄*

(西南大学食品科学学院，重庆 400715)

摘 要：目的：研究花椒精不同灌胃剂量对去势大鼠肠道健康的影响。方法：将40只SD雌性大鼠按体质量随机分为5组，每组各8只。对其中1组进行伪切除手术，其余4组进行双侧卵巢切除手术后随机分组，所有大鼠饲喂基础饲料，对卵巢切除组分别灌胃0、5、10、5mg/(kg•d)的花椒精。自由采食和饮水，4周后解剖，测定各组体质量、盲肠内容物质量、盲肠组织质量、盲肠内容物中微生物含量、盲肠内容物中短链脂肪酸以及盲肠内容物游离氨等指标。结果：灌胃花椒精后，大鼠的盲肠壁湿质量增加，盲肠内容物pH值下降，游离氨浓度下降，盲肠内容物中有害菌下降，中、高剂量组总短链脂肪酸(SCFAs)浓度增加。结论：灌胃花椒精能促进大鼠肠道的发酵作用，对肠道健康有益。

关键词：卵巢切除；花椒精；微生物；短链脂肪酸；游离氨

Effect of Intragastric Dose of Zanthoxylum Essential Oil on Intestinal Health in Ovarietomized Rats

LIU Qing-qing，REN Wen-jin，LÜ Jiao，LIU Xiong*

(College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

Abstract：Objective: To explore the effect of different intragastric doses of Zanthoxylum essential oil on intestinal health in ovariectomized rats. Methods: Totally 40 female SD rats were randomly divided into five groups, including a group of rats with pseudo-resection of ovarian, and the rest 4 groups of rats subjected to ovariectomy. After a week of wound healing from surgery, both of the pseudo ovarian resection group and ovariectomy group were fed on basic feed, and three ovariectomy groups were orally administered with the essential oil at doses of 5, 10 mg/(kg•d) and 15 mg/(kg•d) body weight per day for four consecutive weeks. All rats were sacrificed after feeding for 28 days to analyze the gain of body weight and cecal tissue weight, the amount of free ammonia, short-chain fatty acids (SCFAs) and microbes in the cecum. Results: After intragastric administration of Zanthoxylum essential oil, the wet weight of cecal wall of these rats was increased, pH was decreased, harmful bacteria and free ammonia were reduced, and total SCFAs in medium-dose and high-dose groups were increased. Conclusion: Intragastric administration of Zanthoxylum essential oil can promote rat intestinal fermentation, and thus improve the intestinal health.

Key words：zanthoxylum essential oil；ovarietomy；microbe；short-chain fatty acids；free ammonia

中图分类号：TS201.4 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)17-0241-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201317051

花椒是芸香科(Rutaceae)花椒属(Zanthoxylum L.)中具有芳香气味的药用植物，分布于韩国、中国、日本等国家[1-2]。花椒精是采用科学的物理方法从花椒中提取、精制而成的厚重麻味的天然调味料，主要由花椒非挥发性精油和挥发性精油混合而成。其生产工艺是将新鲜成熟花椒烘干、筛分后取花椒果壳制成花椒粉，花椒粉在多功能提取罐中用浸提剂进行回流浸提，将提取的浸提液浓缩、纯化、净化后得到花椒非挥发性精油，将其与烘干、纯化过程中得到的花椒挥发性精油混合即可。

由于花椒精具有花椒特有的麻香味，且可以通过控制花椒精的用量来调节食用油的麻度，因此其是一种高档的调味品和香料。花椒精不仅是一种高效的食品添加剂，其还具有多种生理功能。花椒挥发油具有麻醉作用，具有较好的抗炎和镇痛作用[3-4]。有研究表明，花椒精对心血管系统、消化系统、免疫机能、凝血功能等均具有较强的药理学活性[5]。另外，干信等[6]研究发现，花椒挥发油对实验用的酵母菌、霉菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有明显的抑制作用。韦敏等[7]研究发现，花椒挥发油对过敏性刺激诱发的哮喘有较好的抑制作用。花椒挥发油还具有较强的抗氧化活性，其抗脂质过氧化活性和清除自由基的能力比VC和VE都强[8]。近年来的研究发现，花椒挥发油还具有抗肿瘤[9]和减少动脉粥样硬化发病率的作用[10]。

