醇浸牛蒡根中水溶性多糖的提取及生物活性研究

许瑞波，高颖颖，周圣翔，詹永成，胡喜兰

(淮海工学院化工学院，江苏 连云港 222005)

摘 要：研究醇浸牛蒡根多糖的提取工艺及生物活性。以醇浸泡后的牛蒡根为原料，采用水提醇沉法，通过单因素和正交试验优化牛蒡根中水溶性多糖的提取工艺条件。结果表明：料液比1:25(g/mL)、提取时间2.5h、提取温度85℃、提取2次时，WPRA提取率为8.43%。WPRA经Sevag法脱蛋白后，用紫外光谱、红外光谱进行表征，证明产物可能为含有肽键的多糖类物质。体外抗氧化性实验表明，WPRA对DPPH自由基具有一定的清除能力，对超氧阴离子自由基清除能力较弱。抑菌实验表明WSPA对受试菌株基本没有抑制作用。

关键词：醇浸；牛蒡根；水溶性多糖；提取；抗氧化活性；抑菌作用

Extraction and Bioactivities of Water-Soluble Polysaccharides from Ethanol-Soaked Roots of Burdock

(Arctium lappa L.)

XU Rui-bo，GAO Ying-ying，ZHOU Sheng-xiang，ZHAN Yong-cheng，HU Xi-lan

(School of Chemical Engineering, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China)

Abstract：After having been soaked in 80% ethanol, burdock roots were used for the extraction of water-soluble polysaccharides by water extraction and ethanol precipitation. The optimal extraction conditions, as established by one-factor-at-a-time and orthogonal array designs, were 1:25 (g/mL), 2.5 h and 85 ℃ for solid/solvent ratio, time and temperature, respectively, and the extraction was repeated twice. Under the optimized conditions, the yield of water-soluble polysaccharides from burdock roots was 8.43%. The crude polysaccharides were deproteinized by Sevag’s method and characterized by UV and infrared spectroscopy. The purified products might be polysaccharides bound with peptide bonds. In vitro antioxidant assays suggested that the polysaccharides had marked DPPH free radical scavenging activity, but weak superoxide anion radical scavenging activity. In addition, they had no inhibitory effects on E. coli, S.aureus or B.subtilis.

Key words：ethanol-soaked roots of burdock (Arctium lappa L.)；water-soluble polysaccharides；extraction；antioxidant activity；antibacterial effect

中图分类号：R284.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)18-0082-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201318017

牛蒡(Arctium lappa L.)又名白肌人参、大力子等，属菊科牛蒡属直根系二年生大型草本植物，根和叶可作蔬菜，种子和根可入药，是较好的药食同源植物[1-3]。牛蒡根为肉质直根，味微苦而性黏，富含蛋白质、氨基酸、维生素、膳食纤维等营养成分及菊糖、绿原酸、咖啡酸、黄酮类化合物和挥发油等活性成分，具有祛风热、消肿痛、抗菌、抗氧化等作用，可用于治疗急性乳腺炎、心血管疾病和恶性肿瘤，被《名医别录》、《本草纲目》等收录[4-8]。

牛蒡属菊科中的稀特蔬菜，被誉为“蔬菜之王”，原产我国，公元940年前后传入日本[1-2]。近年来，在江苏、山东、北京等地被大规模种植，主要出口日本以及欧洲许多国家。由于牛蒡根具有良好的医疗保健作用和独特的综合营养价值，人们除了直接食用和药用之外，对其活性成分展开了广泛的研究[1,4-7,9-10]。研究牛蒡根活性成分时，一般都是先用乙醇浸泡，然后对浸提液进一步分离纯化，而浸泡后的牛蒡根往往被丢弃。因此，本实验以乙醇浸泡后的牛蒡根为原料，对其水溶性多糖(water-soluble polysaccharides from root of Arctium lappa L. soaked by alcohol，WPRA)进行提取，并对其抗氧化性和抑菌活性进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛蒡根由江苏徐州市沛县河口镇提供。将鲜牛蒡根洗净、切丁、晾干，再用80%工业酒精浸泡，浸提2次后，浸提液合并备用，浸泡后牛蒡根置于烘箱中50℃烘干，即得醇浸后牛蒡根丁，简称为原料，密封、备用。

