转高赖氨酸融合蛋白基因水稻谷蛋白急性毒性

赵祥祥1，陆长丽1，胡小兰1，纪丽莲1,*，刘巧泉2，唐 瑭1，刘福霞1

(1.淮阴师范学院生命科学院 江苏省环洪泽湖生态农业生物技术重点实验室，江苏 淮安 223300；

2.扬州大学农学院 植物功能基因组学教育部重点实验室，江苏 扬州 225009)

摘 要：以我国自主培育的转高赖氨酸融合蛋白基因水稻(简称转GL基因水稻)为材料，参考中华人民共和国国家标准，通过小鼠急性经口毒性实验研究转GL基因水稻谷蛋白的食用安全性。采用低碱法(0.35%)提取的谷蛋白以5000mg/kg最大剂量灌胃小鼠，连续观察14d后测定小鼠体质量、血常规、脏器系数和脏器的病理学检查。结果表明：整个实验期间，小鼠生长状态良好，无死亡和异常现象；转GL基因稻米谷蛋白LD50＞5000mg/kg，属实际无毒级别；各实验组间的小鼠体质量增长无明显差异，血常规指标、脏器系数和病理学检查也未见显著差异。因此，转GL基因水稻谷蛋白对小鼠无急性毒性作用。

关键词：转GL基因水稻；谷蛋白；急性毒性；食品安全

Acute Toxicity of Glutelin in Transgenic Rice Expressing Lysine-rich Fusion Protein Gene

ZHAO Xiang-xiang 1，LU Chang-li1，HU Xiao-lan1，JI Li-lian1,*，LIU Qiao-quan2，TANG Tang1，LIU Fu-xia1

(1. Jiangsu Key Laboratory for Eco-agricultural Biotechnology around Hongze Lake, School of Life Sciences,

Huaiyin Normal University, Huai’an 223300, China；2. Key Laboratory of Plant Functional Genomics, Ministry of Education, College of Agriculture, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China)

Abstract：Lysine-rich rice is a transgenic rice produced by inserting lysine-rich fusion protein gene into the germline of rice seeds. According to the national standard of the People’s Republic of China, the food safety of glutelin extracted from this transgenic rice by low alkali method was evaluated using acute toxicity test. In this study, glutelin was administered to ICR mice by oral gavage at the dose of 5000 mg/kg. for continuous 14 d. Some indicators including body weight, routine blood test, relative organ weights and histopathological examinations were conducted. The results showed that no toxic symptom was found in tested mice in the acute toxicity test, and the LD50 for glutelin was higher than 5000 mg/kg. The glutelin from transgenic GL gene rice, therefore, could be classified as actual nontoxic. No adverse effect on animal behavior or mortality was observed during the experiment. There were no significant biological changes in body weight, routine blood parameters or relative organ weights and no histopathological damage was detected. Our results suggested that the glutelin from transgenic GL gene rice had no acute toxic effect on ICR mice.

Key words：transgenic GL gene rice；glutelin；acute toxicity；food safety

中图分类号：TS201.6 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)17-0284-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201317060

水稻是世界上最主要的粮食作物之一，稻米品质的优劣对人类健康有重要的影响。据统计，我国有一半以上的人口以稻米为主食，水稻生产在我国国民经济中占有极其重要的地位。稻米所含能量高，其中的贮藏蛋白易被消化吸收，但蛋白质含量较低，赖氨酸被公认是稻米的第一限制必需氨基酸[1]。赖氨酸不足势必降低稻米蛋白质的利用率，从而影响以稻米为主食地区居民的营养状态。因此，增加稻米中赖氨酸含量，平衡其营养品质，提高稻米蛋白的生物利用率，具有迫切的需求。

近年来，随着转基因技术的迅速发展，已成功利用基因工程技术将富含赖氨酸的蛋白基因导入高产水稻，从而提高水稻中赖氨酸含量，改良稻米品质[2-4]。然而，转基因技术在提高农作物产量，改良品质或一些农艺性状的同时，也给转基因植物及其产品的食用安全带来一定的风险。由于外源基因的插入可能对受体原有基因的表达产生干扰，使受体本身的营养价值下降，甚至生成一些致敏或有毒的物质[5-6]。因此，对转基因作物进行食用安全性评价具有十分重要的意义。