更年期妇女卵巢功能衰退，雌激素分泌逐渐减少，促性腺激素水平升高，易出现植物神经功能紊乱而引起的系列症候群，其中以血脂和胆固醇升高导致的心血管症状为主要临床表现。虽然用雌激素替代治疗可以明显降低冠心病的发病率和死亡率，但是长期服用雌激素会产生较大的副作用。因此通过膳食来调节和预防更年期妇女的血脂和胆固醇的升高，是一种理想的途径。花椒精富含抗氧化活性成分，能防止正常低密度脂蛋白(LDL)氧化，预防动脉粥样性疾病的发生，但尚未见有关花椒精对肠道健康作用的报道。本实验室前期研究也发现花椒精能有效降低卵巢切除大鼠血脂，本实验通过选取同种基础饲料饲喂卵巢伪切除组和卵巢切除组大鼠，随机选择3组卵巢切除组灌胃不同灌胃剂量的花椒精，研究花椒精灌胃剂量对卵巢切除手术后大鼠肠道健康的影响。

1 材料与方法

1.1 动物与材料

雌性SD大鼠，清洁级，4周龄，体质量(100±10)g，购自重庆滕鑫比尔实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK(渝)20070008。

表 1 花椒精中花椒挥发油的成分及含量

Table 1 Composition of the basic diet

花椒精，主要成分为花椒麻素(32.18%)和花椒挥发油(54.64%)，花椒挥发油的成分及含量见表1，购于重庆娇王花椒股份有限公司；基础饲料，购于重庆滕鑫比尔实验动物有限公司；金龙鱼大豆油(食用级) 市售。

1.2 试剂

乙醇、氢氧化钠、氯化钠、柠檬酸、钨酸钠、硫酸、苯酚、硝普钠、次氯酸钠(分析纯) 成都市科龙化工试剂厂；乙酸、巴豆酸(标准品，纯度＞99.7%) 英国Johnson Matthey公司；丙酸、丁酸、异丁酸(标准品，纯度＞99%) 梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；TPY琼脂培养基、肠球菌琼脂(胆汁七叶叠氮钠琼脂)、乳酸杆菌选择性琼脂、伊红美蓝琼脂、厌氧菌琼脂 青岛高科园海博生物技术有限公司。

1.3 仪器与设备

PHS-3C精密pH计 上海大普仪器有限公司；JA2003A电子天平 上海精天电子仪器有限司; DHG-9070电热恒温鼓风干燥箱 上海齐欣科学有限公司；1-15PK冷冻离心机 美国Sigma公司；WH-1微型漩涡混合器 上海沪西分析仪器厂有限公司；722-P可见分光光度计 上海现科仪器有限公司；GC-2010高效气相色谱仪 日本岛津公司；Stabilwax-DA色谱柱 美国Restek公司；SW-CJ-1FD 洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；HH-B11电热恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂；ES-315高压蒸汽灭菌锅 日本Seisakusyo公司。

1.4 方法

1.4.1 实验设计

40只雌性SD大鼠，室温保持(25±1)℃，12h明暗轮换(19：00～21：00)，喂食基础饲料1周，适应喂养环境后，按大鼠体质量随机分为5组，腹部注射戊巴比妥钠(无菌生理盐水配制0.3%溶液，注射量1mL/100g，以体质量计)使其麻醉，对其中1组进行伪切除手术，其余4组进行双侧卵巢切除手术后随机分组，手术后进行为期1周的恢复后，每天对伪切除组和双侧卵巢切除(OVX)花椒精剂量空白组灌胃大豆油做空白组，对花椒精剂量组分别灌胃含5、10、15mg/mL花椒精的大豆油溶液，灌胃剂量均为0.1mL/100g。所有大鼠均喂食基础饲料(基础饲料配方见表2)，自由摄食和饮水，每天称量大鼠体质量并记录大鼠采食量。