1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH) 美国Sigma 公司；VC、Tris、浓盐酸、邻苯三酚、营养琼脂、98%硫酸、95%工业酒精、正丁醇、氯仿等试剂均为分析纯；实验菌种为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌。

1.2 仪器与设备

HH-2数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司；DHG-101电热鼓风恒温干燥箱 鄄城华鲁电热仪器有限公司；RE-5285A旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；UV-2550紫外分光光度计 日本岛津仪器公司；NEXUS-870型傅里叶红外光谱仪 美国Nicolet公司。

1.3 方法

1.3.1 WPRA提取工艺

称取2.0g原料，按照某料液比(g/mL)在某温度条件下提取一定时间，真空抽滤，收集滤液；当考察提取次数时，在相同条件下，将滤渣再提取1、2次，合并滤液。用旋转蒸发仪将提取液浓缩，加入4倍体积的体积分数95%的工业酒精，置于冰箱中过夜沉淀。次日，离心得粗WPRA。

采用Sevag法进行脱蛋白处理，即将粗WPRA用适量蒸馏水溶解，加入多糖液体积1/5量的Sevag试剂(氯仿与正丁醇的体积比为4:1)，充分振荡30min，静置分层，重复多次。用紫外光谱检测蛋白质、核酸的脱除情况。然后，再用旋转蒸发仪将脱蛋白后多糖液浓缩，加入4倍体积的体积分数95%的工业酒精，置于冰箱中过夜沉淀。次日离心，分别用丙酮、乙酸乙酯洗涤固体产物3次，干燥后即得纯化WPRA。

1.3.2 多糖含量测定及提取率计算

以葡萄糖为标准品，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量[11]。参考文献[11]制备标准曲线，得线性回归方程：A =1.5411C＋0.0378，r = 0.9996。其中A为吸光度，C为多糖质量浓度/(mg/mL)。

多糖提取率按照式(1)计算：

(1)

1.3.3 单因素试验

原料在75℃水浴中提取3h，提取1次，考察料液比(1:15、1:25、1:35、1:45、1:55)对WPRA提取率的影响；料液比为1:25，提取3h，提取1次，考察提取温度(60、70、80、90、100℃)对WPRA提取率的影响；料液比为1:25，在80℃水浴中提取，提取1次，考察提取时间(1、2、3、4、5h)对WPRA提取率的影响。

1.3.4 正交试验设计优化WPRA提取工艺

以WPRA的提取率为考察指标，在单因素试验结果的基础上，选用标准的L9(34)正交试验表进行正交试验设计，从而优化从醇浸后牛蒡根中提取水溶性多糖的工艺条件。

1.3.5 体外抗氧化活性的测定

1.3.5.1 清除DPPH自由基的测定[12]

以VC为标准对照物。在10mL具塞试管中加入2mL含1.00mg/mL DPPH的乙醇溶液，分别加入样品液或VC溶液(质量浓度为1mg/mL)0、10、20、50、100、200、400、800、1000μL，用蒸馏水定容至5mL，摇匀。置于37℃水浴锅中，避光反应20min后立即测定514nm波长处吸光度。以50%乙醇为参比，空白对照以50%乙醇代替样品。计算WPRA及VC对DPPH自由基的清除率见式(2)。

(2)

式中：A0为空白对照吸光度；Ai为加样品液后的吸光度；Aj为样品液本底的吸光度。

1.3.5.2 清除超氧阴离子自由基(O2－•)活性的测定

采用邻苯三酚自氧化法[13-14]，以VC为标准对照物。在10mL具塞试管中，加入50mmol/L pH8.2的Tris-HCl缓冲液4.5mL，再加入2mL不同质量浓度的样品液或VC溶液。摇匀后在25℃水浴锅中预热20min，再加入经25℃水浴锅预热的邻苯三酚-盐酸溶液(3mmol/L)1mL，混匀后，于25℃水浴中反应4min，时间要准确。最后加入1mL 10mmol/L的HCl溶液终止反应。以Tris-HCl缓冲液为参比，空白对照以蒸馏水代替样品。测定325nm波长处的吸光度，计算WPRA及VC对O2－•的清除率，见式(3)。

