酶与微波处理对海带多糖提取及抗氧化活性的影响

何传波，魏好程，熊何健，汤凤霞，吴国宏

(集美大学生物工程学院，福建 厦门 361021)

摘 要：采用纤维素酶解和微波辅助方法从海带中提取多糖组分，以羟自由基和DPPH自由基清除率为衡量抗氧化活性的指标，考察不同提取方法对海带多糖抗氧化活性的影响。单因素试验考察酶用量、酶解时间、微波萃取温度和时间对多糖提取率的影响。酶解方法的最佳提取条件为：酶用量1.5%、温度40℃、pH5、时间2.5h，多糖提取率为3.46%。抗氧化活性实验表明，海带多糖对DPPH自由基和羟自由基有较好地清除效果，其清除能力与多糖质量浓度有明显的量效关系；酶解和微波处理得到的海带多糖样品比常规水浴浸提的样品抗氧化活性有所提高；随着酶用量的增加和微波萃取时间的延长，抗氧化活性呈现下降趋势。

关键词：海带；多糖；酶解；微波；抗氧化活性

Extraction and Antioxidant Activities of Polysaccharides from Laminaria japonica as Affected by

Enzymatic Hydrolysis and Microwave

He Chuan-bo，Wei Hao-cheng，Xiong He-jian，Tang Feng-xia，WU Guo-hong

(School of Bioengineering, Jimei University, Xiamen 361021, China)

Abstract：The effects of cellulase-catalyzed hydrolysis and microwave treatment, separately used to enhance the extraction of polysaccharides from Laminaria japonica polysaccharides (LJPs) on the free radical scavenging activity of LJPs against hydroxyl and DPPH radicals were investigated. One-factor-at-a-time designs were use to examine the effect of enzyme dosage and hydrolysis time as well as ultrasonic-assisted extraction temperature and time on the yield of LJPs. The optimum cellulase-assisted extraction conditions were found to be 1.5%, 40 ℃, 5 and 2.5 h for enzyme dosage, temperature, pH and time, respectively. Antioxidant assays showed that LJPs possessed good radical scavenging activity against hydroxyl and DPPH radicals in a marked dose-dependent manner. Polysaccharides with stronger antioxidant activity were obtained by microwave-assisted extraction and cellulase-assisted extraction compared with the conventional method of waterbath extraction. Furthermore, higher enzyme dosages and prolonged microwave treatment reduced the antioxidant activity of LJPs.

Key words：Laminaria japonica polysaccharides (LJPs)；enzyme hydrolysis；microwave；antioxidant activities

中图分类号：Q814.9 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)18-0051-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201318011

海带，别名江白菜，中药名称“昆布”，是一种具食用和药用价值的大型海藻，隶属于褐藻门。它富含蛋白质、脂肪、碳水化合物等宏量营养素以及碘、钙、磷、铁、胡萝卜素、B族维生素等多种微量元素，其显著的药用价值在《本草纲目》、《食用本草》、《中国中草药汇编》等医书中均有记载[1]。

糖类是除蛋白质、核酸以外的一类重要的生物大分子，来源于动植物、藻类的多糖由于它们独特的功能和低毒性，在保健食品和药品发展方面具有广阔的应用前景。海带多糖(Laminaria japonica polysaccharides，LJPs)是存在于海带细胞间和细胞内的一类天然生物大分子物质，研究表明，海带对外界恶劣环境所表现出来的抗逆耐受能力与它们所含的海带多糖有直接关系，同时，海带多糖还具有稳定细胞膜和蛋白质结构的功能[2-3]。另外，许多文献报道证实，从海带中分离出的多糖具有抗癌、防癌和增强免疫等功能，而且在抗病毒、降血糖、降血脂、抗凝血和减肥等方面具有特殊功效[4-8]。

我国海带的产量和养殖量居亚洲之最，年产约23万吨干品，在我国福建、辽宁、山东、浙江及广东省北部沿海均有养殖[9-10]。目前，除少部分深加工外，大部分以粗加工干制品为主，我国海带深加工制品具有很大的发展潜力。因此，研究开发海带多糖，促进我国海带产品深加工利用，变海带资源优势为经济优势，具有重要意义。

