海蜇糖蛋白及其糖肽的体外免疫活性

任国艳，刘志龙，郭金英，樊金玲，梁旺春，邵 征，康怀彬

(河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471003)

摘 要：研究海蜇糖蛋白及其糖肽体外免疫活性。通过小鼠脾淋巴细胞增殖和转化实验，比较海蜇糖蛋白及其糖肽在不同培养时间、不同质量浓度条件下对小鼠体外免疫的影响。结果显示：不同培养时间、不同质量浓度的海蜇糖蛋白及糖肽均能不同程度地提高小鼠脾淋巴细胞的增殖和转化能力，且表现出一定剂量关系。糖肽Ⅰ组在提高小鼠脾淋巴细胞的增殖和转化能力方面显著优于其他几个组分，当糖肽Ⅰ组质量浓度为50µg/mL，培养60h对脾淋巴细胞的增殖和转化作用最强。

关键词：海蜇；糖蛋白；糖肽；体外免疫

Effects of Glycoprotein and Glycopeptides from Jellyfish on Immune Function of Mice in vitro

REN Guo-yan，LIU Zhi-long，GUO Jin-ying，FAN Jin-ling，LIANG Wang-chun，SHAO Zheng，KANG Huai-bin

(College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China)

Abstract：The immunoregulatory activity of glycoprotein and glycopeptides from jellyfish was explored through cell proliferation and cell transformation of mouse spleen lymphocytes and comparatively evaluated under various cultivation times and concentrations. Jellyfish glycoprotein and glycopeptides revealed significant increase in the proliferation and transformation of spleen lymphocytes in a dose-dependent manner. The results demonstrated that glycopeptides had better immunoregulatory activity in vitro when spleen lymphocytes were cultivated for 60 hours and the concentration of glycopeptides was 50 µg/mL.

Key words：jellyfish；glycoprotein；glycopeptides；immunomodulation in vitro

中图分类号：TS201.4 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)17-0250-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201317053

近年来许多研究表明，从生物体中分离出的多种天然生物活性成分具有增强机体免疫力的作用。糖蛋白及糖肽作为广泛存在于生物体内的天然活性物质，除有细胞间识别调控作用外，还具有抗肿瘤、提高免疫力等多种生物活性[1-3] 。海蜇作为传统的医食同源型水母，其活性物质如海蜇毒素、胶原蛋白、多肽、糖胺聚糖、糖蛋白等[4-8]的生物活性近年来被相继发现，但对海蜇糖蛋白及其糖肽体外免疫活性方面的研究还未见报道。本实验从海蜇体内提取糖蛋白并制备不同分子质量段的糖肽，比较研究它们在不同培养时间及质量浓度条件下对小鼠脾淋巴细胞增殖和转化能力的影响，旨在为海蜇糖蛋白及糖肽的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

海蜇：2011年10月购于青岛沙子口渔港，冷冻保藏下运回实验室备用。

BALB/c小鼠：健康，雌性，体质量18～22g，购于洛阳市涧西区科讯仪器经营部。

复合蛋白酶 上海源叶生物科技有限公司；红细胞裂解液 北京索莱宝科技有限公司；台盼蓝母液 天津百赛斯生物科技有限公司；刀豆蛋白A(ConA) 美国Sigma公司；噻唑蓝(MTT) 上海丽臣生物科技有限公司；小牛血清 广州蕊特生物科技有限公司；RPMI1640培养基 上海江莱生物科技有限公司；二甲基亚砜(DMSO) 郑州浩力化工有限公司；其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

R205型旋转蒸发器 上海申生科技有限公司；HH-S6型恒温水浴锅 常州普天仪器制造有限公司；低温冷冻干燥机 北京惠诚佳仪科技有限公司；LXJ-802型台式低速离心机 金坛市恒来仪器制造有限公司；SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司；CO2培养箱 北京金西盟仪器有限公司；电子显微镜 郑州远中科技有限公司；酶标仪 北京元业伯乐科技发展有限公司。

1.3 海蜇糖蛋白及糖肽制备工艺[9-10]

海蜇自然解冻→组织匀浆→稀盐溶液浸提→过滤→浓缩→乙醇沉淀→分离纯化→真空冷冻干燥

糖蛋白粗品→酶解→真空冷冻干燥→糖肽粗品→超滤膜超滤→真空冷冻干燥→不同分子质量糖肽

1.4 实验设计

设糖蛋白组(电泳纯，蛋白含量92.84%，糖含量7.16%)、粗糖肽组(氮含量为95.83%)、糖肽Ⅰ组(糖肽分子质量小于3.5kD，氮含量为95.03%)、糖肽Ⅱ组(糖肽分子质量在3.5～7kD之间，氮含量为94.68%)、糖肽Ⅲ组(糖肽分子质量大于7kD，氮含量为96.14%)，5个组分。