(3)

式中：A0为空白对照吸光度；Ai为加样品溶液后的吸光度；Aj为样品液本底的吸光度。

1.3.6 抑菌活性实验

取34g营养琼脂，加1L蒸馏水，溶解后置于高压灭菌锅内，120℃灭菌30min。冷却至50～60℃制成平板，取0.1mL活化菌液(含菌数约为108/mL)，在平板上涂抹均匀，等距离均匀、垂直放置5个牛津杯。在牛津杯中加入0.1mL样品液(质量浓度分别为5、2.5、1.25mg/mL和0.625mg/mL)，盖好平皿，置于37℃生化培养箱中培养24h[15]。取出后，测量每个牛津杯周围所产生的透明抑菌圈直径(mm)。

2 结果与分析

2.1 WPRA提取的单因素试验

2.1.1 料液比对WPRA提取率的影响

从图1可以看出，随着料液比的减小，多糖提取率迅速增加，料液比为1:25时达到最大值，再减小料液比，提取率又缓慢降低并趋于平稳，说明料液比在1:25左右时，有利于提取WPRA。

图 1 料液比对WPRA提取率的影响

Fig.1 Effect of solid/solvent ratio on the extraction yield of water-soluble polysaccharides

2.1.2 提取温度对WPRA提取率的影响

图 2 提取温度对WPRA提取率的影响

Fig.2 Effect of extraction temperature on the extraction yield of water-soluble polysaccharides

从图2可以看出，随着提取温度的升高，多糖提取率先迅速增加，后快速减少，在80℃时提取效果最好，说明提取温度在80℃左右时，WPRA的提取效果最好。

2.1.3 提取时间对WPRA提取率的影响

图 3 提取时间对WPRA提取率的影响

Fig.3 Effect of extraction time on the extraction yield of water-soluble polysaccharides

从图3可以看出，随着提取时间的延长，多糖提取率先迅速增加，提取2h时提取率最高，再延长时间，提取率反而降低，说明提取时间为2h左右时，有利于WPRA的提取。

2.2 正交试验优化

参考多糖提取的相关文献[16-17]发现，在提取次数的水平设计时，一般都是选择1、2、3次，因为大部分情况下，当提取次数超过3次时，多糖的提取率增加的幅度很小，甚至有下降的趋势，所以本实验在正交试验中提取次数的水平选为1、2、3次。试验设计及结果见表1，方差分析见表2。

表 1 提取WPRA的正交试验设计及结果

Table 1 Orthogonal array design and results for the optimization of polysaccharide extraction

表 2 正交试验结果的方差分析表

Table 2 Analysis of variance for the experimental results of

orthogonal array design

由表2可知，在实验研究范围内，提取时间、提取温度、料液比和提取次数对醇浸牛蒡根中水溶性多糖的提取率均没有显著性影响。由表1可知，各因素对WPRA提取率影响的大小次序为A＞B＞D＞C，提取WPRA的最佳工艺参数为A3B3C2D2，即料液比1:25、在85℃水浴中提取2.5h、提取2次。在最佳工艺条件下进行提取WPRA的验证实验，3组平行，提取率分别为8.41%、8.61%和8.27%，平均提取率为8.43%。说明该工艺稳定性和重复性良好。

