DHA提高大鼠学习记忆的分子机制研究

马 琳，王丽梅，樊永波，吴 晨，陶兴无，刘志国，刘烈炬*

(武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北 武汉 430023)

摘 要：目的：研究二十二碳六烯酸(DHA)对大鼠学习记忆的影响并探讨其作用的分子机制。方法：将32只初断乳SD雄性大鼠，按随机数字表法分成4组：阴性对照组、阳性对照组、DHA低剂量组(370mg/(kg•d))和DHA高剂量组(740mg/(kg•d))。连续饲养8周，测定大鼠脑组织中乙酰胆碱酯酶(AChE)、一氧化氮合酶(NOS)的活性，其次，采用RT-PCR方法测定大鼠脑部海马组织中N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体亚基(NR1)、cAMP反应元件结合蛋白(CERB)、即刻早期基因(c-fos)mRNA的表达水平。结果：与阴性对照组相比，DHA高、低剂量均能提高大鼠脑组织AChE和NOS的活性，并且能够显著上调海马组织内NR1、CREB、c-fos基因mRNA的表达(P＜0.01)，但以低剂量为佳。结论：DHA能够提高大鼠学习记忆能力并且存在一定的量效关系，其机制与上调海马组织内NR1、CREB、c-fos基因 mRNA的表达水平有关。

关键词：DHA；学习记忆；N-甲基-D-天冬氨酸受体亚基；cAMP反应元件结合蛋白；即刻早期基因

Molecular Mechanism of DHA for Improving Learning and Memory in Rats

MA Lin，WANG Li-mei，FAN Yong-bo，WU Chen，TAO Xing-wu，LIU Zhi-guo，LIU Lie-ju*

(School of Biology and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China)

Abstract：This study was aimed to investigate the effect of docosahexaenoic acid on learning and memory abilities in rats and to explore the relevant molecular mechanism. A total of 32 neonatal male SD rats were randomly divided into 4 groups: negative control group, positive control group, low (370 mg/(kg•d)) and high dose DHA group (740 mg/(kg•d)). After 8 weeks of feeding, the enzyme activities of acetylcholinesterase (AChE) and nitric oxide synthase (NOS) in brain tissue of rats were analyzed. The mRNA expressions of N-methyl-D-aspartate receptor subunit (NR1), cAMP responsive element binding protein (CERB), immediate early gene (c-fos) in the hippocampus of rats were determined by RT-PCR. Results showed that compared to the negative control group, DHA at both doses was able to significantly increase AChE and NOS activities in brain tissue as well as the mRNA expression levels of NR1, CREB and c-fos while the low dose presented higher effect. In summary, DHA could remarkably improve learning and memory abilities in rats in a dose-dependent manner. The mechanism might be involved with the upregulation of NR1, CREB and c-fos mRNA expression by DHA in the hippocampus of rats.

Key words：DHA；learning and memory；N-methyl-D-aspartate receptor；cAMP responsive element binding protein；c-fos

中图分类号：Q591.5；TS221 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)17-0246-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201317052

二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)是ω-3系列一种长链多不饱和脂肪酸，俗称“脑黄金”。目前，国内外对于DHA的应用较为广泛，主要应用于保健食品中，如婴幼儿配方粉、食用植物油脂、添加DHA的功能性饮品、DHA鸡蛋等。DHA以磷脂形式广泛地存在于脑细胞和视网膜中，对中枢神经系统和视网膜的结构及功能的正常发挥起着重要的作用[1-2]。它在人体内含量较少，主要从食物中直接摄取或从前体脂肪酸转变而来。近些年来研究[3-4]表明，补充一定量的DHA可以益智健脑，它在大脑神经发育和学习记忆行为方面有着重要的作用。前期实验[5]已证明DHA的作用具有量效与时效关系，但关于其增加学习记忆的分子机制尚不清楚。本实验采用不同剂量DHA灌胃初断乳大鼠，研究其对学习记忆的作用，并通过RT-PCR检测海马组织中N-甲基-D-天冬氨酸受体亚基1(N-methyl-D-aspartate receptor 1，NR1)、cAMP反应元件结合蛋白(cAMP responsive element binding protein，CREB)、即刻早期基因(c-fos)mRNA的表达情况，从分子水平上探究DHA对学习记忆机制的作用，旨在为其合理开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、动物与试剂

