超声波辅助提取茶粕多糖及其抗氧化活性

张丽美,杨婷婷,胡蒋宁,刘志刚,邓泽元*

(南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室,江西 南昌 330047)

 

要:采用超声波辅助提取油茶饼粕中的茶籽多糖。在单因素试验的基础上,利用正交试验优化提取条件,然后采用苯酚-硫酸法测定总糖含量,PMP柱前衍生HPLC法测定单糖组成,并对其抗氧化活性进行研究。结果表明,茶籽多糖最佳提取工艺条件为超声功率150W、提取温度80℃、提取时间45min、料液比1:15(g/mL),在此条件下茶粕多糖的得率为(14.22±0.51)%。茶粕多糖主要由葡萄糖、鼠李糖以及甘露糖组成,同时还含有少量半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖及木糖,其总糖含量约为81.2%。抗氧化实验表明,茶粕多糖清除•OH及DPPH自由基的能力与质量浓度呈正相关。当茶粕多糖质量浓度为5mg/mL时,对•OH及DPPH自由基的清除率分别达到84.6%和73.5%;但其几乎没有还原能力。

关键词:茶粕多糖;超声波提取;正交试验;单糖组成;抗氧化活性

 

Ultrasonic-Assisted Extraction and Antioxidant Activity of Polysaccharides from Seed Cake of Camellia oleifera Abel

 

ZHANG Li-mei,YANG Ting-ting,HU Jiang-ning,LIU Zhi-gang,DENG Ze-yuan*

(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

 

Abstract:The ultrasonic-assisted extraction of polysaccharides from seed cake of Camellia oleifera Abel was investigated. An orthogonal array design was used to establish the optimum extraction conditions. Total sugar content was determined by phenol-sulfuric acid method and monosaccharide composition was analyzed by HPLC following pre-column derivatization. Besides, the antioxidant activity of polysaccharides from seed cake of Camellia oleifera Abel was assessed. The results showed that the optimum extraction conditions of ultrasonic output power, temperature, time and solid-to-solvent ratio were 150 W, 80 ℃, 45 min and 1:15 (g/mL), respectively. Under these conditions, the extraction yield of polysaccharides was (14.22 ± 0.51)%. The extracted polysaccharides consisted mostly of glucose Glu, Rha and Man along with a small amount of GalUA, Gal, Xyl andAra and showed a total sugar content of 81.2%. Antioxidant experiments showed that the free radical scavenging activity of the polysaccharides against hydroxyl and DPPH radicals was concentration dependent, with scavenging rates of 84.6% and 73.5% at 5 mg/mL, respectively. Nevertheless, almost no reducing power activity was observed.

Key words:polysaccharides from seed cake of Camellia oleifera Abel;ultrasonic-assisted extraction;orthogonal array design;monosaccharide composition;antioxidant activity

中图分类号:TS222.1 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2013)18-0036-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201318008

油茶(Camellia oleifera)属山茶科植物,是我国特有的木本食用油料树种。据统计,我国油茶栽培面积约为500万公顷,年产油茶籽90余万t,榨油后的茶粕约为60万t[1]。茶粕中含有大量的蛋白质、茶皂素、粗纤维、多糖等,它们是化工、轻工、食品、饲料等领域的重要原料[2]。因此我国潜在的可利用茶粕资源十分丰富。

多糖是由十个以上乃至几十个单糖通过糖苷键相连形成的线性或支链的高聚物,是所有生命有机体的重要组成部分,同维持生物机能密切相关。多糖具有多方面的生理活性,如降血压、降血脂、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗炎、免疫调节等。由于多糖所具有的多种生物活性功能及其在临床上的广泛应用,多糖已成为近年来的研究热点[3-4]。相关研究表明,茶籽多糖具有抗血栓、降血糖、抑制K562(人体白血病细胞)增长,促进淋巴细胞增殖的作用,此外还可能有修复糖代谢紊乱的功能[5-6]。茶籽多糖作为一种重要的活性多糖,必将成为人们研究的热点[7]。但近几年来,关于茶多糖的研究主要以茶叶多糖为主,而对油茶饼粕多糖的研究仍然甚少。因此,从油茶饼粕中提取多糖,并对其进行研究,不仅能提高茶粕的利用率,更有望为人们开发一种新的功能性成分。

