中国蛤蜊精对小鼠免疫活性观察

史 倩1，王晓洁1,*，张志伟1，刘晓晨1，梁建光1，王守海1，刘新生2，曲彦清2

(1.鲁东大学生命科学学院，山东 烟台 264025；2.鲁东大学校医院，山东 烟台 264025)

摘 要：目的：观察中国蛤蜊精(每100g中，含多糖19.01g、牛磺酸1.25g、胆碱0.65g)对小鼠免疫功能的影响。方法：用中国蛤蜊精按0.5、1.5、3.0g/(kg•d)的剂量对小鼠灌胃，连续10d，测定小鼠白细胞总数及分类计数、通过抗体凝集反应实验测定效价、测定抗体生成细胞水平、腹腔巨噬细胞吞噬功能、体质量变化及免疫器官质量，并对其结果进行统计分析。结果：与生理盐水组(对照组)相比，中国蛤蜊精各剂量组淋巴细胞相对数、抗体生成水平、抗体生成细胞水平、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能和脾脏指数均显著升高(P＜0.05)。结论：中国蛤蜊精有显著增强小鼠免疫功能的作用。

关键词：中国蛤蜊精；细胞免疫；体液免疫；非特异性免疫

Immunoenhancing Activity of Mactra chinensis Meat Extract in Mice

SHI Qian1，WANG Xiao-jie1,*，ZHANG Zhi-wei1，LIU Xiao-chen1，LIANG Jian-guang1，

WANG Shou-hai1，LIU Xin-sheng2，QU Yan-qing2

(1. College of Life Science, Ludong University, Yantai 264025, China；

2. College of Hospital, Ludong University, Yantai 264025, China)

Abstract：Objective: To observe the immunoregulatory effect of Mactra chinensis meat extract (EMC, containing 19.01 g of polysaccharide, 1.25 g of taurine and 0.65 g of choline /100 g) in mice. Methods: Mice were orally administered with EMC at doses of 0.5, 1.5, 3.0 g/(kg•d) for 10 d. A series of immune function indices such as the total number and classification of white blood cells (WBC), the titer of antibody production in agglutination reaction and the quantity of plaque-forming cells (PFC), macrophage phagocytosis test, and the weight of body and immune organs were analyzed. Results: Compared with the control group, the relative number of lymphocytes, the activity of antibody production, the quantity of antibody-forming cells, the phagocytic function of mouse peritoneal macrophages and the index of spleen in all the treated groups were improved significantly (P ＜0.05). Conclusion: EMC enhances the immune activity of normal mice effectively.

Key words：water extract from Mactra chinensis (EMC)；cellular immunity；humoral immunity；nonspecific immunity

中图分类号：TS201.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)17-0305-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201317064

中国蛤蜊(Mactra chinensis Philippi)是一种海贝，又名沙蛤、飞蛤，主要分布在我国北方沿海，朝鲜、日本也有分布。中国蛤蜊为被动性的滤食性贝类，以浮游生物为食[1]，由于其繁殖力强、生长快、栖息密度高、肉味鲜美、营养丰富，研究表明，其肉内含有丰富的蛋白质、氨基酸、牛磺酸、多糖、胆碱等重要的生物活性物质[2-4]，因而中国蛤蜊深受群众欢迎，是一种具重要经济价值的养殖贝类，同时由于其肉、壳均可入药，有软坚散肿的疗效，又具有一定的药用价值，具有开发为保健品的潜能。因此，中国蛤蜊是一种极具发展潜能的海产品种类，具有广阔的市场前景。目前，对中国蛤蜊的结构和功能的研究正在逐步开展，已有对其组织培养[5]、消化系统的组织学与组织化学[1]、神经系统大体解剖和显微研究[6]、肝损伤保护[7]、体内外抗肿瘤作用的报道，但对其免疫功能尚未见研究报道。

本实验选用鲜活中国蛤蜊，采用水提法获得提取物，对小鼠进行梯度灌胃后，通过对小鼠白细胞总数及分类计数、测定腹腔巨噬细胞吞噬功能、称取体质量变化及免疫器官质量、进行抗体凝集反应实验并检测抗体生成细胞水平从非特异性免疫、细胞免疫和体液免疫的角度来探究中国蛤蜊精对正常小鼠免疫功能的影响，为进一步研究开发中国蛤蜊的营养价值提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