DHA油脂(DHA含量35%) 湖北福星生物科技有限公司；食用精炼24°棕榈油 上海嘉里粮油工业有限公司；普通饲料 华中科技大学同济医学院实验动物部。

清洁级初断乳SD雄性大鼠，体质量(80±10)g，由华中科技大学同济医学院实验动物部门提供。

乙酰胆碱酯酶(AChE)、一氧化氮合酶(NOS)、BCA法测定超微量蛋白含量试剂盒 南京建成生物工程研究所；总RNA提取试剂盒(TRIpure Reagent)、一步法反转录PCR试剂盒(TUREscriprt 1st Strand cDNA Synthesis Kit)、2×Sybr Green qPCR Mix 北京艾德莱生物科技有限公司；NR1、CREB、c-fos和GAPDH引物合成 北京鼎国生物技术有限公司；氯化钠、三氯甲烷、异丙醇等试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

3K15高速冷冻离心机 德国Sigma公司；DY89-I型电动玻璃匀浆机 宁波新芝科器研究所；752型紫外-可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；ABI7500 PCR仪 美国ABI公司；HH-6数显恒温水浴锅 国华电器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 动物分组与喂养

初断乳SD雄性大鼠，适应性喂养1周后，按随机数字法分成4组，每组8只：阴性对照组(普通饲料)、阳性对照组(棕榈油2.2g/(kg•d))、DHA低、高剂量组(纯DHA量则分别为370、740mg/(kg•d))。此食用油剂量是根据中国营养协会推荐的25g/d食用油正常食用量，换算成大鼠的等效剂量2.2g/(kg•d)。每日上午经口灌胃给药，阴性组给予同等体积的5%羧甲基纤维素钠(CMC)溶液，DHA低、高剂量组通过换算将DHA油脂溶于CMC溶液中，使灌胃体积量与阳性组保持一致，持续给药8周，定量进食，自由饮水，每3d称量大鼠体质量，以变换给药量。

1.3.2 脑组织AChE﹑NOS酶活性的测定

用乌拉坦麻醉处死大鼠，立即在冰盘上分别分离得到大脑和海马组织，用预冷生理盐水清洗后，将大脑置于玻璃匀浆器中，按质量比1:9加入生理盐水，使用电动玻璃匀浆器在冰浴中制备匀浆，匀浆液在4℃、3500r/min离心10min，取上清，按试剂盒方法进行操作，测定脑组织AChE﹑NOS活性，并同时测定脑组织蛋白含量。在海马组织中加入0.2mL TRIpure Reagent后，置于－80℃冰箱内保存备用。

1.3.3 实时荧光定量检测海马NR1、CREB、c-fos mRNA的表达

按TRIpure抽提试剂盒说明书提取大鼠海马RNA。按照第一链反转录试剂盒方法进行逆转录合成cDNA。最后按SybrGreen荧光染料法试剂盒进行定量PCR，采用三步法RT-PCR检测目的基因的表达量，基因引物设计见表1。PCR扩增条件：95℃预变性3min；95℃变性15s，59℃退火35s，72℃延伸35s，此处收集荧光，循环40次；最后72℃再延伸10min。

表 1 基因引物序列，退火温度和产物长度

Table 1 Gene-specific primers, annealing temperature and predicted size of PCR products

1.4 统计学分析

实验结果用

x

±s来表示，采用SPSS11.0软件进行单因素方差分析，以P＜0.05为具有统计学意义上的差异。

2 结果与分析

2.1 DHA对大鼠脑组织AChE﹑NOS活性的影响

表 2 DHA对大鼠脑组织AChE﹑NOS活性的影响(

x

±s，n =8)