在质量浓度为100µg/mL的条件下，设置6个时间点(12、24、36、48、60、72h)，测定各组分在不同培养时间条件下对小鼠脾淋巴细胞增殖和转化作用的影响。

在培养时间为60h的条件下，设置4个质量浓度梯度(25、50、100、150µg/mL)测定各组分在不同质量浓度条件下对小鼠脾淋巴细胞增殖和转化作用的影响。

1.5 小鼠脾淋巴细胞免疫活性的检测

1.5.1 脾淋巴细胞悬液制备[11]

小鼠脱颈椎处死，无菌摘取脾脏，过200目网筛，用Hank’s液洗涤2～3次，1500r/min离心10min，加入红细胞裂解液破红3～5min；1500r/min离心7min，弃上清；再用RPMIl640培养液洗涤。台盼蓝染色后计数，活细胞数应大于95%，用含10%小牛血清的RPMIl640培养液调整细胞浓度为5×106个/mL，备用。

1.5.2 小鼠脾淋巴细胞增殖实验[12-13]

采用MTT法。取96孔细胞培养板，实验组每孔加入100µL脾淋巴细胞悬液以及100µL糖蛋白或糖肽样液，另设空白对照孔(不加任何药物，只有淋巴细胞培养液)，及无细胞对照(10%小牛血清的RPMI1640培养液)。37℃、5%CO2条件下在培养箱中培养一段时间后，每孔加入20µL 5mg/mL的MTT溶液，在CO2培养箱中继续培养4h后，每孔加入0.2%的DMSO溶液150µL，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。用酶标仪测其在570nm波长处的吸光度，每组设6个重复孔。以实验孔吸光度减去空白对照孔吸光度即为所需的A570nm。

1.5.3 小鼠脾淋巴细胞增殖转化实验[14]

采用MTT法。取96孔细胞培养板，实验组每孔加入100µL脾淋巴细胞悬液、100µL糖蛋白或糖肽样液，同时加20µL 10µg/mL的ConA，设空白对照孔(不加任何药物，只有细胞培养液)，另设ConA对照(在细胞培养液里加入20µL 10µg/mL的ConA)及无细胞对照。37℃、5% CO2条件下在培养箱中培养一段时间后，每孔加入20µL 5mg/mL的MTT溶液，在CO2培养箱中继续培养4h后，每孔加入0.2%的DMSO溶液150µL，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。用酶标仪测其在570nm波长处的吸光度，每组设6个重复孔。以实验孔吸光度减去ConA对照孔吸光度即为所需的A570nm。

1.6 统计学处理

实验结果用

±s表示，实验数据采用t检验法进行组间比较分析。

2 结果与分析

2.1 各组分在不同培养时间对小鼠脾淋巴细胞增殖活性的影响

图 1 各组分在不同培养时间对小鼠脾淋巴细胞增殖活性的影响

Fig.1 Effect of cultivation time on the proliferation of mouse spleen lymphocytes

由图1可知，各实验组在0～24h内细胞增殖趋势平缓，24～60h细胞增殖能力逐渐增强，除糖肽Ⅱ组在48h、糖肽Ⅲ组在72h达到最大值外，其他3组均在60h时达到最大值，随后又呈下降的趋势。随着培养时间的增长，不同组分诱导脾淋巴细胞的增殖能力不同，呈现出一定的时间依赖性，其中糖肽Ⅰ作用效果显著高于其他组分。比较各实验组对细胞增殖活性的影响，糖肽Ⅰ组＞糖肽Ⅱ组＞粗糖肽组＞糖蛋白组＞糖肽Ⅲ组。淋巴细胞在体外经过不同物质刺激后，其有丝分裂活性可在体外培养72h内检测到，但由于刺激物质不同，最佳的培养时间通常也不同。黄青松等[15]在研究17β-雌二醇(E2)对人B淋巴细胞系IM-9细胞的调节作用时，发现E2对IM-9细胞系增殖反应呈时间依赖性，在体外培养48h后，细胞增殖显著增加。本实验结果也证明不同的刺激物对淋巴细胞增殖作用的最佳时间是不同的。

2.2 各组分在不同培养时间对小鼠脾淋巴细胞转化活性的影响

由图2可知，与脾脏细胞增殖实验相比，加诱导剂ConA后细胞转化能力显著增加；随着ConA的加入，不同实验组与ConA的协同效果出现了一定的差异，其中糖肽Ⅰ组、粗糖肽组、糖蛋白组与ConA的协同效果显著，而糖肽Ⅱ、糖肽Ⅲ组则表现的不显著；比较各实验组对细胞转化活性的影响，糖肽Ⅰ组＞粗糖肽组＞糖肽Ⅱ组＞糖蛋白组＞糖肽Ⅲ组。表明有丝分裂原ConA虽然能激活T细胞，促进T细胞增殖，且与各组分在细胞转化活性方面有协同作用，但对脾淋巴细胞有丝分裂的时间并无影响。