常规多糖提取采用水提醇沉的方法，具有能耗高、提取率低等缺点，酶工程技术和微波辅助浸提技术是近年来发展起来的新型的破壁提取方法，与传统方法相比具有节能、快速、条件温和、提取效率高等优点，已广泛用于植物有效成分的提取[11]。本实验以干海带为原料，分别采用纤维素酶法和微波辅助的方法提取其中的多糖组分，以羟自由基(•OH)和DPPH自由基清除率为衡量抗氧化活性指标，探讨不同的提取方法对自由基清除活性的影响，为海带资源的综合利用和精深加工提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

市售干海带，粉碎待用。

纤维素酶(酶活力≥15U/mg) 国药集团化学试剂有限公司；DPPH自由基 美国Sigma 公司；三(羟甲基)胺基甲烷(生化试剂) 中国医药集团；邻苯三酚、邻二氮菲、盐酸、过氧化氢、硫酸亚铁、无水乙醇等试剂如无特殊说明均为分析纯。

MDS-6微波消解/萃取仪 上海新仪微波化学科技有限公司；DKZ电热恒温振荡水槽 上海实验仪器厂；WK-200B高速药物粉碎机 青州市精诚机械有限公司；723PC可见分光光度计 上海欣茂仪器有限公司；BS/BT电子天平 德国赛多利斯股份公司；RE-52AA旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；TDL-5离心机 上海安亭科学仪器厂；3K3D高速冷冻离心机 德国Sigma公司；pH211台式酸度测定仪 北京哈纳科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 海带多糖的提取

将干海带粉碎过筛，经乙醚回流脱酯后，热水浸提，抽滤，合并滤液，减压浓缩，加入5倍体积的95%乙醇沉淀，低温静置过夜，离心(转速4000r/min)，沉淀加蒸馏水溶解，再次重复乙醇沉淀的步骤两次，最后1次得到的沉淀用少量水溶解，活性炭脱色后，Sevag法脱蛋白4次，浓缩，冷冻干燥，得到海带多糖。

1.2.2 粗多糖提取率的计算

多糖含量测定：苯酚-硫酸法[12]。

粗多糖提取率以1g干品中提取出来的粗多糖总量的百分含量表示，计算方法如式(1)所示：

(1)

式中：0.9为葡萄糖的换算系数。

1.2.3 •OH清除率测定方法

取0.75mmol/L邻二氮菲溶液1mL，PBS液2mL和蒸馏水1mL，充分混匀后，加0.75mmol/L硫酸亚铁1mL混匀，加0.01%的过氧化氢1mL，37℃条件下保温60min，于536nm波长处测其吸光度，其值(Ap)，用30%的乙醇1mL代替1mL过氧化氢，测得吸光度为(Ag)。再用试样1mL代替1mL蒸馏水，测得吸光度为(As)。

(2)

1.2.4 DPPH自由基的清除率测定方法

称取20mg的DPPH用无水乙醇溶解定容于500mL容量瓶中。分为样品组、对照组和空白组。不同的样品液充分混匀，静置30min后在517nm波长处测定吸光度。DPPH自由基清除率按式(3)计算：

DPPH自由基清除率/%=[1－(A2－A1)/A0]×100 (3)

式中：A0为2mL DPPH溶液＋2mL溶剂的吸光度；A1为2mL乙醇＋2mL样品溶液的吸光度；A2为2mL DPPH溶液＋2mL样品溶液的吸光度。

2 结果与分析

2.1 酶解方法对多糖提取率的影响

2.1.1 酶用量对多糖提取率的影响

图 1 酶用量对海带多糖提取率的影响

Fig.1 Effect of enzyme amount on the yield of polysaccharides

纤维素酶用量在0～4.0%之间变化，控制料液比1:40、温度50℃、pH5、提取2h后，立即置90℃水浴加热灭酶10min，得到的多糖提取率如图1所示。纤维素酶的使用可以明显增加海带多糖的提取率，酶用量在0～1.5%之间，多糖提取率迅速增加，当酶用量达到1.5%时，多糖提取率为2.57%，与常规水浴浸提法比较，提取温度显著降低，提取率明显增加(水浴浸提温度90℃，2h时多糖提取率仅为1.8%)。这主要是由于在溶剂作用下，纤维素酶进入细胞壁内部并将其溶胀酶解后，多糖更容易被溶出，并且随着酶用量的增加，酶与纤维素分子的接触机会增加，更多的多糖溶出[13]。当酶用量超过1.5%后，多糖提取率增加趋势变缓，这主要是由于底物纤维素完全被酶分子所饱和，酶作用的速度趋于稳定，致使多糖溶出量也趋于稳定。