2.3 WPRA脱蛋白前、后紫外光谱表征

图 4 WPRA的紫外吸收光谱图

Fig.4 UV-vis spectra of crude and deprotenized polysaccharides

从图4可以看出，粗WPRA在250～350nm波长范围内有一个明显的吸收带，而脱蛋白之后，该吸收带明显减弱，说明用Sevag法可以去除粗产物中部分的蛋白质与核酸。但是，该处弱吸收带的存在说明经过脱蛋白处理后的WPRA中仍然含有多肽键的蛋白质或多肽，而且处理6次与12次相比，吸收带强度变化很小，推测用该工艺提取的多糖很可能是多糖复合物，即多糖与多肽或蛋白质以共价键结合的形式存在，其具体组成有待进一步研究。

2.4 WPRA的红外光谱表征

红外光谱采用KBr压片法：WPRA与KBr按照1:100(m/m)比例混合研磨，测量其在450～4000cm-1波数范围内的谱图，结果见图5。从图5可以看出，WPRA具有一般多糖的特征吸收峰(3362、2928、2878、1632、1575、1451、1330、1219、1141、1026、984、938、874、818、648、597cm-1和464cm-1)。其中，3362cm-1附近强宽谱带可能是缔合羟基O—H的伸缩振动引起的；2928、2878cm-1处的峰为C—H非对称伸缩振动产生的，1451cm-1峰是C—H变形振动引起的[18]；1632cm-1峰为仲酰胺羰基C—O伸缩振动峰，597cm-1的峰为仲酰胺羰基面外弯曲振动峰，1575cm-1附近的强峰是仲酰胺C—N—H弯曲振动引起的，1330cm-1处的峰为仲酰胺C—N伸缩振动与N—H弯曲振动的混合峰[19]，上述分析说明该多糖中含有大量的酰胺键，且为仲酰胺，从而确定其含有多肽或蛋白质。在1026cm-1附近的强宽吸收带可归属为糖环骨架振动和羟基振动，由于杂合了糖环上C—O—C醚键的C—O伸缩振动，使吸收峰变宽，该处吸收谱带是糖类的特征吸收峰[18]；938cm-1处的峰是呋喃糖环的对称伸缩振动引起的，874cm-1和818cm-1的峰归属为呋喃糖分子中—CH2的横向振动和C—H键的变角振动[1]。综上分析可知，本实验提取的WPRA为呋喃型多糖，结合紫外光谱可以判断该多糖可能是以共价键与多肽或蛋白质连接的糖复合物。

图 5 WPRA的红外光谱图

Fig.5 Infrared spectra of crude and deprotenized polysaccharides

2.5 抗氧化活性

2.5.1 WPRA对DPPH自由基的清除作用

由图6可知，在实验研究范围内，清除率与样品质量浓度之间存在一定的量效关系(实验过程中为了方便操作，采取量取不同体积相同质量浓度的样品，然后再通过定容来达到最终不同样品质量浓度的目的。所以实际上，仍然是质量浓度对清除率的关系)。WPRA清除DPPH自由基的EC50=394μg/mL，而VC的EC50=4μg/mL，说明WPRA清除DPPH自由基的能力不如VC，其EC50约为VC的1%。

图 6 WPRA和VC对DPPH自由基的清除作用

Fig.6 Scavenging capacity of WPRA and VC to DPPH radical

2.5.2 WPRA对O2－•的清除作用

图 7 WPRA和VC对O2¯•的清除作用

Fig.7 Scavenging capacity of WPRA and VC to superoxide anion radical

由图7可知，随着VC质量浓度的增加，清除O2－•的能力增强，其EC50=70μg/mL。而随着WPRA质量浓度的增加，清除O2－•的能力先增强，当其质量浓度为0.05mg/mL时清除率达到最大，为23.18%；再增加质量浓度，清除率又迅速下降，说明醇浸后牛蒡中的多糖可以清除O2－•，但是清除能力很弱，而且远弱于VC。

2.6 抑菌活性实验

抑菌实验发现，在牛津杯外径处几乎没有透明抑菌圈产生，说明醇浸后牛蒡根中提取出来的水溶性多糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌几乎没有抑制作用。

3 结 论

通过单因素和正交试验确定了从醇浸牛蒡根中提取水溶性多糖的最佳工艺条件，即料液比1:25、在85℃水浴中提取2.5h、提取2次，提取率为8.43%。产品经紫外、红外光谱表征，证明为含有肽键的糖复合物。