表 2 基础饲料配方

Table 2 Chemical composition and content of zanthocylum essential oil

注：按表中配好50kg基础饲料后，再加入30g中华多维复合维生素预混料。

实验周期为4周，实验期最后1d断粮12h，19：00～ 21：00乙醚麻醉后断头处死大鼠，取出盲肠组织，称质量。将盲肠组织纵向剪开，称取0.2g左右盲肠内容物，加入10倍去离子水，用旋涡混合仪混匀，电子pH计测其pH值；称取0.5g左右盲肠内容物放入超纯水处理过的10mL离心管中，立即加入2mL含有5mmol/L巴豆酸的10mmol/L氢氧化钠溶液，充分混匀后冷藏用于短链脂肪酸检测。称取0.3g左右盲肠内容物放入预先恒定质量的铝盒中，105℃条件下恒定质量测定其水分含量。称取0.3g左右盲肠内容物，加入10倍(V/m)无氨水，－20℃冷冻待测游离氨。剩余盲肠内容物收集于10mL离心管中，－80℃冷冻保存，用于测定盲肠内容物中微生物含量。

1.4.2 饲料效率的测定[11]

实验前测定每只大鼠的体质量，实验期间每天记录采食量，实验结束时测定每只大鼠体质量。计算出4周的实验期内大鼠体质量增加量和总的饲料采食量。

(1)

1.4.3 盲肠内容物质量的测定

盲肠内容物质量/g=盲肠总质量/g－盲肠壁质量/g (2)

1.4.4 盲肠内容物含水率测定

称取一定质量的新鲜盲肠内容物，放入预恒质量铝盒中，105℃质量恒定，测其含水量。

(3)

式中：m1为盲肠内容物湿质量/g；m2为盲肠内容物干质量/g。

1.4.5 盲肠内容物pH值测定

称取一定质量的新鲜盲肠内容物于10mL去离子水预处理离心管中，加入10倍(V/m)去离子水，旋涡混合仪上混匀后静置，测上清液pH值。

1.4.6 盲肠内容物游离氨测定

无氨水制备：在1000mL蒸馏水中加入0.10mL硫酸(ρ=1.84g/mL)，并在全玻璃蒸馏器中重蒸馏，弃去前50mL蒸出液，然后将蒸出液收集在带有玻璃塞的玻璃瓶中。

将预处理的盲肠内容物样品4000r/min条件下离心5min，吸取上清液1mL，依次加入1mL含有0.001mol/L亚硝基铁氰化钠的0.5mol/L苯酚溶液和1mL含有0.03mol/L次氯酸钠的0.625mol/L氢氧化钠溶液，60℃保温7min，于625nm波长处测吸光度[12]。

1.4.7 盲肠壁表面积测定[13]

用冰冷生理盐水洗净盲肠，充分展开后固定在A4纸上，勾出其轮廓，待纸干燥后将盲肠壁轮廓复写在厚的打印纸上，然后将纸上的盲肠轮廓图剪下。用精密度为0.0001g的电子秤准确称量轮廓图纸质量(m2)和1cm2的打印纸质量(m1)，然后按式(4)计算盲肠表面积。

(4)

1.4.8 盲肠内容物中SCFA测定

将预处理的盲肠内容物样品在4℃、4000r/min离心15min，吸取上清液转移至预先用纯水处理过的10mL离心管中，10000r/min转速下继续离心15min，1mL一次性注射器吸取上清液1mL，0.25μm滤膜过滤至2mL进样小瓶中待测。

气相色谱条件：进样量1μL；进样口温度220℃；柱流量0.95mL/min，柱温90℃，平衡时间0.5min，5℃/min升温至150℃，保留时间7min；检测器温度230℃；氢气流量40mL/min，空气流量400mL/min，尾吹流量40mL/min[14]。