图 2 各组分在不同培养时间对小鼠脾淋巴细胞转化活性的影响

Fig.2 Effect of cultivation time on the transformation of mouse spleen cells

2.3 各组分不同质量浓度对小鼠脾淋巴细胞增殖活性的影响

图 3 不同质量浓度各组分对小鼠脾脏细胞增殖活性的影响

Fig.3 Effect of sample concentration on the proliferation of mouse spleen cells

由图3可知，随着质量浓度的逐渐升高，各组分对小鼠脾淋巴细胞增殖作用均呈现先上升后下降趋势，糖肽Ⅰ组在50µg/mL时，小鼠脾淋巴细胞增殖达到最大值，之后随质量浓度的进一步增大又呈下降趋势；糖肽Ⅲ组在150µg/mL时，小鼠脾淋巴细胞增殖趋于最佳，当质量浓度大于150µg/mL时，细胞增殖趋于下降；其他各组在100µg/mL时对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用最强，随后也呈下降趋势。比较各组分对细胞增殖活性的影响，糖肽Ⅰ组＞粗糖肽组＞糖肽Ⅱ组＞糖蛋白组＞糖肽Ⅲ组。不同物质对淋巴细胞增殖作用均存在最适作用剂量，即在此剂量下对淋巴细胞增殖作用最为显著，而高于或低于此剂量则有可能无增殖作用或增殖作用不明显。巢警殳等[16]研究蛙皮活性多肽促进小鼠淋巴细胞增殖作用，结果表明在质量浓度为400µg/mL时对细胞增殖作用最强；罗夏等[17]研究螺旋藻对人外周血淋巴细胞增殖的作用，发现螺旋藻水提膜内物100µg/mL和水提膜外物20µg/mL时，对小鼠脾淋巴细胞增殖作用高于ConA 100µg/mL时对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用，表明不同分子质量大小的物质对淋巴细胞增殖作用不同；王晓峰[18]研究药用多糖对奶牛淋巴细胞增殖实验，发现等剂量的枸杞多糖、牛膝多糖、蜂胶提取物以及几种多糖的混合物对奶牛淋巴细胞增殖作用不同，其中枸杞多糖与牛膝多糖、蜂胶提取混合物对淋巴细胞增殖作用最强，表明不同物质之间对淋巴细胞增殖有协同作用；本实验结果与以上结论相似，糖肽Ⅰ组的分子质量最小，最容易作用于细胞，对细胞增殖作用最强；粗糖肽组高于糖肽Ⅱ组和糖肽Ⅲ组，可能是由于几种糖肽对小鼠淋巴细胞增殖有协同作用。不同物质刺激同种类型的细胞，会产生不同的应答效果，这与分子激活、开启或关闭不同信号通路有关，而关于不同物质对细胞增殖作用的机理还有待进一步研究。

2.4 各组分不同质量浓度对小鼠脾淋巴细胞转化活性的影响

图 4 不同质量浓度各组分对小鼠脾淋巴细胞转化活性的影响

Fig.4 Effect of sample concentration on the transformation of mouse spleen cells

ConA是非特异性有丝分裂源，单独作用于淋巴细胞时能够促进淋巴细胞增殖转化，与某些特异性抗原共同作用时，对促进淋巴细胞增殖转化有协同作用。由图4可知，在一定剂量范围内各组分均能与ConA协同作用，显著提高脾淋巴细胞增殖转化能力，但协同效果有一定差异。与细胞增殖实验相比，各组分促脾淋巴细胞转化能力也表现出一定的剂量效应关系。随着质量浓度的逐渐升高，糖肽Ⅰ组在50µg/mL时达到最大值，之后随着质量浓度的进一步增大而呈下降趋势。其他各组在100µg/mL时对小鼠脾淋巴细胞的转化作用最强，之后也呈下降趋势。比较各组分对细胞增殖转化活性的影响，糖肽Ⅰ组＞粗糖肽组＞糖肽Ⅱ组＞糖蛋白组＞糖肽Ⅲ组。刘璐等[2]在两种枸杞糖肽对小鼠脾淋巴细胞增殖作用比较研究中提出实验室及工业生产的样品在较大剂量时与ConA合用，均具有协同作用。梁勇等[19]研究三七不同部位总皂苷对小鼠脾淋巴细胞增殖作用，发现三七筋条总皂苷与ConA协同作用不明显，而三七主根总皂苷与ConA协同作用能显著提高脾淋巴细胞增殖转化能力；郭曦等[20]研究4种中药多糖对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响，结果表明与ConA协同作用从强到弱依次为芦荟多糖、黑木耳多糖、黄芪多糖、银耳多糖。本实验结果与以上结论相似，不同组分与ConA协同作用效果不同，这可能与刺激物的结构、化学组成、分子质量大小有关，关于与ConA协同作用的机理有待进一步研究。

