条浒苔蛋白质的超声波辅助提取及其性质

盘赛昆1,2，朱 强1,2，王淑军1,2，王 艳2，姚东瑞2,3,*

(1.江苏省海洋生物技术重点建设实验室，江苏 连云港 222005；2.淮海工学院食品工程学院，江苏 连云港 222005；

3.江苏省中国科学院植物研究所，江苏 南京 210014)

摘 要：为了开发利用绿潮藻类浒苔中含量丰富的蛋白质，以蛋白质提取率为指标，首先通过单因素试验确定提取条件，然后采用均匀设计优化超声波辅助提取工艺条件，并测定条浒苔蛋白质的等电点、起泡性、乳化性、吸油性、溶解性等性质。结果表明：条浒苔蛋白质的提取条件为料液比1:20(g/mL)、pH11.0、温度60℃、时间5h；超声波辅助提取条件为总时间50min、超声时间2.7s、间隙时间11.0s、总体积50.8mL、超声功率627.0W。条浒苔蛋白质的提取工艺为经超声波处理后再碱提5h，在此条件下蛋白质的提取率为41.64%～48.70%。条浒苔蛋白质的等电点pI 3.0，在pH7.0时起泡性最好，起泡性随着蛋白质质量浓度增加而增强，泡沫稳定性在pH3.0和质量浓度2mg/mL时最好，乳化性在4mg/mL时最好，乳化稳定性在2mg/mL时最好，条浒苔蛋白质的吸油性为131.6%，60℃时溶解性最大。

关键词：条浒苔；蛋白质；超声波；均匀设计；功能性质

Ultrasonic-Assisted Extraction and Properties of Protein from Enteromorpha clathrata

PAN Sai-kun1,2，ZHU Qiang1,2，WANG Shu-jun1,2，WANG Yan2，YAO Dong-rui2,3,*

(1. Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology, Lianyungang 222005, China；

2. School of Food Engineering, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China；

3. Institute of Botany Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210014, China)

Abstract：In order to utilize protein in Enteromorpha clathrata, a type of green tide alga, the extraction of protein from E. clathrata was explored using uniform design and the properties of the protein were evaluated. Results indicated that the optimal water extraction conditions were solid-liquid ratio of 1:20 (g/mL), pH 11.0, extraction temperature of 60 ℃, and extraction time of 5 h. The optimal ultrasonic-assisted extraction conditions were total treatment time of 50 min, ultrasonic treatment time of 2.7 s, interval time of 11.0 s, total volume of 50.8 mL, and ultrasonic treatment output power of 627.0 W. Under these conditions, the extraction rate of protein was 41.64%–48.70%. The pI of the extracted protein was 3.0. The foaming capacity was the highest at pH 7.0. The foaming stability remained the highest level at pH 3.0 and 2 mg/mL. Emulsifying capacity and emulsion stability reached the highest at 4 mg/mL and 2 mg/mL, respectively. The oil-absorbing capability of the protein was 131.6%. The maximum solubility was measured at 60 ℃.

Key words：Enteromorpha clathrata；protein；ultrasonic-assisted extraction；uniform design；functional property

中图分类号：TQ936.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)18-0012-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201318003

浒苔属(Enteromorpha)在分类学上属于绿藻门(Chlorophyta)、石莼目(Ulvales)、石莼科(Ulvaceae)，主要有条浒苔(Enteromorpha clathrata)、肠浒苔(E. intestinalis)、扁浒苔(E. compressa)、浒苔(E. prolifera)、缘管浒苔(E. 1inza)5种，生长在潮间带[1]。浒苔是一种绿潮藻类，2008年奥运会期间曾在黄海中、南部海域爆发成灾，引起了国家的高度重视。事实上，浒苔是一种具有很高利用价值的藻类资源，研究[2]表明浒苔含有丰富的营养成分，干缘管浒苔含蛋白质27.0%，多糖53.7%、粗纤维10.2%、灰分8.2%及脂肪0.9%，同时还含有丰富的维生素。在我国《食物营养成分表》中记载，浒苔含铁量达283.7mg/100g，为我国食品之最，Mg和Zn的含量也较其他海藻高[3]。浒苔蛋白质中氨基酸种类齐全，必需氨基酸(EAA)占氨基酸总量(TAA)的38%，必需氨基酸与非必需氨基酸的比值(EAA/NEAA)为0.62，氨基酸评分为79～80，高于海带(47)和紫菜(54)[2,4-5]。此外，缘管浒苔氨基酸中，呈味氨基酸占50%左右，其中谷氨酸的含量较高，为其风味的形成奠定了良好的物质基础[2]。各项营养指标均表明浒苔蛋白质是一种优质的蛋白质，同时由于浒苔生长迅速，生物量大，因此浒苔是一种良好的植物蛋白质来源。目前，人们的研究主要集中在浒苔中含量最大的碳水化合物上[6-11]，而对蛋白质的研究相对较少，对浒苔蛋白质性质的研究尚未见报道。

