单宁酶对刺梨果汁单宁的脱除作用

罗 昱，梁 芳，李小鑫，丁筑红*

(贵州大学生命科学学院，贵州省农畜产品贮藏与加工重点实验室，贵州 贵阳 550025)

摘 要：以刺梨果汁为原料，探讨单宁酶对刺梨果汁中单宁的脱除效果，通过单因素试验及正交试验确定的最佳脱除条件。结果表明：单宁酶添加量0.12%、pH4.5、脱除温度45℃、脱除时间100min，在此条件下单宁脱除率达到76.07%，均高于明胶法和羧甲基壳聚糖法的脱除率，且单宁酶对刺梨果汁中的营养物质影响不大，但对刺梨果汁混浊度无明显影响。

关键词：单宁酶；刺梨果汁；单宁；脱除

Application of Tannase for the Removal of Tannin from Roxburgh rose Juice

LUO Yu，LIANG Fang，LI Xiao-xin，DING Zhu-hong*

(Key Laboratory of Agricultural and Animal Products Store and Processing of Guizhou Province,

College of Life Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China)

Abstract：This paper reports on the application of tannase for the removal of tannion from Roxbugh rose juice. The optimum removal conditions, as determined using one-factor-at-a-time and orthogonal array designs, were 100 min of treatment at pH 4.5 with an enzyme dosage of 0.12% at 45 ℃. Tannion was successfully removed from Roxbugh rose juice with a removal efficiency of 76.07% under these conditions, while lower removal efficiencies were obtained with treatment with gelatin or carboxymethyl chitosan. The enzymatic treatment had minor effects on nutrients in Roxbugh rose juice but had no obvious impact on the turbidity.

Key words：tannase；Roxburgh rose juice；tannin；removal

中图分类号：Q949.751.8 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)18-0041-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201318009

刺梨(Roxburgh rose)为蔷薇科多年生落叶灌木，是一种极具开发价值的野生植物资源。刺梨果中具有独特的芳香味，含有丰富的营养物质，特别是含有丰富的VC、黄酮和SOD等营养功效成分，素有“三王水果”之称[1-2]，具有防癌、抗衰老等作用[3]。刺梨果实芳香浓郁，但单宁等多酚物质含量较高，一般含量在0.6%～2.2%[4]，因而涩味重，过高的单宁含量对果汁产品稳定性、澄清度、风味、色泽等产生不利影响[4-6]，商品价值降低，因此，脱除单宁是解决刺梨果汁产品口感及变色的有效措施。

常用的去除单宁方法包括物理法、化学法及生物法。刺梨果汁单宁脱除方法中，广泛采用化学方法，利用明胶、羧甲基壳聚糖和聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)脱除单宁[7-8]；而生物方法主要是利用果胶酶和单宁酶的作用来去除单宁[9-10]，有报道[11-12]单宁酶可用于茶澄清和预防葡萄酒中沉积物，并且能有效脱除樱桃李汁中的单宁物质。本研究采用单宁酶生物法对刺梨果汁中单宁成分含量影响，探讨单宁酶脱除刺梨果汁中单宁的最佳工艺条件及其对刺梨果汁品质的影响，为刺梨果汁品质提升提供有效的技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

刺梨，本地人工种植果，充分成熟，新鲜无霉烂变质。

单宁酶(食品级，酶比活力500U/g) 南宁东恒华道生物科技有限责任公司。

1.2 仪器与设备

JJ-2组织捣碎匀浆机 常州澳华仪器有限公司；TU-1810紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；数显恒温水浴锅 上海梅香仪器有限公司；PHS-3C精密pH计 上海虹益仪器仪表有限公司；958-10L型真空包装机 欧创包装机械(武汉)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 刺梨汁制备

将新鲜刺梨挑选后清洗滤干水分，破碎压榨取汁，待用。

1.3.2 单因素试验

1.3.2.1 单宁酶添加量对刺梨果汁单宁成分的影响

分别取50mL刺梨汁，添加不同体积的质量分数10%的单宁酶溶液，在pH4.5、40℃条件下进行水解，处理60min后，测定刺梨果汁中单宁含量。

1.3.2.2 酶作用pH值对单宁成分的影响

取50mL刺梨汁，添加0.5mL质量分数10%的单宁酶溶液，用柠檬酸调至不同pH值，分别在40℃条件下进行水解，处理60min后，测定刺梨果汁中单宁含量。

1.3.2.3 脱除温度对单宁成分的影响

取50mL刺梨汁，添加0.5mL质量分数10%的单宁酶溶液，分别在不同温度、pH4.5的条件下进行水解，处理60min后，测定刺梨果汁中的单宁含量。

1.3.2.4 脱除时间对单宁成分的影响

取50mL刺梨汁，添加0.5mL质量分数10%的单宁酶溶液，在pH4.5、40℃条件下，分别脱除不同时间后，测定果汁中单宁含量。

1.3.3 正交试验

根据单因素试验的结果，对单宁酶用量(A)、酶作用pH值(B)、脱除温度(C)和脱除时间(D)4个因素各取3个水平，选用L9(34)正交试验确定总单宁最佳酶解工艺条件。