2.1.2 酶解时间对多糖提取率的影响

固定其他条件不变，酶用量为1.5%，提取时间在0.5～3h之间变化，得到的多糖提取率如图2所示。在提取时间小于2h时，多糖提取率随着时间的延长而逐渐增加，当超过2h后，提取率基本不变。由于酶与底物的结合需要一定的时间，反应时间太短，酶解不充分，因此，在前期增加酶解时间可以使纤维素酶对细胞壁中的纤维素物质充分酶解，增加多糖溶出率。但酶解时间过长，酶的催化活性降低，溶剂中多糖的浓度越来越高，浓度差变小，扩散速度减慢，基本达到平衡后，多糖的提取率便不再明显增加[14]。并且，由于纤维素酶并不是专一性高的酶，酶解时间的延长，可能会造成多糖物质的降解。

图 2 酶解时间对海带多糖提取率的影响

Fig.2 Effect of enzymolysis time on the yield of polysaccharides

2.1.3 酶法提取的正交试验

表 1 纤维素酶法提取的正交试验设计与结果

Table 1 Orthogonal array design and results for the optimization of cellulase-catalyzed hydrolysis

根据单因素试验结果，结合纤维素酶的最适温度和pH值范围，选取酶用量、时间、温度和pH值4个因素，各取3个水平，选用L9(34)的正交表，以多糖提取率为考察指标，对酶法提取多糖的工艺条件进行优化，并对结果进行极差分析及方差分析，确定最适作用条件，正交试验设计与结果见表1。极差分析表明，各因素对提取率的影响主次顺序是C(pH值)＞A(温度)＞D(时间)＞B(加酶量)。随酶处理时间的延长，多糖提取率逐渐升高，酶用量、温度和pH值对多糖提取率的影响趋势相同，均是先增后降。得到的最优提取条件为：A2B2C2D3，即：酶用量1.5%、温度40℃、pH5、时间2.5h。采用此条件进行3次验证实验，得到的平均提取率为3.46%。

2.2 微波萃取方法对多糖提取率的影响

2.2.1 微波萃取温度对多糖提取率的影响

微波萃取主要是通过穿透水将能量传递到纤维素细胞内部微管束和腺细胞内，细胞内温度突然升高，连续的高温使其内部压力超过细胞空间膨胀的能力，从而导致细胞破裂，细胞内的物质自由流出，传递到周围被溶解。微波热效应是其破壁的最根本原因[15]，因此，本实验研究了微波条件下，不同萃取温度对多糖提取率的影响。微波萃取温度从30～90℃之间变化，得到海带多糖提取率如图3所示。

图 3 微波萃取温度对海带多糖提取率的影响

Fig.3 Effect of microwave extraction temperature on the yield of polysaccharides

由Stokes-Einstein公式：DAB=KT/6πμr，可以看出，温度与扩散系数正相关，因此要想获得较高的扩散速率，就必须设法升高提取温度。从图3可以看出，随着微波作用温度从30～80℃，物料在单位时间内获得的能量逐步增加，加剧了海带纤维素细胞的破裂和组织中多糖物质分子及萃取溶剂分子的热运动，多糖类化合物的溶出与溶剂向组织内的渗入相互促进，使两者有更充分接触的机会，从而使多糖提取率明显增加。但是超过80℃后，提取率逐渐降低，这可能是由于当微波温度太高时，微波对细胞内物质的选择性加热的性能差异减少，一些易溶于水的其他物质先被溶解，造成多糖得率降低[16]。同时，局部温度过高可能会导致多糖类化合物的分解。

2.2.2 微波萃取时间对多糖提取率的影响

固定其他条件不变，微波萃取时间从0.5～4h之间变化，得到多糖提提取率如图4所示。随着时间的延长，多糖的提取率逐渐增大，其中在0.5～1.5h内，海带多糖提取率增长速度较快，微波萃取0.5h的多糖提取率就已经达到了2.20%，超过了常规水浴方法的提取率。1.5h后再延长时间，多糖的提取率基本不变。微波加热可使水等极性分子在微波电磁场中快速转向及定向排列，从而产生撕裂和相互摩擦发热，正是这种剧烈运动导致植物细胞内部结构发生破坏，有助于多糖成分的溶出，从而大大缩短提取时间[14]。微波处理时间的延长可以增加极性溶剂分子间的摩擦，使其对植物细胞内部结构的破坏程度加剧。但是微波处理时间也不能过长，过长就会导致水分蒸发过快，从而使得细胞内多糖的提取难以进行，并且也可能导致多糖活性的降低。