本研究采用超声波辅助提取油茶籽茶粕多糖,对其提取工艺条件进行优化,并对所提多糖纯度、单糖组成及其•OH清除能力、DPPH自由基清除能力及还原能力进行研究,以期为茶粕多糖的利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

油茶饼粕:将山茶籽经本实验室方法提取茶籽油以及茶皂素后所得。

葡萄糖、菲洛嗪、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、三氟乙酸等试剂(均为分析纯);乙腈(色谱纯)、1,1-二苯基苦酰基苯肼(DPPH) 美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

SK3310HP超声波清洗器 上海科导超声仪器有限公司;TDL-5-A飞鸽牌台式离心机 上海安亭科学仪器厂制造;722G紫外-可见分光光度计 上海精科仪器有限公司;HH-S11电热恒温水浴锅 巩义市英峪予华仪器厂;1100高效液相色谱仪(配有四元泵、紫外检测器和 1100色谱工作站) 美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 茶粕多糖的超声波辅助提取[8-10]

称取一定量经本实验室方法提油及脱茶皂素后的油茶籽粕,按一定料液比加蒸馏水搅拌后,放入超声波清洗器内按实验设计工艺提取,离心取上清液,加入三氯乙酸至其最终质量浓度为5g/100mL,静置12h后离心取上清液,加入4倍体积分数为95%的乙醇,于-4℃冰箱静置过夜后离心,所得沉淀物即为茶粕粗多糖。

1.3.2 单因素试验

以0.5g茶粕作为提取对象,通过前期试验摸索,确定多糖初始提取工艺参数为:料液比1:10、超声功率180W、提取温度70℃、提取时间45min。按1.3.1节中方法进行多糖提取。实验过程中,固定其他3个因素,分别考察料液比、超声功率、提取温度、提取时间对茶粕多糖得率的影响。

1.3.3 正交试验

表 1 正交试验因素水平表

Table 1 Coded levels for independent variables used in

orthogonal array design

水平

因素

A料液比(g/mL)

B提取时间/min

C超声功率/W

D提取温度/℃

1

1:5

30

120

60

2

1:10

45

150

70

3

1:15

60

180

80

 

 

在单因素试验的基础上,选择影响较显著的因素,利用L9(34)正交试验对提取工艺做进一步优化,试验方案见表1。

1.3.4 茶粕多糖含量的测定

苯酚-硫酸法检测[11]:将上述多糖沉淀物加蒸馏水溶解后定容至100mL,取0.2mL于具塞试管中,补加蒸馏水至2.0mL,然后加入质量浓度为6mg/mL的苯酚溶液1.0mL,再加入浓硫酸5mL,摇匀后沸水浴显色15min,冷却后于490nm波长处测吸光度。同时用2.0mL蒸馏水按上述操作做空白实验。根据标准曲线计算得到样品溶液中茶粕多糖的含量,并根据式(1)计算多糖得率。所得葡萄糖标准曲线方程为:y=0.826x+0.015,R2=0.999。

404101.jpg (1)

1.3.5 茶粕多糖的鉴定

1.3.5.1 总糖含量测定

将按1.3.1节方法提取的多糖沉淀物溶于蒸馏水后采用Sevag法反复脱蛋白5次,再用95%乙醇沉淀,沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤,再用蒸馏水透析48h,冷冻干燥。取0.1g定容至100mL,按1.3.4节的方法测定多糖含量,见式(2)

404114.jpg (2)