Table 2 Effect of DHA on AChE and NOS activities in rat brain

(

x

±s，n =8)

注：*.与阴性对照组比较，有显著性差异(P＜0.05)；**.与阴性对照组比较，有极显著性差异(P＜0.01)；#.与阳性对照组比较，有显著性差异(P＜0.05)；##.与阳性对照组比较，有极显著性差异(P＜0.01)。下同。

如表2所示，与阴性对照组比较，DHA低剂量﹑DHA高剂量组脑组织中AChE﹑NOS酶活力均极显著性增加(P＜0.01)。其中阳性对照组与阴性对照组AChE﹑NOS两者含量相当，而DHA高剂量组比低剂量组AChE﹑NOS酶活力均略高，但无统计学意义。说明DHA能明显提高大鼠脑组织中乙酰胆碱酯酶与一氧化氮合酶的活力，暗示它可能与学习记忆有关。

2.2 DHA对大鼠海马组织NR1、CREB、c-fos mRNA表达量的影响

图 1 DHA对大鼠海马NR1(A)、CREB(B)、c-fos (C) mRNA表达的影响

(

x

±s，n =8)

Fig.1 Effect of DHA on gene expression of NR1, CREB and c-fos in rat hippocampus (

x

±s，n =8)

由图1可知，与阳性对照组相比，阴性对照组中的CREB、NR1 mRNA表达量明显升高，c-fos mRNA表达量降低。与阴性对照组相比，DHA低剂量组处理后，CREB、c-fos和NR1 mRNA的表达量均极显著升高(P＜0.01)，分别上调了283.7%﹑490.7%﹑293.3%，而DHA高剂量组处理后，三者表达量也极显著升高(P＜0.01)，分别上调了39.02%﹑73.3%﹑39.1%。说明DHA能显著性提高大鼠海马组织CREB、c-fos和NR1 mRNA的表达量。与DHA低剂量组相比，DHA高剂量组处理后CREB、c-fos、NR1 mRNA三者表达量均显著降低(P＜0.01)，提示3个基因的表达量与DHA的剂量并不是呈正相关的。

3 讨 论

人的大脑在化学组成上的特点是脂质含量高，在脑灰质中脂类占总干质量的32%，在白质中占56%。DHA主要存在于大脑灰质部分，是人脑神经细胞膜中主要的脂质成分，在人的大脑皮层中含量高达20%。它参与脑细胞的形成和发育，对神经细胞轴突的延伸和新突起的形成有重要作用，维持神经细胞的正常生理活动，参与大脑思维和记忆形成过程[6]。前期行为学实验[5]已证明，在发育期补充一定剂量的DHA能够增强大鼠空间学习记忆能力。乙酰胆碱是中枢神经系统内高级神经功能活动的一类重要的神经递质，参与学习记忆等生理活动[7]。AChE作为乙酰胆碱的重要水解酶，其活性的改变可间接反映胆碱能神经元活性的变化[8]。AChE生化指标测定结果表明，DHA能增强大鼠脑组织中胆碱能系统的活性，加强胆碱在脑中的代谢水平。一氧化氮(NO)是参与长时程增强效应(long-term potentiation，LTP)重要信号因子，而NOS是其合成内源性一氧化氮唯一的酶，因此NOS在学习记忆过程中有重要的地位[9]。马厚勋等[10]研究表明，大鼠组织NOS、NO含量与衰老之间存在一定相关的关系。陈智松等[11]研究也表明，随着年龄增长，小鼠纹状体神经元平均密度呈线性显著下降，神经元体积萎缩，NOS活性降低。本实验NOS生化指标结果表明，DHA能显著性提高大鼠脑组织中NOS的含量，脑内NO合成增加，加强其在中枢神经系统中介导神经元对兴奋性氨基酸的反应，提高学习记忆。