昆明种小鼠(30只，雌雄各半，体质量19～23g)由烟台只楚药业有限公司提供，实验动物生产许可证号：5CXK(鲁)20030007；家兔由鲁东大学生理实验室提供；中国蛤蜊购自烟台市文化路市场。

甲醇(分析纯)、可溶性淀粉(分析纯) 天津市广成化学试剂有限公司；琼脂粉(分析纯) 天津市大茂化学试剂厂；丙酮(分析纯) 烟台三和化学试剂有限公司；吉姆萨氏色素 北京化工厂；氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾等。

1.2 仪器与设备

AL104电子天平 瑞士梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；LDZX-40BI立式自动电热压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；TGL-16C离心机 上海安亭科学仪器厂；GNP-9080隔水式恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司；M-2100全自动三分类血球计数仪 济南兰桥实验设备有限公司；抗凝管、血凝板、血细胞计数板等。

1.3 方法

1.3.1 中国蛤蜊精的制备

称取市售鲜活中国蛤蜊，海水浸泡吐净沙子，煮熟去壳取肉称质量，并绞碎软体部分，按质量比1:20加入汤汁(煮后水)搅拌均匀，超声波进一步破碎，90℃水浴振荡浸提2h，过滤后干燥称质量，4℃保存，实验时用生理盐水配制成所需浓度[7]。经测定，该中国蛤蜊精的主要成分为：多糖(19.01g/100g)、牛磺酸(1.25g/100g)、胆碱(0.65g/100g)[7]。

1.3.2 动物分组及给药

将24只小鼠随机分为4组，雌雄各半，每组6只。实验组设置低、中、高剂量3组，分别按0.5、1.5、3.0g/(kg•d)[8]给小鼠用药，每天灌胃1次，每次0.2mL，对照组灌胃等量生理盐水，连续10d。

1.3.3 鸡红细胞悬液及补体制备

自鸡翼下静脉采血，加入相当于鸡血体积5倍的抗凝剂混匀，4℃冰箱贮存。临用时，用生理盐水洗涤3次，前2次洗涤时离心为1500r/min，5min/次，吸弃上清和界面的白细胞层，第3次洗涤后连续离心2次(2000r/min，5min)至细胞压积恒定[9]。用生理盐水配成体积分数为1.25%、5%、10%的鸡红细胞(CRBC)悬液。

补体制备：从健康家兔耳背部静脉取血，分离血清，用生理盐水制成1:60的血清，临用现配。

1.3.4 白细胞总数及分类计数的测定

断尾采血，将小鼠尾部浸于约50℃温水中，稍见膨胀后取出，用纱布擦拭干净，于尾尖1～2cm处剪断，轻轻揉动采血，同时不断敲打抗凝管底部，以防止凝血。采血后1h内进行血相测定。

1.3.5 抗体凝集反应实验

灌胃第6天，每只小鼠腹腔注射5%的CRBC悬液0.2mL，5d后，断颈取血，室温条件下静置2h，37℃静置2h，再转入冰箱中静置2h，分离血清备用。

进行抗体凝集反应实验：在血凝板内用生理盐水对血清倍比稀释，各50μL，各加入1.25%的鸡红细胞悬液50μL，混匀，于湿盒内37℃孵育3h后，观察抗体凝集反应[10]，以能够产生凝集现象的最大稀释倍数作为抗体的效价[11]。

1.3.6 腹腔巨噬细胞吞噬功能的测定

灌胃第9天，各实验组小鼠腹腔注射5%无菌淀粉溶液0.2mL，24h后，腹腔注射5% CRBC悬液0.2mL，30mim后，腹腔注射生理盐水0.2mL，轻轻按揉腹壁1min，吸出腹腔液制成薄涂片，置湿盒37℃孵育30min，PBS冲洗，去除未贴壁的巨噬细胞和游离CRBC，用体积比为1:1的丙酮-甲醇液固定7～8min，自然晾干，用吉姆萨-瑞士染液染色20min，油镜下选取200个巨噬细胞，计数其中吞噬CRBC的细胞及其吞噬的CRBC数，用公式(1)、(2)[12]计算吞噬百分率和吞噬指数。

(1)

(2)

1.3.7 体质量及免疫器官质量测定

动物称质量，处死后即取出脾脏，用滤纸吸去血液，除去脂肪、系膜，用电子天平称其湿质量，用公式(3)[13]计算脾脏指数。

(3)