1.3.4 分析方法

总单宁的测定：采用普鲁士兰法[13]；缩合单宁的测定：采用香草醛-盐酸法[14]；还原型VC：采用2,6-二氯靛酚法[15]；黄酮：采用分光光度法[16]；可滴定酸：采用酸碱滴定法[17]；可溶性固形物：用手持测糖折光仪测定；SOD：采用邻苯三酚自氧化速率法[18]；透光率：采用分光光度法，以550nm波长处的透光率(T)/%值表示，透光率(T)=1/10A，其中A为该波长处的吸光度。

1.4 统计分析

利用SPSS软件，采用Duncan’s新复极差法对各项指标进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 单宁酶添加量对刺梨果汁单宁含量的影响

果蔬中总单宁由水解单宁和缩合单宁两类组成，水解单宁含量为总单宁含量与缩合单宁含量之差[9]。由图1可见，单宁酶可以有效地降低刺梨果汁中单宁的含量，随着单宁酶添加量的增加，单宁含量逐渐下降，其中单宁酶对总单宁的作用有极显著性差异(P＜0.01)，而对缩合单宁的影响效果不明显(P＞0.05)。当单宁酶添加量为0.1g/100mL时，单宁含量达到最低值，其中总单宁、缩合单宁含量分别为0.294、0.077g/100mL，脱除率分别为71.54%、22.22%。刺梨果汁中缩合单宁含量较少，因而果汁中单宁主要为水解单宁，水解单宁是由没食子酸及其衍生物与葡萄糖或多酚通过酯键形成的化合物，可与唾液蛋白结合，使口腔感觉到涩味，且易被氧化产生红色物质[19]，对果汁产品感官品质产生不良影响；而缩合单宁是以黄烷-3-醇为基本单元的缩合物，具有较强的抗氧化性和酶抑制性，还可消除自由基，具有一定的功能特性[20-21]。可见，酶法可有效脱除果汁中不利的水解单宁组分，对缩合单宁影响较小。

图 1 单宁酶添加量对刺梨汁中单宁含量的影响

Fig.1 Effect of tannase dosage on tannin content of R. rose juice

2.1.2 单宁酶作用pH值对单宁含量的影响

图 2 单宁酶作用pH值对刺梨汁中单宁含量的影响

Fig.2 Effect of reaction pH on tannin content of R. rose juice

由于pH值影响单宁酶的活性，且单宁酶的最适pH值为4.0～6.0[22]，由图2可知，刺梨汁的pH值对单宁脱除有很大的影响，刺梨汁单宁含量随着单宁酶作用pH值的增加呈先减少后增加的趋势，当pH值为5时，单宁酶对刺梨汁中单宁物质的降解效果达到最佳，但刺梨汁的pH值为4.5，与该最佳值接近，此时总单宁含量、缩合单宁含量分别为0.290、0.075g/100mL，脱除率分别为69.13%、21.64%。

2.1.3 脱除温度对单宁含量的影响

温度对单宁酶的活性有影响，且单宁酶的最适温度为35～60℃[22]，由图3可知，温度对果汁中单宁含量影响很大，随着单宁酶脱除温度的升高刺梨汁中单宁含量呈先减少后增加的趋势，当温度为40℃时，刺梨汁的总单宁、缩合单宁和水解单宁达到最小值，表明脱除温度过高或过低均不利于单宁酶脱单宁效果的发挥，此时总单宁、缩合单宁含量分别为0.293、0.074g/100mL，脱除率分别72.79%、21.07%。

图 3 单宁酶脱除温度对单宁含量的影响

Fig.3 Effect of reaction temperature on tannin content of R. rose juice

2.1.4 单宁酶脱除时间对单宁含量的影响

图 4 单宁酶脱除时间对刺梨汁中单宁含量的影响

Fig.4 Effect of reaction time on tannin content of R. rose juice

从图4可以看出，刺梨汁的单宁含量随着单宁酶的酶解时间延长而增大，当脱除时间达到100min时，刺梨汁中单宁含量达到最低值，总单宁含量为0.270g/100mL，缩合单宁含量为0.080g/100mL，脱除率分别为74.79%、16.96%。