3 结 论

不同海蜇糖蛋白及糖肽，对脾淋巴细胞增殖和转化能力最佳反应时间和质量浓度不同。糖肽Ⅱ组在48h，糖肽Ⅲ组在72h增殖和转化达到最大，其他各组均在60h达到最大值，在培养时间为60h时，海蜇糖肽Ⅰ组对小鼠脾淋巴细胞的增殖和转化作用显著高于其他几个组分。各组分对淋巴细胞增殖转化能力的影响，糖肽Ⅰ组在50µg/mL时达到最大值，糖肽Ⅲ组在150µg/mL时趋于最佳，其他各组在100µg/mL时对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用最强。

参考文献：

[1] 祝绚, 鲍依稀, 李进, 等. 云芝糖肽、丹参酮ⅡA对荷瘤小鼠的抗肿瘤及免疫调节作用[J]. 中国免疫学杂志, 2008(24): 526-529.

[2] 刘璐, 杜光, 方建国. 两种枸杞糖肽促进小鼠脾淋巴细胞增殖作用比较[J]. 医药导报, 2007, 26(2): 130-134.

[3] 张铂, 吴梧桐, 吴杰连. 文蛤糖肽(MGP0405)的抗肿瘤活性及稳定性研究[J]. 药物生物技术, 2006, 13(1): 24-27.

[4] YU Huahua, LI Cuiping, LI Ronggui, et al. Factors influencing hemolyticactivity of venom from the jellyfish Rhopilema esculentum Kishinouye[J]. Food and Chemical Toxicology, 2007, 45(7): 1173-1178.

[5] 丁进锋, 苏秀榕, 李妍妍, 等. 海蜇胶原蛋白肽的免疫活性的研究[J]. 水产科学, 2011, 30(6): 359-361.

[6] 安桂香. 海蜇活性肽的制备及降压效果的研究[D]. 青岛: 中国海洋大学, 2006.

[7] 金晓石, 吴红棉, 钟敏, 等. 海蜇糖胺聚糖提取、纯化及其降血脂作用研究[J]. 中国海洋药物杂志, 2007, 26(4): 41-44.

[8] 任国艳, 梁旺春. 海蜇头糖蛋白分离纯化及免疫活性研究[J]. 食品科学, 2011, 32(17): 147-150.

[9] 田刚, 陈代文, 余冰, 等. 酶解鸡蛋清小肽混合物对小鼠免疫功能的影响[J]. 中国畜牧杂志, 2005, 41(5): 14-17.

[10] 王新宝, 卢蓉蓉, 任举, 等. 酶法制备乳铁蛋白抗菌肽的工艺[J]. 食品与发酵工艺, 2008, 34(2): 73-76.

[11] 章建设, 雷晓凌. 鱿鱼内脏糖蛋白提取工艺及其免疫活性初步研究[J]. 现代食品科技, 2008, 24(2): 167-170.

[12] 李法庆, 邸大林, 陈蕾. 莪术对小鼠免疫功能影响的研究[J]. 时珍国医国药, 2006, 17(8): 1482-1483.

[13] 单俊杰, 王易, 王顺春, 等. 当归多糖对小鼠脾淋巴细胞增殖及诱生IFN-γ的影响[J]. 药学学报, 2002, 37(7): 497-500.

[14] 曲桂娟, 董晓庆, 王延卓, 等. 苷肽注射液对犬淋巴细胞转化试验[J]. 中国兽药杂志, 2010, 44(12): 12-13.

[15] 黄青松, 牛志国, 郭继强, 等. 雌激素对IM-9细胞增殖及功能的调节作用[J]. 新乡医学院学报, 2007, 24(4): 329-331.

[16] 巢警殳, 张岚, 杜娟, 等. MTT法检测蛙皮活性多肽促进小鼠淋巴细胞增殖作用[J]. 吉林医药学院学报, 2011, 32(1): 15-17.

[17] 罗夏, 包志强, 孙树青, 等. 螺旋藻对人外周血淋巴细胞增殖的作用[J]. 微循环学, 2011, 21(4): 53-55.

[18] 王晓峰. 药用植物多糖对奶牛淋巴细胞增殖的影响试验[J]. 甘肃畜牧兽医, 2011(6): 8-10.

[19] 梁勇, 秦枫, 唐肖雷. 三七不同部位总皂苷溶血性及体外免疫活性研究[J]. 湖北农业科学, 2011(23): 4906-4907.

[20] 郭曦, 王继宏, 肖雪珍. 4种中药多糖对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响[J]. 中国兽医杂志, 2011(8): 56-58.