1.3.5.2 单糖及糖醛酸鉴定

采用PMP柱前衍生化HPLC法[12-13]检测茶粕多糖的单糖及糖醛酸组成。准确称取20mg粗多糖,加入2mL 4mol/L三氟乙酸(TFA)于110℃烘箱中水解4h,真空干燥后加入甲醇并用氮气吹干,重复操作2~3次以除去多余的TFA,然后向水解管中加入200µL蒸馏水溶解。

取单糖、糖醛酸标准品及水解后的茶粕多糖样品200µL,分别加入200µL 0.5mol/L PMP甲醇溶液及0.3mol/L氢氧化钠溶液,然后置于70℃恒温水浴中反应70min。取出后冷却至室温,加入0.3mol/L盐酸中和后补水至1mL,再加入2mL三氯甲烷反复萃取3次,将得到的水相过0.22µm的滤膜后进行HPLC分析。

色谱条件:大连依利特C18柱(150mm×4.6mm,5µm);流动相:20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH6.72)-乙腈(82:18,V/V)溶液;柱温:30℃;检测波长:250nm;流速:0.5mL/min;进样体积:10µL。

1.3.6 茶粕多糖的体外抗氧化活性测定

1.3.6.1 清除羟自由基(•OH)活性测定[14]

精确称取1.3.5.1节粗多糖和VC,分别用适量的蒸馏水溶解,配制成质量浓度为5mg/mL的储备液。分别取多糖及VC储备液稀释成质量浓度为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg/mL的溶液,待测。

测定方法:在反应体系中分别加入0.5mL 0.75mmol/L邻二氮菲,1.0mL 0.15mol/L PBS缓冲液(pH7.4),0.5mL不同质量浓度的粗多糖溶液,充分混匀后加入0.5mL 0.75mmol/L 硫酸亚铁,混匀后再加入0.5mL 0.01%的过氧化氢,混匀后于37℃水浴30min,取出冷却至室温,在536nm波长处测定吸光度,以VC作为阳性对照,按式(3)计算样品对•OH的清除率。

404127.jpg (3)

式中:A0为以水代替过氧化氢及样品溶液的吸光度;A1为以水代替样品溶液的吸光度;A2为加入样品溶液反应后的吸光度。

1.3.6.2 清除DPPH自由基活性测定[15]

取1mL不同质量浓度的样品溶液,加入1mL蒸馏水,再加入2mL 2×10-4mol/L DPPH溶液(无水乙醇配制),摇匀后于25℃水浴30min,在517nm波长处测定其吸光度。以水代替样品溶液、无水乙醇代替DPPH作空白实验调零,按式(4)计算样品对DPPH自由基的清除率。

404140.jpg (4)

式中:A0为以无水乙醇代替样品溶液及蒸馏水的吸光度;A1为样品溶液的吸光度;A2为以无水乙醇代替DPPH的吸光度。

1.3.6.3 还原能力测定[16]

取2.5mL不同质量浓度的样品溶液,分别加入0.2mol/L PBS缓冲液(pH6.6)和1g/100mL的铁氰化钾溶液各2.5mL,充分混匀后,50℃水浴20min,再加入2.5mL 10g/100mL的三氯乙酸溶液,混匀后于3000r/min离心10min,取2.5mL上清液,加入2.5mL蒸馏水和0.5mL 0.1g/100mL的三氯化铁溶液,于700nm波长处测定吸光度,吸光度越大表明还原能力越强。以蒸馏水代替样品溶液做空白实验调零。VC作为阳性对照。

2 结果与分析

2.1 茶粕多糖提取单因素试验

2.1.1 料液比对多糖得率的影响

由图1可知,料液比在1:5~1:10(g/mL)范围内,多糖提取得率随着提取液用量的增加而升高,提取液用量继续增大,多糖得率基本上趋于稳定。原因可能是提取液用量过少时,多糖提取不充分,而当料液比达到一定范围后,传质作用力达到平衡致使多糖能被充分提取出来。考虑到提取液用量过大,会延长浓缩耗时,增加能耗,因此料液比应选择1:10左右为宜。