2.2 正交试验结果分析

根据单因素试验的结果，采用L9(34)正交试验表对单宁酶脱除刺梨汁中总单宁的条件进一步优化，正交试验设计及结果见表1。

由表1可看出，A3B1C3D2工艺条件下单宁脱除率最高，极差分析R值可知，影响单宁酶对总单宁脱除效果的主次因素依次为A＞C＞B＞D，即单宁酶用量对单宁脱除率影响最大，其次是脱除温度和果汁pH值，脱除时间影响最小。从k值分析得每个因素的各个水平间大小关系为A3＞A2＞A1，B1＞B3＞B2，C3＞C2＞C1，D2＞D3＞D1，确定各因素的最优组合为：A3B1C3D2。分析结果也显示，4种因素对刺梨果汁单宁脱除率的影响趋势与单因素试验结果所示趋势相同。

表 1 单宁酶脱除刺梨汁中总单宁正交试验设计及结果

Table 1 Orthogonal array design and results for the optimization of tannion removal with tannase

表 2 方差分析结果

Table 2 Analysis of variance for the experimental results of

orthogonal array design

注：*.差异显著。

由表2方差分析可知，A因素对指标的影响在a=0.05条件下达到显著水平，是影响刺梨果汁单宁脱除率的主要因素，而pH值和脱除温度的影响较小，脱除时间对单宁脱除率影响最小，正交试验确定单宁最佳脱除条件为：A3B1C3D2，即单宁酶用量0.12%、酶作用pH4.5、温度45℃、脱除时间100min时，此时脱除后总单宁含量为0.233g/100mL，脱除率为76.07%。

2.3 不同单宁脱除方法比较

刺梨果汁采用2.2节条件处理，与采用明胶法(添加量0.5%、静置时间100min、pH值3.5、温度10℃、搅拌时间7min)和羧甲基壳聚糖法(添加量0.25%、搅拌时间10min、温度15℃、pH4、脱除时间24h)[23]处理的果汁进行比较。分析不同单宁脱除法对刺梨果汁品质的影响。

图 5 不同方法的单宁脱除率

Fig.5 Removal efficiencies of tannin with different reagents

由图5可知，单宁酶对刺梨果汁总单宁的脱除率高于明胶和羧甲基壳聚糖两种方法，而缩合单宁的脱除率则较另外两种方法低，各组处理对总单宁脱除率无显著性差异(P＞0.05)，对缩合单宁有显著性变化(P＜0.05)。

单宁酶法总单宁脱除率为76.07%，高于明胶和羧甲基壳聚糖方法的56.52%和56.86%，可能由于单宁酶法的脱除属于酶解过程，具有高效专一的优点，能更好地脱除刺梨果汁中单宁成分，对于缩合单宁的脱除率，单宁酶法的脱除率为25.80%，远远低于明胶和羧甲基壳聚糖两种方法的42.26%和41.33%，可能是因为缩合单宁是黄烷-3-醇为基本结构的缩合物，与单宁酶反应形成缩合大分子物，在脱除过程中把未脱除的缩合单宁包埋，导致缩合单宁的脱除率较低。

表 3 不同脱除方法处理前后刺梨汁中主要成分分析

Table 3 Major components of R. rose juice after tannion removal with different reagents

由表3可知，经单宁酶处理后的刺梨果汁中还原型VC的保存率为72.13%，损失的原因可能是酶解过程中处理温度及时间条件导致，在单宁酶处理后能够较好地保存刺梨汁中黄酮，减少贮藏过程中可滴定酸和可溶性固形物的损失，对SOD活力的影响不大，黄酮的保存率为96.42%，可滴定酸和可溶性固形物的含量基本稳定，这与杨亚力等[24]在滇橄榄果酶法加工中得到的结果相近。单宁酶对刺梨汁混浊度没有明显影响，而明胶、壳聚糖等是通过吸附沉降来脱除单宁[25]，因而果汁得到沉淀澄清。

3 结论与讨论

单宁酶能较好地脱除刺梨汁中的单宁，最佳脱除条件为单宁酶用量0.12%、pH4.5、脱除温度45℃、脱除时间100min，此时总单宁脱除率为76.07%，这与Srivastava等[12]用单宁酶脱除樱桃李汁的单宁所得结果相近；通过单宁酶处理可将容易影响果汁品质的水解单宁脱除，对于具有功能性的缩合单宁则影响较小，且单宁酶法能够较好地保存刺梨果汁中的营养物质，对刺梨果汁组织混浊度没有显著影响，能较好保持刺梨原汁的组织形态，操作方法相对简单，果汁损失小，可以用于混浊型刺梨汁加工中对原料的前处理。

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