1.3.8 抗体生成细胞的检测

脾脏称质量后，用生理盐水清洗，过200目筛，制成1×107个/mL的细胞悬液。取试管加入10%的CRBC悬液50μL、脾淋巴细胞悬液100μL后45℃水浴混匀，加入琼脂糖溶液(琼脂粉加热熔化后，加入等量预热的双倍生理盐水，混匀)400μL，水浴混匀，迅速倒于载玻片上，湿盒37℃孵育后加入新鲜稀释的兔血清，继续孵育2h，即可出现溶斑，取出晾干后，计数每个小鼠脾脏的溶血空斑数[14]。

1.4 统计学处理

实验结果以

±s表示，组间方差齐性用F检验，组间差异采用t检验。

2 结果与分析

2.1 中国蛤蜊精对小鼠白细胞总数及分类计数的影响

表 1 EMC对小鼠白细胞总数及分类计数的影响(

x

±s，n=6)

Table 1 Effect of EMC on total number and classification of WBC in mice (

x

±s，n=6)

注：a. 与对照组相比差异显著(P＜0.05)。表3、4、5同。

由表1可知，各剂量组连续灌胃中国蛤蜊精10d后，中国蛤蜊精低、高剂量组的白细胞总数与对照组相比均有显著降低(P＜0.05)，中剂量组显著升高(P＜0.05)；中国蛤蜊精各剂量组的淋巴细胞相对值与对照组相比均有显著升高(P＜0.05)；中国蛤蜊精各剂量组的中性粒细胞相对值与对照组相比均有显著降低(P＜0.05)。

2.2 中国蛤蜊精对抗体生成的影响

表 2 EMC对抗体生成的影响(

x

±s，n=6)

Table 2 Effect of EMC on antibody production (

x

±s，n=6)

注：b.与对照组相比差异极显著(P＜0.01)。

由表2可知，与对照组相比，中国蛤蜊精各剂量组鸡红细胞抗体生成水平均有极显著升高(P＜0.01)。

2.3 中国蛤蜊精对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

表 3 EMC对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响(

x

±s，n=6)

Table 3 Effect of EMC on phagocytic function of mouse peritoneal macrophages (

x

±s，n=6)

由表3可知，与对照组相比，中国蛤蜊精各剂量组小鼠腹腔巨噬细胞对CRBC的吞噬百分率、吞噬指数均有显著提高(P＜0.05)。

2.4 中国蛤蜊精对小鼠免疫器官指数的影响

由表4可知，对照组和中国蛤蜊精各实验组体质量均有增加；中国蛤蜊精各剂量组与对照组相比脾脏指数均有显著升高(P＜0.05)。

表 4 EMC对小鼠体质量变化和免疫器官指数的影响(

x

±s，n=6)

Table 4 Effect of EMC on body weight and spleen index of mice

(

x

±s，n=6)

2.5 中国蛤蜊精对抗体生成细胞水平的影响

表 5 EMC对抗体生成细胞水平的影响(

x

±s，n=6)

Table 5 Effect of EMC on the activity of antibody-forming cells (

x

±s，n=6)

由表5可知，中国蛤蜊精中、高剂量组有显著提高抗体生成细胞水平的作用(P＜0.05)。

3 讨 论

结果表明，中国蛤蜊精各剂量组均可以使抗体效价、巨噬细胞吞噬CRBC的百分率和吞噬指数、脾脏指数显著升高，中国蛤蜊精中、高剂量组可显著提高抗体生成细胞水平。这提示该中国蛤蜊精作为一种潜在的海洋生物保健品，具有一定增强小鼠免疫活性的功效。

从实验结果可见，中国蛤蜊精高剂量组和低剂量组白细胞总数与对照组相比，均有显著降低，且各实验组中性粒细胞的数量也均有显著降低。研究表明，中性粒细胞的减少可能与体内的自身抗体或自身抗原-抗体复合物的存在有关，可能通过抗体活化补体而将中性粒细胞黏附到其他淋巴细胞表面，而使中性粒细胞的清除率升高[15]。另外，中性粒细胞在吞噬处理大量抗原后，自身也会死亡，成为脓细胞被清除，所以中性粒细胞的吞噬功能增强导致死亡率升高也有可能使其相对值短期内有所下降。白细胞总数降低的原因可能与中性粒细胞相对值的降低有关。而且各实验组小鼠淋巴细胞的相对值均有显著升高，可以说明其特异性免疫功能增强。