404175.jpg 

图 1 料液比对茶粕多糖得率的影响

Fig.1 Effect of solid-to-solvent ratio on the yield of polysaccharides

2.1.2 提取时间对多糖得率的影响

404190.jpg 

图 2 提取时间对茶粕多糖得率的影响

Fig.2 Effect of extraction time on the yield of polysaccharides

由图2可知,在15~45min范围内,多糖得率随着提取时间的增加急剧上升,并且在45min时达到最大值,此后延长提取时间,多糖得率略微下浮。原因可能是因为长时间的机械剪切作用,致使部分多糖降解。因此选择提取时间为45min左右为宜。

2.1.3 提取温度对多糖得率的影响

404203.jpg 

图 3 提取温度对茶粕多糖得率的影响

Fig.3 Effect of extraction temperature on the yield of polysaccharides

由图3可知,在50~70℃范围内,多糖得率随着提取时间的延长急剧上升,此后升高提取温度,多糖得率增加缓慢,因此从能耗及经济角度考虑,选择提取温度为70℃左右为宜。

2.1.4 超声功率对多糖得率的影响

由图4可知,在60~150W超声功率变化范围内,多糖得率随着超声功率的增大而上升,此后增大超声功率,多糖得率略有减少,这可能是因为超声功率提高时,传质作用力增强,因而能够增大多糖溶解度。而功率过大时,强烈的振动作用又会导致部分多糖降解,因此选择超声功率为150W左右为宜。

404239.jpg 

图 4 超声功率对茶粕多糖得率的影响

Fig.4 Effect of ultrasonic output power on the yield of polysaccharides

2.2 最佳工艺条件的确定

正交试验结果见表2,显著性检验见表3。

表 2 正交试验设计及结果

Table 2 Orthogonal array design and results

试验号

A

B

C

D

多糖得率/%

1

1

1

1

1

3.30

2

1

2

2

2

7.72

3

1

3

3

3

8.41

4

2

1

1

3

11.92

5

2

2

3

1

4.55

6

2

3

2

2

9.14

7

3

1

3

2

7.84

8

3

2

1

3

13.24

9

3

3

2

1

7.18

k1

6.477

7.687

8.560

5.010

 

k2

8.537

8.503

8.940

8.233

 

k3

9.420

8.243

6.933

11.190

 

R

2.943

0.816

2.007

6.180

 

 

 

表 3 正交试验结果方差分析

Table 3 Analysis of variance for the experimental results of

orthogonal array design

因素

偏差平方和

自由度

F比

显著性

料液比

14.433

2

0.668

 

提取时间

0.330

2

0.015

 

超声功率

3.346

2

0.155

 

提取温度

68.357

2

3.162

*

误差

86.47

8

 

 

 

注:F0.1=3.110;*.差异显著(P<0.05)。

 

由表3极差分析可知,影响茶粕多糖得率的各因素大小为D(提取温度)>A(料液比)>C(超声功率)>B(提取时间)。比较k值大小可知,最佳提取工艺条件为A3B2C2D3,即料液比1:15(g/mL)、提取时间45min、超声功率150W、提取温度80℃。由表3方差分析可知,在考察范围内提取温度对于茶粕多糖的提取具有显著性差异,而料液比、超声功率及提取时间在考察范围内无显著差异。

2.3 验证实验

由于上述最佳工艺条件在正交试验的9次试验中并没有出现,因此对试验得到的最佳工艺条件进行3次验证实验,得到茶粕多糖的平均得率为(14.22±0.51)%。因此,通过正交试验优化的多糖提取工艺参数准确可靠。试验表明,采用超声波辅助提取茶粕多糖不仅能够提高提取效率,降低成本,而且该工艺产率高,重复性好,能够为茶粕多糖的开发及利用提供理论基础和技术保障。

2.4 茶粕多糖的鉴定

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404266.jpg 

1~8依次为甘露糖(Man)、鼠李糖(Rha)、葡萄糖醛酸(GlcUA)、半乳糖醛酸(GalUA)、葡萄糖(Glu)、半乳糖(Gal)、木糖(Xyl)、阿拉伯糖(Ara)。