图 4 微波萃取时间对海带多糖提取率的影响

Fig.4 Effect of microwave treatment time on the yield of polysaccharides

2.3 不同提取方法对抗氧化活性的影响

图 5 海带多糖对DPPH自由基的清除活性

Fig.5 Scavenging effect of LJPs on DPPH radical

图 6 海带多糖对•OH的清除活性

Fig.6 Scavenging effect of LJPs on hydroxyl radical

比较常规水浴浸提、酶解提取(酶用量分别为1%和4%)、微波萃取(微波萃取时间分别为1h和4h)等不同方法获得的海带多糖样品对•OH和DPPH自由基的清除活性，考察酶与微波处理对多糖抗氧化活性的影响。以多糖质量浓度为横坐标，两种自由基清除率为纵坐标，各得到5条曲线如图5、6所示，对照组为不同质量浓度的VC溶液。结果显示，海带多糖具有较好的清除DPPH自由基和•OH效果，并且随着多糖质量浓度的增加，清除率逐渐增强，清除能力与其质量浓度具有明显的量效关系，在实验质量浓度范围内，海带多糖对两种自由基的最大清除率可达到60%左右。有文献[17-18]报道，海带多糖的抗氧化机理可能是氧自由基先将糖链上的糖醛酸部分氧化降解，然后再将糖链上甘露糖、半乳糖和葡萄糖形成的糖苷键切断，从而将海带硫酸多糖降解。因此，海带多糖在体外对自由基有一定的清除作用，作为功效成分应用于功能性食品，可能清除体内产生的过多自由基，阻断体内自由基链式反应的进行，具有天然抗氧化剂的应用价值。

根据样品清除自由基的曲线方程分别计算IC50值，结果见表2。可知，海带多糖对两种自由基的清除活性明显低于VC对照组，不同的海带多糖样品对两种自由基的清除活性由强到弱依次为：酶用量1%＞酶用量4%＞微波萃取1h＞微波萃取4h＞常规水浴浸提。酶解和微波处理可能会对多糖的结构产生破坏而导致其生物活性降低，在本实验中，由于酶解方法大大降低了提取温度，微波萃取显著缩短了提取时间，使得酶与微波处理对多糖结构的影响远小于长时间、高温浸提对结构的破坏，从而导致其抗氧化活性并没有降低。同时，表2数据还显示，随着酶用量的增加和微波萃取时间的延长，其抗氧化活性呈现下降趋势。这提示，在应用这两种方法时，应当注意处理程度，适当的酶用量和微波处理时间，不仅可以显著提高多糖得率，而且还能最大限度保持其生物活性。

表 2 海带多糖清除自由基的IC50

Table 2 IC50 values for free radical scavenging by LJPs

3 结 论

3.1 本实验采用酶解和微波方法提取海带中的多糖组分，并通过DPPH自由基和•OH清除活性考察不同方法对其体外抗氧化活性的影响。实验结果证实，与常规多糖提取方法相比，酶解方法能有效降低提取温度，微波萃取方法能明显缩短提取时间，这两种方法均具有节能、提取效率高等的优点。并且，适当的酶与微波处理不会降低其抗氧化活性，是值得大规模开发利用的多糖提取新技术。

3.2 单因素试验表明，海带多糖提取率随酶用量、酶解时间、微波萃取时间的变化趋势相似，均是先升高然后持平，随微波萃取温度升高先升后降。正交优化试验确定的最佳酶法提取工艺条件为：酶用量1.5%、温度40℃、pH5、时间2.5h，多糖提取率为3.46%。

3.3 抗氧化活性结果表明，海带多糖对DPPH自由基和•OH有较好的清除效果，其清除能力与多糖质量浓度有明显的量效关系；酶解和微波萃取方法由于降低了提取温度、缩短了提取时间，得到的海带多糖样品比常规水浴浸提样品活性高；随着酶用量和微波萃取时间的增加，抗氧化活性呈现下降趋势。

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