在抗体凝集反应中，各实验组与对照组相比，抗体效价均有极显著升高，即血清中抗鸡红细胞抗体生成的相对含量均有所升高；溶血空斑实验是检测抗体生成细胞数量的主要方法，本实验中由兔血清提供补体，鸡红细胞悬液提供红细胞，研磨脾脏得到活性淋巴细胞，主要为抗体生成细胞(即B细胞)，利用淋巴细胞结合周围的红细胞，激活补体使红细胞破裂，在淋巴细胞周围形成空斑的原理，计数溶血空斑数，每个溶血空斑即代表一个抗体生成细胞，各实验组的溶血空斑数显著增加，说明实验组小鼠脾脏中抗体生成细胞的数量有显著增加。以上结果均说明各实验组的体液免疫有一定增强。另外，小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬指数和吞噬百分率均有显著升高，说明实验组小鼠的非特异性免疫也有增强。脾脏是机体最大的免疫器官，含有大量的B淋巴细胞、T淋巴细胞和巨噬细胞，直接参与机体的细胞免疫和体液免疫，各实验组的脾指数均有显著升高说明脾脏的免疫功能增强。实验过程中，小鼠体质量均呈增加趋势，但中国蛤蜊精各实验组与对照组比较无显著差异。

值得一提的是，在以上中国蛤蜊精各实验组中，中剂量组作用尤其显著，可能为最佳应用剂量，有资料显示[16]，当免疫物剂量过低，不足以激发免疫功能，而过高可引起免疫耐受，因而在使用免疫增强剂时，一定要注意量效关系，以免引起不良后果。本实验也证明这一点，所以将进一步对其最佳剂量作出研究。

本实验中所用中国蛤蜊精的主要功能成分为多糖、牛磺酸、胆碱等。研究表明，从多种海洋贝类提取出的多糖可以提高小鼠的免疫功能，如厚壳贻贝多糖[14]、彩虹明樱蛤多糖[17]可以促进小鼠脾脏发育，在碳粒廓清实验中可加快廓清速率，能够增强小鼠单核-巨噬细胞的吞噬功能和NK细胞的杀伤活性，对实验小鼠的体液免疫和细胞免疫均有显著增强作用。而本实验中，实验组小鼠的脾指数与对照组相比均有显著升高，抗体生成水平显著升高，腹腔巨噬细胞的吞噬指数显著升高，与上述材料中的实验结果一致，说明该结果可能与本实验所用中国蛤蜊精中含有的19.01%的多糖有关。关于多糖提高机体免疫活性的机理目前主要有以下几种：1)通过增加胸腺细胞和脾细胞内Ca2+浓度(Ca2+浓度与淋巴细胞的增殖、分化和激活密切相关)、调节细胞内cAMP和cGMP的含量和比值(作为第二信号系统，与细胞的增殖激活、抗体产生、细胞毒活性、细胞因子的产生有相关性，但对于cAMP和cGMP对淋巴细胞的激活与增殖的作用目前尚有争议)、增强巨噬细胞等免疫细胞合成NO，杀伤微生物和肿瘤细胞。2)多糖与免疫细胞表面的受体结合，增强其免疫功能。另外，随着近几年“红细胞免疫系统”概念的提出和研究，发现多种多糖可以通过改变红细胞膜相C3b受体活性而增强红细胞的免疫功能[18]。3)在转录水平促进细胞因子基因表达，从而促进其分泌。4)清除自由基，抑制脂质过氧化，保护生物膜。如黄芪多糖可以增强免疫器官中的SOD和GSH-Px活性，从而增强免疫防御和免疫监视[19]。5)促进补体激活。在本实验中，中国蛤蜊精的作用原理有待进一步研究。

在本实验获得的中国蛤蜊精中，牛磺酸的含量为1.25g/100g。据研究，牛磺酸具有多种生理功能，在饮水中添加1%牛磺酸可以增强小鼠单核吞噬细胞的吞噬功能，提高体液免疫功能[20]，并对免疫抑制模型小鼠的脾指数、胸腺指数、抗体生成数量和半数溶血值以及单核巨噬细胞的吞噬功能均有显著增强作用[21]。这些研究结果与本实验的结果有一定的一致性，在后续的研究中，将对中国蛤蜊精的有效成分的功效作进一步细化比较实验。

综上所述，中国蛤蜊精在提高小鼠免疫功能方面有一定的效果，只是作用机理尚无深入研究，说明该中国蛤蜊精具有成为增强免疫功能的海洋生物保健品的潜能。

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