本实验研究对象转高赖氨酸融合蛋白基因水稻(简称转GL基因水稻)是将源于四棱豆的富含赖氨酸蛋白(lysine-rich protein，LRP)基因融合进水稻种子贮藏蛋白——谷蛋白的小亚基(碱性亚基)中构建Gt:LRP融合蛋白(简称GL融合蛋白)，导入我国高产水稻品种“武香粳9号”，经选育获得的高赖氨酸含量的转基因水稻新品系[3]。该稻米中赖氨酸含量比亲本提高了24%，有很好的应用价值[3]。转基因生物安全评价应遵循“个案原则”，目前为止，董英[7]、Zhou Xinghua[8]等已对此转基因大米分别进行了SD大鼠90d喂养实验与3代繁殖实验，结果显示转GL基因大米没有对大鼠产生亚慢性毒性作用也未影响母鼠及仔鼠的繁殖能力，但对于转GL基因水稻蛋白的食用安全性研究尚未见报道。

谷蛋白作为水稻种子中最重要的贮藏蛋白，占总蛋白量的80%以上，且也是GL融合蛋白受体[3]。因此，本实验以转GL基因水稻为材料，参考中华人民共和国国家标准[9]，通过小鼠急性经口毒理实验，对转GL基因水稻的谷蛋白安全性做出初步评价，研究结果将为进一步研究转GL基因水稻的食用安全性提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与实验动物

转基因水稻：转GL融合蛋白基因水稻(2005年获农业部授权在江苏省进入环境释放，批复号为：农基安审字2005第052号)，由扬州大学植物功能基因组学教育部重点实验室选育并提供。

受体水稻：我国高产水稻品种“武香粳9号”，由扬州大学植物功能基因组学教育部重点实验室提供。

清洁级ICR成年小鼠30只，体质量18～22g，雌雄各半，由江苏大学实验动物研究中心提供，动物生产许可证号：SCXK(苏)2009-0002；动物实验许可证号SYXK(SU)2008-0024，饲养于江苏大学实验动物中心屏障系统内，饲养室温度为(22±2)℃，相对湿度为40%～60%，每天12h日光灯照明，空气换气速度为18次/h，自由进食和饮水。小鼠饲养于垫以消毒锯木屑的塑料笼内，笼内垫料均经高压灭菌处理。

1.2 试剂与仪器

氢氧化钠、盐酸、甘油、NaCl、甲醛、EDTA二钾 国药集团化学试剂有限公司；30%凝胶贮液 上海捷瑞公司；四甲基二乙胺(TEMED) 美国Sigma公司；Tris-base、SDS、APS、尿素、β-巯基乙醇、溴酚蓝、甘氨酸、G-250考马斯亮蓝 美国Amresco公司。

IS9001型电子天平 赛多利斯科学仪器有限公司；DK-S28电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司；Mettler Toledo FE20 pH计 瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司；5810R台式高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂有限公司；BC-300血液细胞分析仪 上海迈瑞实业有限公司。

1.3 方法

1.3.1 转GL基因稻米谷蛋白的提取

将转GL基因稻米和亲本稻米磨成粉状，过200目筛后备用。取50g米粉，加质量分数0.35%的NaOH溶液，固液比为1:8，浸泡4h后，4000r/min离心15min，收集上清液。将上清液用浓度为0.1mol/L的盐酸调pH值，边加盐酸边用玻棒轻轻搅拌[10]，直到pH值降到稻米谷蛋白的等电点。酸沉后的沉淀再次4000r/min离心15min，倒掉上清液，收集蛋白沉淀，得到大米谷蛋白。蛋白经冷冻干燥后于4℃冰箱冷藏备用。

1.3.2 谷蛋白急性毒性实验

1.3.2.1 实验设计与方法

将ICR实验小鼠按蛇形分组法分为3组：转GL基因水稻谷蛋白组(转基因组)、亲本“武香粳9号”谷蛋白对照组(亲本组)、空白对照组(空白组)。每组10只，雌雄各半。转基因组、亲本组的剂量均设为5000mg/kg，即用蒸馏水将转基因稻米谷蛋白以及亲本稻米谷蛋白配制成质量浓度为250mg/mL的糊状物，以20mL/kg的灌胃容量对小鼠1次经口灌胃，空白对照组给予同等体积的蒸馏水。