1.4.9 盲肠内容物微生物测定

取－80℃冷冻盲肠内容物0.2g左右，加入9倍(V/m)无菌生理盐水，旋涡混合仪振荡混匀，制得10-1稀释度盲肠内容物。依次10倍稀释至10-12稀释度，选择10-1、10-2、10-3 3个稀释度，用于大肠杆菌和肠球菌的培养计数；选择10-4、10-5、10-6 3个稀释度，用于双歧杆菌和乳酸杆菌的培养计数，选择10-2、10-3、10-4 3个稀释度，用于厌氧菌的培养计数，接种量为200μL。大肠杆菌培养选用EMB培养基，37℃条件恒温培养箱中培养36～48h计数。双歧杆菌、乳酸杆菌和厌氧菌分别选用TPY琼脂、乳酸杆菌选择性琼脂和厌氧菌琼脂培养基，37℃条件下二氧化碳细胞培养箱中厌氧培养48～72h计数。结果以lg(CFU/g)表示。

1.5 统计分析

采用SPSS Statistics(版本17.0)软件对结果进行统计分析，实验数据以

±s表示；各组结果采用Duncan’s显著性差异测验进行单向方差分析，显著水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 花椒精灌胃剂量对去势大鼠体质量增加量、饲料采食量和饲料效率的影响

表 3 花椒精灌胃剂量对去势大鼠体质量增加量、饲料采食量和饲料

效率的影响(

x

±s，n=8)

Table 3 Effect of Zanthoxylum essential oil dose on body weight gain, total feed intake and feed efficiency of ovariectomized rats

(

x

±s，n=8)

注：*.伪切除组与空白组相比，存在显著性差异(P＜0.05)。下同。

由表3可知，空白组与伪切除组相比，卵巢切除使得大鼠的体质量增加量、采食量及饲料效率均显著增加(P＜0.05)。在卵巢切除组中，灌胃不同剂量花椒精的大鼠体质量增加量、采食量和饲料效率与空白组之间差异不显著。

2.2 花椒精灌胃剂量对大鼠盲肠总质量、盲肠壁湿质量、表面积以及盲肠内容物湿质量的影响

表 4 花椒精灌胃剂量对去势大鼠盲肠总质量、盲肠壁质量和表面积以及盲肠内容物湿质量的影响(

x

±s，n=8)

Table 4 Effect of Zanthoxylum essential oil dose on caecal weight, wet weight and area of the ceacal wall, and wet weight of the caecal contents in ovariectomized rats (

x

±s，n=8)

注：上标字母不同表示灌胃组间存在显著性差异(P＜0.05)。下同。

由表4可知，空白组与伪切除组相比，盲肠表面积显著增大(P＜0.05)，盲肠总质量、内容物湿质量和盲肠壁湿质量均呈上升趋势；各剂量组与空白组相比，壁湿质量/体质量百分比、盲肠总质量及盲肠壁湿质量都呈现上升趋势。

2.3 花椒精灌胃剂量对大鼠盲肠内容物水分含量、pH值和游离氨含量的影响

表 5 花椒精灌胃剂量对去势大鼠盲肠内容物水分含量、pH值和游离氨含量的影响(

x

±s，n=8)

Table 5 Effect of Zanthoxylum essential oil dose on pH, water content and ammonia level of the caecal contents in ovariectomized rats rats

(

x

±s，n=8)

由表5可知，空白组与伪切除组相比，盲肠内容物中游离氨含量显著升高(P＜0.05)，盲肠内容物含水率及内容物pH值均呈下降趋势，未达到显著水平；各剂量组与空白组相比，盲肠内容物含水率及pH值均无显著差异，游离氨浓度的变化趋势与灌胃剂量呈负相关。

2.4 花椒精灌胃剂量对去势大鼠盲肠内容物中短链脂肪酸含量的影响

由表6可知，空白组与伪切除组相比，卵巢切除使乙酸、丙酸、丁酸和SCFAs增加，均无显著性影响(P＞0.05)，但能显著增加异丁酸含量(P＜0.05)；剂量组中，随着灌胃剂量的增加卵巢切除大鼠盲肠内容物中的乙酸和丙酸含量逐渐增加，花椒精灌胃剂量为15mg/(kg•d)组与5mg/(kg•d)组相比大鼠盲肠内容物中乙酸、丙酸和SCFAs的含量显著增加，灌胃剂量为10mg/(kg•d)组和15mg/(kg•d)组与空白组相比SCFAs含量增加，且变化趋势与灌胃剂量呈正相关。