均匀设计是我国数学家王元和方开泰于1978提出的一种重大的科学实验方法[12]。该方法较正交设计能更有效地处理多水平的试验，减少试验次数。均匀设计与常用的正交设计“均匀分散，整齐可比”的特点不同，只考虑试验点在试验范围内的均匀散性，能用较少的试验点获得更多的信息，在研究多因素多水平试验时具有很大的优越性[13]。但由于不具备“整齐可比性”，因此试验结果的分析不能采用方差分析，而必须采用回归分析。随着计算机的普及，科学家们已开发许多软件可用于均匀设计试验结果的分析，为均匀设计的普及应用奠定了基础。其中，由唐启义等[14]开发的数据处理系统(date processing system，DPS)包含了常用的各种统计方法，具有操作简单和数据处理功能强大等特点，是目前均匀设计试验结果分析行之有效的软件。

本实验首先采用单因素试验研究条浒苔蛋白质的提取条件，再采用均匀设计对超声波辅助提取工艺进行优化。测定条浒苔蛋白质的等电点、起泡性、乳化性、溶解性等性质，以期为浒苔深加工及资源化利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

浒苔采于福建厦门，经淮海工学院海洋学院水产养殖系鉴定为条浒苔(Enteromorpha clathrata)，用洁净海水清洗干净，干燥备用，条浒苔中粗蛋白质质量分数为(23.46±0.64)%；试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

DK20消化系统、UDK132半自动蒸馏装置 意大利VELP公司；AF-06A密封型摇摆式中药粉碎机 温嶺市奥力中药机械有限公司；ZNC-701超微粉碎机 北京兴时利和科技发展有限公司；SCIONTZ-IID超声波细胞破碎仪 南京先欧仪器制造有限公司；pH计(Seven Easy S20) 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；CR22G高速冷冻离心机 日本Hitach公司；ALPHA-4冷冻干燥机 德国Christ公司；PRO 250型精密组织匀浆器 美国PRO Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 原料处理

将干浒苔用密封式粉碎机粉碎，过80目筛，然后再进行超微粉碎(过1000目筛)，储存于广口瓶中备用。

1.3.2 蛋白质提取工艺流程

条浒苔→净化→干燥→粉碎(粗粉碎→超微粉碎)→超声波处理→提取→离心(10000r/min，15min)取上清液→调整pH值至等电点→离心取沉淀→冷冻干燥→条浒苔蛋白质

1.3.3 蛋白质测定及提取率、蛋白质纯度计算

原料及提取液蛋白质质量及总氮采用凯氏定氮法测定，参照GB 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》[15]的方法及仪器说明书进行，蛋白质换算系数取6.25，蛋白质提取率按式(1)计算、蛋白质纯度参照文献[16]，按式(2)计算。

(1)

(2)

1.3.4 单因素试验

各取2.00g条浒苔超微粉，加水40.0mL(即料液比为1:20(g/mL)制成匀浆，以蛋白质提取率为指标，考察pH值、温度、时间对提取率的影响以确定提取条件，每组做3个平行取平均值。

1.3.4.1 pH值对蛋白质提取率的影响

在料液比1:20、温度60℃、提取时间2h的条件下，考察pH6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0对提取率的影响。

1.3.4.2 温度对蛋白质提取率的影响

在料液比1:20、提取时间2h、pH11.0的条件下，考察30、40、50、60、70、80、90℃对提取率的影响。

1.3.4.3 时间对蛋白质提取率的影响

在料液1:20、温度60℃、pH11.0的条件下，考察提取2、3、4、5、6h对提取率的影响。

1.3.5 超声波辅助提取条件优化

称取一定质量的条浒苔超微粉20份，按料液比为1:20(g/mL)各加水制成需要体积的匀浆备用。超声波频率20kHz，变幅杆直径Φ6mm，变幅杆伸入液体深度为液体总高度的1/2处，设置温度不超过60℃(设备配有温度传感器)。以蛋白质提取率为指标，参考文献[17-18]及设备的功能，考察总时间、超声时间、间隙时间、功率、总体积5个因素对超声波辅助提取的影响，每因素取10个水平以确保试验范围涵盖最优条件，参照文献[19]采用U10(108)均匀设计表的使用表安排试验。超声波处理后再用单因素试验确定的提取条件进行提取，每组做2次重复试验，取平均值，采用DPS 7.02对试验结果进行二次多项式逐步回归分析，确定条浒苔蛋白质的超声波辅助提取最佳工艺参数。