小鼠灌胃前饲养3～5d，以适应屏障系统环境。灌胃1h后以常规基础饲料饲养，自由进食和饮水，连续观察14d，每天观察2次，观察期间记录小鼠的中毒症状、异常反应与死亡情况。

1.3.2.2 中毒指标观察

表 1 啮齿动物中毒表现观察项目

Table 1 Observation of rodent poisoning symptoms

参考中华人民共和国国家标准[9]，按表1观察小鼠中毒表现，每天记录受试小鼠的表观行为、动作、皮肤及生殖泌尿系统等表观症状，记录小鼠在实验期间的死亡情况，并根据急性毒性剂量分级计算LD50[9]。

1.3.2.3 血常规测定

实验末期将各组小鼠摘眼球取血。取0.5～1mL血液于抗凝血管中(抗凝剂为EDTA二钾)，充分摇匀，作血常规检测，小鼠在摘眼球取血前禁食12h。

血常规检测包括：白细胞计数(WBC)、红细胞计数(RBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞压积(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、平均血红蛋白含量(MCH)、平均血红蛋白浓度(MCHC)、红细胞分布宽度(RDW)、血小板计数(PLT)、平均血小板体积(MPV)、血小板分布宽度(PDW)、血小板压积(PCT)。

1.3.2.4 脏器系数测定

小鼠取血后解剖取脏器，将心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺、胃、十二指肠、卵巢和睾丸，用生理盐水冲洗后去除脏器表面残留的血液和结缔组织，用滤纸吸干水分，准确称量各脏器的质量。

脏器系数/%= ×100

脏器质量

体质量

1.3.2.5 组织病理学检查

将采集的脑、心、肝、脾、肺、肾、胃、胸腺和十二指肠等脏器用 4%甲醛溶液固定，进行组织病理学检查。

1.4 数据处理

实验数据以

x

±s表示，用SPSS16.0软件进行统计分析，以P＜0.05为统计学差异。

2 结果与分析

2.1 小鼠生长发育状况和LD50

整个实验期间，对所有受试小鼠表观行为、活动状况、呼吸、进食饮水、毛色和姿势等各项目的观察均未见异常，也未出现死亡或任何毒性反应症状(表2)。本实验中，转GL基因水稻谷蛋白以最大剂量5000mg/kg对小鼠灌胃，参照急性毒性分级表[9]，该蛋白LD50＞5000mg/kg，属于实际无毒级别。

表 2 急性毒性实验小鼠死亡情况

Table 2 Results of acute toxicity test

2.2 小鼠体质量变化分析

实验动物在生长发育期体质量的增长情况是综合反映动物健康状况最基本的灵敏指标之一，可反映受试物的综合毒性效应。灌胃后0、5、10d和14d小鼠体质量增长情况如图1所示，各组小鼠体质量均呈持续增长趋势。无论是雄鼠还是雌鼠，转基因组小鼠在不同生长阶段的体质量与亲本组、空白组相比，均无显著性差异(P＞0.05)。表明转GL基因大米谷蛋白未对小鼠体质量产生不良影响。

图 1 小鼠体质量增长情况

Fig.1 Changes of mouse body weight

2.3 血常规结果分析

血液学指标的变化，可反映受试物所致的各器官系统功能的紊乱。比如WBC、PLT的升高，主要见于各种感染引发的疾病、组织损伤或坏死、过敏反应、中毒反应、肿瘤及血液病[11]。由表3可知，无论是雌性组还是雄性组，转基因组与亲本对照组、空白对照组相比，所有的血常规指标均无显著性差异(P＞0.05)。上述结果表明，转GL基因大米谷蛋白未对小鼠的血常规指标造成不良影响。