表 6 花椒精灌胃剂量对去势大鼠盲肠内容物中短链脂肪酸含量的影响 (

x

±s，n=8)

Table 6 Effect of Zanthoxylum essential oil dose on SCFA in the caecal contents of ovariectomized rats (

x

±s，n=8)

μmol/g

2.5 花椒精灌胃剂量对去势大鼠盲肠内容物中微生物的影响

表 7 花椒精灌胃剂量对去势大鼠盲肠内容物中微生物的影响

(

x

±s，n=8)

Table 7 Effect of Zanthoxylum essential oil dose on caecal microflora in ovariectomized rats (

x

±s，n=8)

lg(CFU/g)

由表7可知，与伪切除组组相比，空白组大鼠盲肠内容物中的双歧杆菌、乳酸菌、大肠杆菌、肠球菌和厌氧菌菌落数量均显著增加(P＜0.05)。在卵巢切除各组中，乳酸菌菌落数量呈上升趋势，灌胃剂量为15mg/(kg•d)组较空白组显著增加；空白组双歧杆菌菌落数量高于其他剂量组，且均未达到显著水平；灌胃剂量为10mg/(kg•d)和15mg/(kg•d)组厌氧菌菌落数量均显著低于空白组(P＜0.05)，但灌胃剂量为5mg/(kg•d)组厌氧菌菌落数量显著增加(P＜0.05)；与空白组相比，卵巢切除其他各组大肠杆菌和肠球菌菌落数量显著下降(P＜0.05)。

3 结论与讨论

本研究的主要目的是探讨花椒精对去势大鼠肠道健康的影响。从本研究结果看，花椒精能抑制肠道中大肠杆菌及肠球菌等有害菌的生长，减少了游离氨的生成，使肠道pH值下降；花椒精促进了肠道中乳酸菌的生长，双歧杆菌数量下降但总体达到了相对稳定的水平，10mg/(kg•d)组和15mg/(kg•d)组SCFAs呈上升趋势，但与花椒精灌胃剂量无关。肠道健康的改善与增加短链脂肪酸SCFAs产量、降低肠道pH值、降低肠道中氨和苯酚浓度、降低肠道中次级胆汁酸分泌、减少排空时间和改善细菌活性等方面相关[15]。肠道微生物对维持肠道正常的生理功能具有重要作用，在机体中未消化的多糖、低聚糖、蛋白质、肽和糖蛋白等食物残渣进入大肠，被肠道微生物进一步分解发酵，糖类发酵产生乙酸、丙酸、丁酸等短链脂肪酸和CO2、CH4、H2等气体，含氮化合物被微生物发酵产生游离氨、苯酚等产物，因此进入大肠的食物残渣成分直接影响肠道发酵产物和肠道菌群的分布，如膳食纤维多为益生因子，有利于肠道中乳酸菌及双歧杆菌的生长，产生丰富的SCFAs改善肠道pH值，促进肠细胞生长，抑制结肠癌等。氨是不消化蛋白质在结肠内腐败的主要产物，它能改变结肠表皮细胞的形态和代谢，被认为是结肠内潜在的肿瘤促进因子，游离氨主要是由小肠中谷氨酰胺代谢产生[16]，大肠微生物代谢也可以产生[17-19]。另外，一部分游离氨在大肠中可被用于细菌蛋白质的合成[20]。综合有害菌数量、游离氨、pH值及SCFAs含量的变化可以看出，花椒精能促进大鼠肠道的发酵作用，对去势大鼠肠道健康有益。本研究对于开发花椒精功能性食品具有一定的参考价值，对于花椒精促进肠道健康的机理的研究有更为深远的意义，还有待进一步研究。

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