图 5 混合单糖标准对照品(A)和茶粕多糖(B)的PMP衍生物液相色谱图

Fig.5 HPLC chromatograms of PMP derivatives mixed standards of monosaccharides and polysaccharides from seed cake of Camellia oleifera Abel

由图5可知,茶粕多糖主要含有葡萄糖、鼠李糖以及甘露糖,此外,还含有少量的半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖以及木糖,其峰面积比约为Glu:Rha:Man:GalUA: Gal:Xyl:Ara=1.0:0.40:0.28:0.09:0.17:0.10:0.07,总糖含量约为81.2%。

2.5 体外抗氧化活性实验

2.5.1 茶粕多糖清除•OH活性

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图 6 茶粕多糖对OH的清除能力

Fig.6 Scavening effect of polysaccharides from seed cake of

Camellia oleifera Abel

如图6所示,在质量浓度范围内,OH的清除能力随着茶粕多糖质量浓度的增加而增强。当茶粕多糖质量浓度为5mg/mL时,OH的清除率达到84.6%。但与VC相比,其OH清除能力较弱。当VC质量浓度为1mg/mL时,对OH的清除率达到96.0%,而等质量浓度的茶粕多糖对OH的清除率仅为22.2%。

2.5.2 茶粕多糖清除DPPH自由基活性

404292.jpg 

图 7 茶粕多糖对DPPH自由基的清除能力

Fig.7 DPPH radical scavenging effect of polysaccharides from

seed cake of Camellia oleifera Abel

如图7所示,在实验质量浓度范围内,随着茶粕多糖质量浓度的增加,DPPH自由基的清除能力增强。当茶粕多糖质量浓度为5mg/mL时,DPPH自由基的清除率达到73.5%。但与VC相比,其DPPH自由基清除能力较弱。当VC质量浓度为1mg/mL时,DPPH自由基的清除率达到98.9%,而等质量浓度的茶粕多糖对DPPH自由基的清除率仅为13.7%。

2.5.3 茶粕多糖还原能力

404305.jpg 

图 8 茶粕多糖还原能力

Fig.8 Reducing power of polysaccharide from seed cake of

Camellia oleifera Abel

如图8所示,在实验质量浓度范围内,增大茶粕多糖质量浓度其还原能力无明显变化。当VC质量浓度为1mg/mL时,其吸光度为2.52,而茶粕多糖质量浓度为5mg/mL时,吸光度仅为0.26。这说明茶粕多糖几乎没有还原能力。

3 结 论

3.1 采用超声波辅助提取茶粕多糖,考察料液比、提取时间、提取温度以及超声功率对茶粕多糖得率的影响。正交试验确定的最佳提取工艺条件为:料液比1:15(g/mL)、提取时间45min、超声功率150W、提取温度80℃,在此条件下茶粕多糖的得率为(14.22±0.51)%。

3.2 PMP柱前衍生化HPLC法测定结果显示,茶粕多糖主要含有葡萄糖、鼠李糖以及甘露糖,此外,还有少量半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖及木糖,其峰面积比约1.0:0.40:0.28:0.09:0.17:0.07:0.10,总糖含量约为81.2%。

3.3 体外抗氧化活性实验表明,茶粕多糖具有一定的清除•OH及DPPH自由基的能力,并且其抗氧化活性与质量浓度呈正相关。当多糖质量浓度为5mg/mL时,对•OH的清除率为84.6%,对DPPH自由基的清除率为73.5%;但其几乎没有还原能力。

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收稿日期:2012-07-12

基金项目:江西省科技重大专项(赣科发[2010]J217)

作者简介:张丽美(1987—),女,硕士研究生,主要从事天然产物研究。E-mail:zhanglimei1987@yahoo.cn

*通信作者:邓泽元(1963—),男,教授,博士,主要从事天然产物及油脂研究。E-mail:dengzy28@yahoo.com.cn