响应面分析法优化β-环糊精包合分离花椒籽油中α-亚麻酸的工艺

薛华丽

(甘肃农业大学理学院，甘肃 兰州 730070)

摘 要：在单因素试验的基础上，以水与β-环糊精(β-CD)比例、包合温度、包合时间为自变量，α-亚麻酸的提纯率为响应值，采用Box-Behnken试验设计，利用响应面分析法对花椒籽油中α-亚麻酸的分离工艺进行优化。结果表明：最佳分离工艺条件为：水:β-环糊精(β-CD)=9.9:1、包合温度64℃、包合时间1.32h，此条件下，β-环糊精包合花椒籽油的包合率最高达22.42%。通过红外光谱仪(FT-IR)验证了包合反应的发生，采用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)对包合前后脂肪酸成分进行分析，共检测出3种脂肪酸，使α-亚麻酸的相对含量由4.12%提高到21.35%。

关键词：花椒籽油；α-亚麻酸；β-环糊精；响应面分析

Application of Response Surface Methodology to Optimize the Separation Technique for α-Linolenic Acid by β-Cyclodetrin Inclusion from Pricklyash Seed Oil

XUE Hua-li

(College of Science, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

Abstract：The optimized separation conditions for α-linolenic acid from pricklyash seed oil were determined by using single factor experiments and response surface analysis. The ratio of water to β-CD, inclusion temperature and inclusion time were used as the independent variables and the yield of α-linolenic acid was used as the response value. The results showed that the optimum separation conditions were the ratio of water to β-CD 9.9:1, inclusion temperature 64 ℃ and inclusion time 1.32 h. The resulting inclusion rate reached 22.42%. The occurrence of inclusion reactions was verified by FT-IR. The composition of unsaturated fatty acids was analyzed by GC-MS after inclusion reactions, and three fatty acids were retained in the oil. The content of α-linolenic acid was improved from 4.12% to 21.35%.

Key words：pricklyash seed oil；α-linolenic acid；β-cyclodetrin；response surface analysis

中图分类号：TS225.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)18-0045-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201320010

花椒籽是调味料花椒生产过程中的主要副产物，其产量可占花椒产量的50%，但长期以来一直未被利用，每年有数十万吨的花椒籽亟待开发利用。研究发现，花椒籽油中含有高达80%不饱和脂肪酸，其中α-亚麻酸(α-linolenic acid，ALA)17%～24%。ALA是人体必需的脂肪酸之一，具有降血脂、降血压、抗肿瘤、抑制衰老等重要生理功能[1-3]，尤其是从植物中提取的ALA能够通过肝脏代谢产生具有“脑黄金”之称的EPA和DHA及多种有益因子，参与生命过程，提高人体自身免疫力[4-6]。因此其开发具有极其广阔的前景。

目前，α-亚麻酸分离富集方法有硝酸银络合法、分子蒸馏、β-环糊精包合法和尿素包合法等。刘静等[7]采用β-环糊精包合法，通过正交试验优化分离花椒油中α-亚麻酸，使其质量分数由19.17%提高到56.53%。杨秀芳等[8]采用尿素包合法，通过正交试验优化分离花椒油中α-亚麻酸，使其质量分数由25.83%增至68.87%。杨克迪等[9]采用硝酸银络合萃取蚕蛹油α-亚麻酸酯，所得产品纯度达到97.9%，收率44.3%。李婷婷等[10]、吴彩娥等[11]采用分子蒸馏技术富集猕猴桃籽油中α-亚麻酸，使其质量分数提高到83.67%，4级分子蒸馏后α-亚麻酸质量分数达到86.27%。总体来看，硝酸银络合法得到的亚麻酸纯度高，但是硝酸银价格昂贵，浓缩产品中有Ag+残留[9]；分子蒸馏工序简单，效率较高，但设备投入较大，要得到高纯度亚麻酸需要多级分子蒸馏，回收率变低[12]。尿素包合和β-环糊精包合法具有成本低廉、工艺简单、操作温度低等优点，是一种简单有效的多不饱和脂肪酸富集方法[13-17]。本研究利用从花椒籽中提取花椒籽油为原料，采用响应面方法优化β-环糊精包合法富集α-亚麻酸工艺，以期使花椒籽油中α-亚麻酸得到富集纯化。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