1.3.6 条浒苔蛋白质的功能性质测定

参照文献[16,20]的方法并略有修改，测定条浒苔蛋白质的等电点、起泡性及泡沬稳定性、乳化能力及乳化稳定性、吸油性及溶解性等性质。

1.3.6.1 等电点pI的测定

分别量取20.0mL提取液，用稀酸(0.1mol/L盐酸)调节到不同的pH值(1.2、1.5、1.8、2.1、2.4、2.7、3.0、3.3、3.6、3.9、4.2、4.5、4.8)，静置2h，4000r/min离心10min，小心弃去上清液，离心管与沉淀于105℃干燥至衡质量。分别测定空离心管的质量和离心后离心管与沉淀的总质量，计算蛋白质质量，蛋白质质量最大的pH值即为浒苔蛋白质的等电点。

1.3.6.2 起泡性及泡沫稳定性

pH值的影响：配制质量浓度1mg/mL的条浒苔蛋白质溶液，分别调节pH值至1、3、5、7、9，取2.5mL于5mL的刻度试管中，然后用均质器均质(14000r/min，2min)，记下均质前液体的体积，均质后泡沫的体积及静置30min后下层析出液的体积，按式(3)计算起泡能力，按式(4)计算泡沬稳定性。

蛋白质质量浓度的影响：配制不同质量浓度的条浒苔蛋白质溶液，调整pH值至起泡性最好时的pH值，取2.5mL于5mL的刻度试管中，然后用均质器均质(14000r/min，2min)，记下均质前液体的体积，均质后泡沫的体积及静置30min后下层析出液的体积，按式(3)计算起泡能力，按式(4)计算泡沬稳定性。

(3)

(4)

1.3.6.3 乳化能力及乳化稳定性

称取不同质量的条浒苔蛋白质移入10mL离心管中，加入4.0mL水和4.0mL植物油，14000r/min均质5min，1500r/min离心5min，测量乳化层高度和30min后的乳化层高度，按式(5)和式(6)计算乳化能力及乳化稳定性。

(5)

(6)

1.3.6.4 吸油性

称取0.50g样品和6.0mL植物油加入到10mL离心管中，用玻璃棒搅拌2min后静置30min，3000r/min离心20min，弃去游离油，称质量，按式(7)计算吸油性。

(7)

1.3.6.5 温度对溶解性的影响

配制1mg/mL的浒苔蛋白质溶液，调节pH值至7.0，分别在不同温度(40、50、60、70、80℃)条件下水浴30min，3000r/min离心10min，测上清液的总氮质量，按式(8)计算氮溶指数。

(8)

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 pH值对条浒苔蛋白质提取率的影响

柱形图垂直上方标注的字母为多重比较结果(LSD法)，字母不同表示差异显著(α=0.05)，下同。

图 1 pH值对条浒苔蛋白质提取率的影响

Fig.1 Effect of pH on extraction rate of the protein from E. clathrata

pH值影响蛋白质之间以及蛋白质与溶剂间的相互作用，从而影响了蛋白质的溶解性。方差分析表明，pH值对蛋白质提取率有显著影响，由图1可知，随着pH值的增大，蛋白质在溶液中的溶解性也逐渐升高。考虑到当pH值超过11时，碱性条件下易导致蛋白质水解甚至氨基酸结构的改变，影响蛋白质的营养价值及功能性质[21]，所以，提取最佳pH值选择11。

2.1.2 温度对条浒苔蛋白质提取率的影响

图 2 温度对条浒苔蛋白质提取率的影响

Fig.2 Effect of temperature on extraction rate of the protein from E. clathrata

由图2可知，随着温度的升高，条浒苔蛋白质的提取率也随着升高，而当温度超过60℃时，提取率呈下降趋势，因此，条浒苔蛋白质的提取最佳温度为60℃。

2.1.3 提取时间对条浒苔蛋白质提取率的影响

图 3 提取时间对条浒苔蛋白质提取率的影响

Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of the protein from E. clathrata