生物活性实验表明WPRA对DPPH自由基具有一定的清除作用，对O2－•清除能力很弱，对3种受试菌株没有表现出抑制作用。分析原因，可能是80%酒精浸泡牛蒡根的时候，把大部分醇溶性多糖、多酚、黄酮类化合物等活性成分萃取出来；同时证明，醇浸后牛蒡根中的水溶性多糖的抗氧化活性及抑菌活性较差。

参考文献：

[1] 郝林华, 陈磊, 仲娜, 等. 牛蒡寡糖的分离纯化及结构研究[J]. 高等学校化学学报, 2005, 26(7): 1242-1247.

[2] 张晓伟, 孙爱东, 宫玮. 牛蒡的营养价值及开发现状[J]. 中国食物与营养, 2006, 12(1): 25-27.

[3] 魏东. 牛蒡抗氧化、降血脂保健功能研究[J]. 食品科学, 2008, 29(2): 380-382.

[4] CHAN Y S, CHENG Longni, WU Jianhong, et al. A review of the pharmacological effects of Arictium lappa (burdock)[J]. Inflammopharmacol, 2011, 19(5): 245-254.

[5] PREDES F S, RUIZ A L, CARVALHO J E, et al. Antioxidative and in vitro antiproliferative activitiy of Arctium lappa root extracts[J]. Complementary & Alternative Medicine, 2011, 11(25): 1-5.

[6] 李竹英, 毛绍春, 李聪. 不同海拔高度牛蒡根营养成分分析[J]. 中国蔬菜, 2008, 7(1): 22-24.

[7] CHEN Fuan, WU Anbang, CHEN Chauyang. The influence of different treatments on the free radical scavenging activity of burdock and variations of its active components[J]. Food Chemistry, 2004, 86(4): 479-484.

[8] 魏东, 王连翠. 牛蒡根的研究进展[J]. 安徽农业科学, 2006, 34(15): 3716-3717.

[9] 曹泽虹, 李勇, 董玉玮, 等. 牛蒡菊糖提取工艺研究[J]. 食品科学, 2009, 30(18): 202-205.

[10] 唐仕荣, 刘全德, 苗敬芝, 等. 两种微波辅助法萃取牛蒡多糖[J]. 食品科学, 2009, 30(18): 102-105.

[11] 孟江, 周毅生, 廖华卫. 鱼腥草多糖活性炭脱色工艺研究[J]. 食品与发酵工业, 2009, 35(2): 112-115.

[12] 勾明明, 刘梁, 张春枝. 采用DPPH法测定26种植物的抗氧化活性[J]. 食品与发酵工业, 2010, 36(3): 148-150.

[13] 孙杰, 王艳杰, 朱路英, 等. 石花菜醇提物抑菌活性和抗氧化活性研究[J]. 食品科学, 2007, 28(10): 53-56.

[14] 吐尔干乃义•吐尔逊, 热衣木•马木提, 阿不都拉•阿巴斯. 中国树花中地衣多糖的抗氧化活性研究[J]. 食品与发酵工业, 2009, 35(11): 119-121.

[15] 许瑞波, 曹晓英, 王明艳, 等. 睡莲叶黄酮的提取及其抑菌活性研究[J]. 食品科技, 2009, 21(4): 190-192; 197.

[16] 谢建华, 谢明勇, 聂少平, 等. 青钱柳多糖提取工艺的研究[J]. 食品科学, 2007, 28(10): 188-191.

[17] 魏兆军, 胡海梅, 柏晓辉, 等. 桑葚多糖提取工艺的优化[J]. 食品科学, 2007, 28(11): 261-264.

[18] 何晋浙, 邵平, 孟祥河, 等. 灵芝多糖的结构特征分析[J]. 分析化学, 2010, 38(3): 372-376.

[19] 邓芹英, 刘岚, 邓慧敏. 波谱分析教程[M]. 北京: 科学出版社, 2003: 60-63.