花椒油，产地广东东莞；95%乙醇、无水硫酸钠、石油醚(沸程60～90℃)、甲醇、氢氧化钠、浓硫酸、β-环糊精均为分析纯。

DZKW电子恒温不锈钢水浴锅 上海东星建材试验设备有限公司；RE52-98真空旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；DF-Ⅱ集热式磁力加热搅拌器 金坛市顺华仪器有限公司；HP6890/5973型气相色谱-质谱联用仪 美国惠普公司；FTIR-650型傅里叶变换红外光谱仪 天津港东科技发展股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 花椒油中混合脂肪酸(FFA)制备

取50mL花椒籽油加入200mL 1.0mol/L NaOH-乙醇溶液中，60℃条件下皂化40min，冷却至室温后，加适量石油醚以除去不皂化物，置于冰箱中冷却，使皂析出，减压抽滤除去过量乙醇，加适量水，使皂溶解，再用10%盐酸调至pH2～3，用石油醚萃取2次，静置弃去水层，蒸馏水洗至中性，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏回收石油醚，即得FFA[18]。

1.2.2 β-环糊精包合法处理混合脂肪酸(FFΑ)

称取一定量β-环糊精，60℃条件下加水搅拌保温，加入FFA与无水乙醇(2:1，g/mL)混合溶液，一定温度条件下搅拌至规定时间，冷却后，置冰箱中冷冻数小时后抽滤，蒸馏水洗涤，60℃条件下干燥4h，即得白色粉末状富集α-亚麻酸的β-CD包合物。

将此包合物置于圆底烧瓶中，加入一定量的石油醚，75℃条件下超声回流1h，减压抽滤，将所得滤液转入圆底烧瓶旋转蒸发回收石油醚，即得富含α-亚麻酸的脂肪酸[19]。

1.2.3 脂肪酸的检测分析

1.2.3.1 脂肪酸甲酯化

取一定量的富含α-亚麻酸的脂肪酸，加入2%硫酸-甲醇溶液，70℃条件水浴中加热回流2h，取出冷却，用石油醚萃取2次，合并萃取液，用饱和食盐水洗至中性，无水硫酸钠干燥，回收石油醚，即得可用于下述分析的α-亚麻酸甲酯。

1.2.3.2 样品的红外光谱分析

将β-环糊精、α-亚麻酸β-CD包合物、β-CD包合后的富含α-亚麻酸的脂肪酸甲酯，采用KBr压片法分别测红外光谱吸收，比较包合前后红外区吸收的变化，判断β-环糊精包合法分离α-亚麻酸的效果。

1.2.3.3 样品的GC-MS分析

色谱条件：DB-23色谱柱(15mm×0.32mm，0.25µm)。升温程序：初温150℃，保持4min，3℃/min升至230℃，保持20min。进样口温度230℃。载气He，不分流进样，2min后打开分流阀，进样量1.0µL。质谱条件：四极杆温度150℃，离子源温度230℃，溶剂延迟时间5min，电子轰击能70.1eV，辅助温度280℃。

1.2.4 单因素试验

选取水:β-CD、包合温度、包合时间、冷冻时间4个因素对α-亚麻酸提纯率的影响进行单因素试验，以确定最佳的包合条件。

1.2.4.1 水:β-CD的确定

称取FFΑ 2.0g，按照(FFΑ＋无水乙醇):β-CD=1:8，β-CD 24.0g与水配成不同比例溶液，60℃条件下包合1.5h，冰箱中冷冻15h，抽滤，洗涤，干燥包合物，按照1.2.2节的实验方法，分离得富含α-亚麻酸的脂肪酸，称质量，计算提纯率。

1.2.4.2 包合温度的确定

固定水:β-CD=10:1，按照1.2.4.1节实验方法，其他条件不变，考察包合温度对分离效果的影响。

1.2.4.3 包合时间的确定

固定水:β-CD=10:1、包合温度60℃，按照1.2.4.1节实验方法，其他条件不变，考察包合时间对分离效果的影响。

1.2.4.4 冷冻时间的确定

固定水:β-CD=10:1、包合温度60℃、包合时间1.5h，按照1.2.4.1节实验方法，其他条件不变，考察冷冻时间对分离效果的影响。

1.2.5 Box-Behnken试验设计

在单因素试验的基础上，以Design Expert 8.0分析软件为辅助手段，根据Box-Behnken试验设计原理[20]，以水：β-CD(A)、包合温度(B)、包合时间(C)为自变量，以α-亚麻酸的提纯率为响应值，设计三因素三水平的Box-Behnken响应面分析试验，见表1。