由图3可知，随着提取时间的延长，蛋白质的提取率也随着增加。经方差分析发现时间因素影响显著，多重比较分析发现4h后，随着时间的延长，提取率并无显著差异，因此，为了保证提取效果，提取时间取5h，在此条件下提取率为27.05%。

2.2 超声波辅助提取均匀设计试验

表 1 U10(108)均匀设计试验方案及结果

Table 1 Scheme and results of U10(108) uniform design

注：超声波细胞破碎仪的总功率为950W，按仪器说明书实际工作输出功率以总功率的百分数设置。

采用DPS 7.02数据处理系统对表1试验结果进行二次多项式逐步回归分析，得回归方程：Y=59.611－0.696X3－1.326X4－0.0410X22＋0.0114X42＋0.0218X2X3＋0.00597X2X4＋0.0147X3X4＋0.00106X3X5。

模型相关系数R=1.000，F=23111.3903，显著水平P=0.0051，剩余标准差S=0.0203，调整后的相关系数Ra=1.000，决定系数R2=0.99999，说明该方程能很好地拟合条浒苔蛋白质的超声波辅助提取过程。对该模型各项进行显著性检验，结果见表2。

表2各变量显著性检验表明，模型中各项对响应值均有极显著影响。主效应中仅X3、X4对响应值有显著影响，而其他因素的交互项和平方项对响应值有显著性，表明对提取率的影响主要是因素之间的交互作用而并不是因素的主效应，如果用单因素试验法是很难得到一个较优方案的，所以均匀设计法是一种很好的寻优方法。

表 2 二次多项式逐步回归模型各项显著性分析

Table 2 Significance analysis of the quadratic polynomial regression using DPS

经DPS 7.02数据处理系统优化，最优条件为：X1=2.69，X2=11.00，X3=50.0，X4=66.0，X5=50.83，即超声波辅助提取的条件为超声时间2.7s、间隙时间11.0s、总时间50min、功率66%(即627.0W)、总体积50.8mL，在此条件下模型的预测值为49.55%，较表1中的提取率最高的第8组提高了14.86%。

2.3 验证实验

为了验证模型预测值的可靠性，称取2.54g条浒苔超微粉3份，各加入50.8mL水配成匀浆，按最优条件安排3次验证实验，3次实验的蛋白质提取率分别为48.67%、45.85%和47.56%，平均蛋白质提取率为(47.36±1.42)%。采用SPSS 13.0进行t检验，结果表明，实际提取率与模型预测值没有显著差异(P=0.116＞α=0.05)，因此，在最优超声波辅助提取条件下的实际提取率为41.64%～48.70%(95%置信度)，显著高于李剑玄等[1]用正交试验法优化的条浒苔蛋白质的提取率(39.47%，P=0.011＜α=0.05)，因此，均匀设计是一种很有效的优化方法。在此条件下制备的蛋白质纯度可达(92.3±1.5)%。

2.4 超声波辅助抽提法与传统热水提取法的比较

超声波辅助提取法和传统热水提取法的蛋白质提取率分别为(47.36±1.42)%和(27.05±0.47)%。t检验表明，超声波辅助提取法能极显著(P=0.003＜α=0.01)提高条浒苔蛋白质的提取率，说明超声波在条浒苔蛋白质的提取时有明显的促进蛋白质溶出的效果，是一种有效的物理辅助提取方式。蛋白质提取效率提高的原因可能主要在于超声波的热作用、机械作用和空化作用的综合效应。超声波空化可以产生微冲流，能有效地打破边界层，使扩散速度增加，使萃取或浸出速度提高。超声波促使分子的机械运动有利于使有效成分转移，并充分和溶剂混合，从而提高提取效果。

2.5 条浒苔蛋白质功能特性

2.5.1 条浒苔蛋白质的等电点

图 4 pH值与浒苔蛋白质沉淀质量的关系

Fig.4 Relationship between pH and precipitation of the protein from

E. clathrata

由图4可见，纯度为92.3%的浒苔蛋白质的等电点(pI)为3.0，根据等电点可以确定酸沉的最佳条件。

2.5.2 起泡性及泡沫稳定性

影响蛋白质起泡性除了蛋白质的分子性质外，还有pH值、盐、蛋白质质量浓度、温度等环境因素。本实验考察了pH值和蛋白质质量浓度对条浒苔蛋白质起泡能力及泡沬稳定性的影响，结果见图5。