LTP一直被认为是中枢神经系统突触可塑性的生物学基础，是学习记忆重要的神经机制之一，它的形成和维持两个阶段需要N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体的参与[12]。海马是大脑内侧颞叶系统中与学习记忆最密切相关的结构，在学习记忆的获得与巩固方面起着重要的作用。NMDA受体NR1亚基是组成有功能的该受体通道的必需成分，它的表达量代表NMDA受体总量，因此NR1亚基与学习记忆关系紧密。NR1亚基在大脑中分布广泛，其表达贯穿于脑的整个发育阶段，并随内、外环境影响呈动态变化。Shimizu等[13]通过基因敲除技术发现，NR1亚基的缺失可导致小鼠空间学习记忆障碍，它在将短时记忆转变为长时记忆的过程中有重要作用。本实验结果表明，DHA能够极显著提高大鼠脑部海马组织中NR1亚基的表达(P＜0.01)，NMDA受体数量增加，促进神经元树突、轴突结构的发育及突触的可塑性。

在神经系统中，转录因子CREB调节着细胞内多种信号通路，其下游效应包括影响神经元的存活与生长、突触的可塑性和长期记忆的形成[14]。CREB第133位丝氨酸(Ser133)被磷酸化后，变成有活性的状态，可与cAMP蛋白结合，作为第二信使调控靶基因的转录。大量实验证实，CREB活性降低可抑制LTP的形成，其数量的增加与活性的增强可促进LTP的形成[15]。本实验结果显示，DHA高、低剂量组大鼠脑部海马组织CREB mRNA表达量显著增加(P＜0.01)，CREB磷酸化水平提高，促进了靶基因的转录。

即刻早期基因是一类原癌基因，包括c-fos、c-jun、c-myc、c-myb和egr家族，其中c-fos基因与学习记忆的关系研究最为深入[16]。c-fos、c-jun基因在被第2信使激活后，迅速翻译出的表达产物Fos和Jun蛋白在细胞核内形成异源二聚体复合物，与靶基因上激活蛋白-1位点相结合影响其转录[17]。Tischmeyer等[18]对大鼠进行“Y型迷宫”训练后，大鼠海马内c-fos mRNA表达短暂升高，提示诱导海马c-fos基因的表达是形成长期记忆的必要条件。本实验结果表明，DHA能够显著提高大鼠脑部海马组织中c-fos亚基的表达(P＜0.01)，c-fos作为第3信使来调节核内其他靶基因的表达，从而调整神经元对外界刺激的长时程应答。

实验结果显示，DHA低剂量组对NR1、CREB、c-fos mRNA的表达量显著高于高剂量组，这与预期的基因表达量随着DHA剂量增加而增加的结果不相一致。但需要注意的是，DHA是高度不饱和脂肪酸，大量食用易受体内自由基攻击而引发过氧化链式反应，即脂质过氧化，其不饱和程度越高，脂质过氧化作用越强，对细胞膜结构和功能损伤越大，引发蛋白质交联，破化酶活性，损伤细胞核，参与许多慢性病的病理过程，反而对人体产生毒副作用[19-20]。这与郭艳芬等[5]研究结果相一致，即补充DHA中剂量对大鼠空间学习记忆最有益处，显示DHA对大鼠学习记忆的作用具有“钟型”量效曲线，大量DHA并不能增加其效果。

综上所述，补充DHA能够提高大鼠学习记忆能力，途径之一是通过增强大鼠大脑内与学习记忆相关系统酶的活力，同时上调海马组织内参与LTP过程中相关基因的表达来实现的。而且DHA作用存在着量效关系，适量食用对维持与促进大脑机能正常发挥是有益的，过量食用并不能进一步提高其健脑效果。DHA对人的一生中各个阶段的显著功效及需求程度是不同的，它能促进视力、智力的发育，维持大脑的机能，预防心血管疾病以及老年痴呆。DHA提高学习记忆的最佳剂量有待进一步研究，如添加梯度剂量DHA来培养海马神经细胞来确定。

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