表 1 响应面设计因素与水平

Table 1 Levels and factors for the response surface design

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 水:β-CD对提纯率的影响

图 1 水:β-CD对ALA提纯率的影响

Fig.1 Effect of water: β-CD ratio on the content of ALA

由图1可以看出，α-亚麻酸的提纯率随水:β-CD变化而变化，在水:β-CD 4:1～10:1之间，α-亚麻酸的提纯率呈增加趋势，水:β-CD 10:1时，α-亚麻酸的提纯率达到最大，而后随着水用量的增加α-亚麻酸的提纯率迅速下降。其原因可能是在一定的范围内，β-CD的浓度越大，对花椒油中饱和脂肪酸包合的效果就越好，但当β-CD的浓度太大时，会将其中的不饱和脂肪酸也进行一定程度的包合。因此，最佳水:β-CD的比例为10:1。

2.1.2 包合温度对提纯率的影响

图 2 包合温度对ALA提纯率的影响

Fig.2 Effect of inclusion temperature on the content of ALA

由图2可见，在所选的温度范围内，α-亚麻酸的提纯率随包合温度的变化曲线升降明显，缓冲区间较大，在40～60℃之间，随着包合温度的升高α-亚麻酸的提纯率逐渐升高，60℃达到最高，而后随着温度的升高，α-亚麻酸的提纯率又逐渐降低。因此，选取60℃为最佳的包合温度，此时α-亚麻酸的提纯率可达到22.02%。

2.1.3 包合时间对提纯率的影响

由图3可见，α-亚麻酸的提纯率随包合时间的变化较显著，在0.5～1.5h之间，随着包合时间的延长α-亚麻酸的提纯率急剧增加，1.5h时α-亚麻酸的提纯率达最高值22.34%，而后又骤然下降。因此，选取1.5h为最佳包合时间。

图 3 包合时间对ALA提纯率的影响

Fig.3 Effect of inclusion time on the content of ALA

2.1.4 冷冻时间对提纯率的影响

图 4 冷冻时间对ALA提纯率的影响

Fig.4 Effect of freezing time on the content of ALA

由图4可见，在所选取的范围内，随着冷冻时间的延长，α-亚麻酸的提纯率呈现增加的趋势，在5～10h之间，α-亚麻酸的提纯率随冷冻时间的延长迅速增加，在10～25h之间，α-亚麻酸的提纯率的增加趋于平缓，到15h时基本达到最高值，其后随着冷冻时间的延长，α-亚麻酸的提纯率变化很小。因此，选冷冻时间15h为最佳。

2.2 包合工艺参数的响应面优化

表 2 响应面试验设计及结果

Table 2 Experimental design and results for responses surfaces analysis

Box-Behnken响应面设计共有17个试验点，可将其分为两类：其一是析因点，自变量取值在各因素所构成的三维顶点，共有12个点；其二是零点，为区域的中心点，零点试验重复5次，用以估计试验误差。

以α-亚麻酸的提纯率为响应值，经Design Expert 8.0分析软件对表2中数据进行回归拟合分析得到回归方程为：Y=22.44－0.041A＋0.52B＋1.3C＋0.060AB＋0.23AC－0.065BC－0.30A2－2.12B2－1.61C2。

图 5 水:β-CD、包合温度、包合时间交互作用对ALA

提纯率影响的响应面图

Fig.5 Response surface of the interaction effects of water : β-CD ratio, inclusion temperature and inclusion time on the content of ALA

根据响应面及图中等值线的形状分析水:β-CD、包合温度、包合时间3个因素对ALA提纯率的影响。等值线的形状反映交互作用的强弱，椭圆表示两个因素之间交互作用较强，圆形则表示两个因素之间交互作用较弱。由图5a、5b可知因素A和B、A和C的交互作用较显著，图5a中，包合温度对ALA提纯率的影响在56～60℃的范围内，随包合温度的升高迅速增加，而后又有下降的趋势。水与β-CD比例在所选定的范围内，对ALA提纯率的影响变化不明显。在5b图中，水与β-CD比例在设定的范围内，对ALA提纯率影响不显著。ALA提纯率随包合时间的延长急剧增加，影响较为显著。由图5c可见，因素包合温度和包合时间的交互作用不显著。明显在其增长较为平缓处取得极大值。不过，ALA提纯率随包合时间的延长迅速增加，而包合温度对ALA提纯率的影响不明显。

表 3 方差分析表

Table 3 Variance analysis

由表3方差分析结果可见，在试验设定的区域内，一次项和二次项对ALA提取率影响极显著，说明各具体因素对响应值的影响不是简单的一次线性关系。交互相中水:β-CD和包合时间影响显著，而A和C及B和C的交互作用对响应值影响不显著。失拟项对应的P=0.202(P＞0.05)，说明所得的方程与实际拟合中的非正常误差所占比例较小，响应值与因素之间的回归方程拟合度较好，说明试验具有很高的可信性和准确性。