图 5 pH值(a)和蛋白质质量浓度(b)与条浒苔蛋白质泡沫性质的关系

Fig.5 Correlation of pH and concentration with foaming properties of the protein from E. clathrata

由图5a可知，pH7.0时起泡性最好，偏离该pH值可使起泡能力大幅度降低，泡沫稳定性也受pH值显著影响，pH3泡沫稳定性最好，偏离该pH值也可使泡沬定性大幅度降低。这可能是由于pH3.0处于条浒苔蛋白质的等电点，虽然有利于泡沬的稳定，但由于蛋白质的溶解度较低而不利于泡沬的形成[21]，而pH7.0时，蛋白质有较好的溶解性，表面的亲水-疏水小区的分布也有利于蛋白质迁移至界面，但不利于蛋白质之间形成黏弹性的膜，因此，在此pH值条件下虽然起泡性很高，但泡沬稳定性却很差。图5b显示，起泡能力随着蛋白质质量浓度增大而提高，而泡沬稳定性则在2mg/mL时最好，超过2mg/mL起泡性呈下降趋势，可能是由于蛋白质质量浓度过高，扩散速度快，拉伸形成的新界面能迅速得到蛋白质的覆盖，减弱泡沫粗化，泡沬稳定性降低[22]。

2.5.3 乳化性及乳化稳定性

图 6 条浒苔蛋白质质量浓度与乳化性质的关系

Fig.6 Correlation of concentration with emulsifying properties of the protein from E. clathrata

乳化能力是衡量蛋白质促进油-水型乳状液形成能力的指标，乳化稳定性是指维持乳状液稳定存在的能力[20]。蛋白质具有乳化剂的特征结构，即两亲结构，在蛋白质分子中同时含有亲水基团和亲油基团[23]，因此，蛋白质是一种表面活性剂，它能降低水和油的表面张力，使之易于乳化；另一方面，蛋白质分散在非连续相和连续相之间的界面上，阻止非连续相的聚积，起到稳定乳状液的作用[20]。由图6可知，条浒苔蛋白质的乳化能力随着质量浓度升高而增加，达到4mg/mL时趋于平缓。乳化稳定性在蛋白质质量浓度大于2mg/mL时变化不大，条浒苔蛋白质乳化性随质量浓度变化的趋势说明界面膜的厚度随着浒苔蛋白质的质量浓度增大而增加，膜的强度也随着提高，增加了乳化性。

2.5.4 吸油性

蛋白质的吸油性表现在促进脂肪吸收作用和控制脂肪吸收作用2个方面[24]，在实际应用中具有重要意义。吸油性与蛋白质的种类、油脂种类、温度及加工条件等因素有关。选用市售大豆油测定浒苔蛋白质的吸油性，其吸油性为131.6%。与榛子蛋白[16]相比条浒苔蛋白质具有较好的吸油性，这一性质可能为其在肉类食品中应用奠定一定的基础。

2.5.5 溶解性

蛋白质的溶解性受pH值、温度、离子强度及有机溶剂的影响。由图7可知，在40～60℃范围内条浒苔蛋白质的溶解性随温度的升高而增大，高于60℃溶解性开始下降，由此可见，60℃是条浒苔蛋白质开始变性的临界温度。

图 7 温度对条浒苔蛋白质溶解性的影响

Fig.7 Effect of temperature on the solubility of the protein from Enteromorpha clathrata

3 结 论

3.1 在碱性条件下有利于条浒苔蛋白质的提取，提取条件为料液比1:20、pH11、温度60℃、时间5h。

3.2 均匀设计优化得到的最优超声波辅助提取工艺条件为料液比1:20、超声时间2.7s、间隙时间11.0s、总时间50min、功率627.0W、总体积50.8mL，超声波处理后调整pH值至11、温度60℃、提取时间5h，在此条件下蛋白质的实际提取率为41.64%～48.70%。

3.3 蛋白质性质测定结果表明，条浒苔蛋白质的等电点pI3.0；pH7.0时起泡性最好，而pH3.0时泡沫稳定性最好，质量浓度为2mg/mL时泡沬稳定性最好；质量浓度为4g/mL时乳化能力最大，2mg/mL时乳化稳定性最好；条浒苔蛋白质的吸油性为131.6%，60℃时溶解性最好。

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