表 3 小鼠血常规结果分析

Table 3 Results of routine hematological test

2.4 小鼠脏器系数测定结果

实验动物随着年龄和体质量的增长，在不同年龄期各脏器与体质量之间的比值均有一定的规律。如果实验组与对照组比较后出现显著性差异，说明受试物可能对某个脏器有损害作用。因此计算脏器系数是急性毒性实验中一种简单、直接检测受试物作用靶器官的方法。如脏器系数增大，则可能有充血、水肿、肿瘤或增生肥大性变化等现象出现；如脏器系数降低，则可能有坏死、萎缩、退行性变化等现象出现[12]。小鼠脏器系数测定结果如表4所示。雄性组中转基因组与亲本组、空白组相比，脏器系数均无显著性差异(P＞0.05)。雌性组中转基因组中只有脑脏器系数显著高于空白对照组，但与亲本对照组之间无显著差异(P＞0.05)。上述结果表明转GL基因大米谷蛋白未对小鼠的主要脏器造成不良影响。

表 4 小鼠脏器系数测定结果

Table 4 Relative organ weights of mice

%

注：a.与空白组比较，有显著差异(P＜0.05)；/.此组数据可以省略。

2.5 组织病理学检查结果

组织病理学可反映机体器官与组织的损伤程度以及功能性变化，也是检测毒性程度所采用的常见方法。由图2可知，实验末期，取各实验组小鼠的脑、心、肝、脾、肺、肾、胃、十二指肠、胸腺、睾丸(雄鼠)和卵巢(雌鼠)等脏器进行肉眼观察，脏器外观形态正常，未见组织异常情况；对主要器官进行病理组织学检查也未见各器官发生异常的形态学改变。

a

b

c

d

e

f

g

h

i

j

k

l

m

n

o

a、b、c、d、e.分别为转基因组雌性小鼠的心、肝、脾、肺、脑的组织切片图；f、g、h、i、j.分别为转基因组雄性小鼠的心、肝、脾、肺、脑的组织切片图；k、l、m.分别为亲本对照组雌性小鼠的肺、脑、肝的组织切片图；n、o.分别为空白对照组雄性小鼠的肺、脑组织切片图。

图 2 小鼠主要器官的病理切片图

Fig.2 Histopathological examination of the major organs of mice

3 讨 论

随着转基因作物在全球种植面积的不断扩大，转基因作物的食用安全性受到越来越多的关注。许多国家和一些国际组织都相继制订了一系列针对转基因植物食用安全性的管理法规、评价原则等[9,13-14]。目前，转基因作物的安全性评价主要以“实质等同性”为基本原则[15]。根据此原则，对转基因作物及其对应的非转基因亲本作物在表型、农艺性状、组成成分等方面进行详细的比较，从而分析两者之间是否具有实质性差异。但是由于转基因过程中非预期效应的存在使得“实质等同性”概念受到很大的挑战[16]。因此，即使转基因作物与其相对应的传统作物在化学成分等各方面很相似，也应对其进行毒理学、致敏性等方面的评价，而在这些评价体系中动物实验通常是最重要的[17-20]。因为动物喂养实验可以直接观察到转基因作物及其产品是否对机体有毒副作用。

急性毒性实验作为毒理学评价的第一步，能评价短时间接触受试物所产生的急性毒性作用，可以为亚慢性、慢性毒性实验研究的剂量设计及观察指标提供参考依据。本实验采用小鼠口服最高剂量(5000mg/kg)对ICR小鼠进行灌胃，灌胃后连续观察14d，受试小鼠行为状态良好，未见明显的中毒症状和不良反应，也未发生小鼠死亡和生长发育异常现象。结果表明，小鼠对转GL基因大米谷蛋白的最大耐受量等于或大于5000mg/kg。按照急性毒性分级标准，转GL基因水稻谷蛋白急性毒性的LD50＞5000mg/kg，该蛋白属实际无毒级别。

实验期间，转基因组和亲本对照组之间所有指标均无统计学差异，说明转GL基因大米谷蛋白和亲本大米谷蛋白对小鼠具有同等的食用安全性；转基因组小鼠所有指标中仅有脑脏器系数与空白对照组相比有统计学差异，但与亲本对照组无显著差异，因此该差异并无生物学意义。此外，病理学检查也未发现有明显的病理变化。综上结果表明，在本实验的灌胃量内，转GL基因大米谷蛋白未对实验小鼠产生急性毒性作用。

本实验只是初步研究了转GL基因水稻谷蛋白的急性毒性，对于转GL基因水稻的基因表达产物的安全性评价还需进行长期深入的研究。如优化实验条件提取纯化外源蛋白直接对外源蛋白进行全面的生物学、毒理学综合评价等。

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