通过Design Expert 8.0软件分析，由响应曲面和等高线图以及回归方程分析可知，ALA提纯率的最佳包合条件为：水:β-CD=9.89:1、包合温度63.96℃、包合时间1.32h，此时ALA提纯率为22.46%。为验证模型及回归方程的准确性进行最佳条件下的验证实验，为操作方便选取水:β-CD=9.9:1、包合温度64℃、包合时间1.32h，3次重复实验结果平均值为22.42%，基本与预测值相符。因此，本模型可以较好地反映花椒籽油最佳包合的工艺条件。

2.3 样品的红外光谱验证

为了验证β-环糊精包合法对花椒油中ALA的分离效果，通过红外光谱仪测得β-环糊精包合前后的β-环糊精、β-环糊精的包合物、包合后混合脂肪酸的谱图如图6所示。

由图6可知，花椒籽油分子的红外振动受到了较大的影响，整个α-亚麻酸-β-CD包合物基本呈现β-CD的红外谱图，只是图6b与图6a相比，出现α-亚麻酸的特征色谱峰(3012.27cm-1)，由于不饱和脂肪酸进入β-CD空腔内，形成α-亚麻酸-β-CD包合物，因而在1710.55cm-1处的C＝O吸收峰强度明显减弱。由此说明，花椒籽油中不饱和脂肪酸可被β-CD所包合从而达到分离花椒籽油中α-亚麻酸的目的。

图 6 β-环糊精(a)、β-环糊精包合物(b)和包合后混合脂肪酸(c)的

红外光谱图

Fig.6 IR of β-CD (a), β-CD inclusion (b) and fatty acid mixed after inclusion (c)

2.4 β-环糊精包合前后花椒油中脂肪酸GC-MS分析

为了精确测定花椒油中混合脂肪酸的种类以及包合前后脂肪酸相对含量的变化，通过气质联用仪分析β-环糊精包合前后的脂肪酸色谱图，如图7所示。

图 7 花椒油脂肪酸(a)和β-环糊精包合后的脂肪酸(b)气相色谱图

Fig.7 Chromatogram of the seed oil of pricklyash (a) and fatty acid sample attained by urea inclusion method (b)

通过对未处理的花椒油气相色谱图中各峰的质谱分析得出花椒油中主要脂肪酸有6种，见表4，其他脂肪酸含量甚微，部分色谱峰为添加剂，本实验不予考虑。

表 4 花椒籽油脂肪酸主要成分分析

Table 4 Fatty acid composition of pricklyash seed oil

如图7b可见，经β-环糊精包合后气相色谱图上出现4组主峰，分析其脂肪酸主要有3种：油酸、亚油酸、α-亚麻酸，见表5。

表 5 β-环糊精包合后主要脂肪酸组成

Table 5 Fatty acid composition of pricklyash seed oil after

β-CD inclusion

由图7b和表5可见，经β-CD包合后花椒籽油中脂肪酸成分主要有3种(其中保留时间为24.21min的峰为α-亚麻酸的甲酯化峰)且均为不饱和脂肪酸，主要是油酸、亚油酸、α-亚麻酸，其中α-亚麻酸的含量由包合前的4.12%提高到包合后21.35%。

3 结 论

经过单因素试验和响应面设计得出β-CD包合花椒籽油中α-亚麻酸的最佳工艺条件为，水:β-CD=9.9:1、包合温度64℃、包合时间1.32h，在该条件下回归方程分析得出：ALA提纯率为22.42%；经一次β-CD包合，气相色谱法分析得出：花椒油中ALA的相对含量为21.35%，不饱和脂肪酸的收率为96.74%。与其他富含α-亚麻酸的植物油脂，如亚麻籽油(40%～60%)、紫苏籽油(56.14%～64.82%)等相比，花椒籽油中α-亚麻酸相对含量较低，分离难度较大，同时，本实验分离得到的α-亚麻酸相对含量也低于文献[7,19]中所报道，可能是由于所购买花椒油含有添加剂，或者由花椒籽和果实同时压榨而得，成分不单一而导致。其实，目前采用单一方法是很难得到高纯度、高收率α-亚麻酸的。因此，可采用多种分离方法相配合，如尿素包合法与分子蒸馏法配合，吸附分离法与脂肪酶浓缩法配合等，以达到提高分离效率，适应规模化生产的目标。

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