基于罗丹明B磺酸钠脂质体生物传感器检测免疫球蛋白

严喜鸾1，肖 竦2，曾哲灵1,3,*

(1.南昌大学环境与化学工程学院，江西 南昌 330031；2.贵阳医学院化学教研室，贵州 贵阳 550004；

3.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047)

摘 要：目的：基于罗丹明B磺酸钠负载的荧光脂质体构建生物传感器，实现对人免疫球蛋白(hIgG)的高灵敏分析检测。方法：以磁性微球作为分离和富集载体，采用薄膜水化法将荧光物质罗丹明B磺酸钠盐(SRB)包裹在脂质体的内水相中，结合免疫夹心反应模式，构建基于荧光脂质体的人免疫球蛋白生物传感器；免疫反应结束后，加入无水乙醇破脂质体膜，从而瞬间释放出脂质囊内的大量SRB分子，实现对hIgG抗原的高灵敏度荧光分析。考察SRB脂质体在10d内的稳定性，优化磁性微球和生物素化抗体用量等条件。结果：荧光脂质体稳定性较好，hIgG的测定线性范围为1～200ng/mL，最低检出质量浓度为1ng/mL(即6.25pmol/L)。结论：该方法无需标记、快速、简便、灵敏，为免疫球蛋白的高灵敏度检测提供了一种新途径。

关键词：脂质体；磁性微球；免疫球蛋白；生物传感器；荧光分析

Detection of Human IgG with Biosensor Based on SRB-Encapsulated Liposomes

YAN Xi-luan1，XIAO Song2，ZENG Zhe-ling1,3,*

(1. School of Environment and Chemical Engineering, Nanchang University, Nanchang 330031, China；

2. Chemistry Teaching and Research Section, Guiyang Medical College, Guiyang 550004, China；

3. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Abstract：Purpose: To fabricate a biosensor based on sulforhodamine B sodium salt (SRB)-encapsulating liposomes for highly sensitive detection of human IgG (hIgG). Methods: An immunoliposome encapsulating SRB was prepared and used to develop a fluorescent biosensor by the film dispersion method. Magnetic beads (MB) were employed as the immobilization and separation carrier. By enzyme-linked immunospecific assay (ELISA) method, MB modified anti-IgG antibodies were linked to SRB-encapsulating liposomes, which instantaneously released a great quantity of SRB molecules upon alcohol addition, resulting in highly sensitive fluorescent detection of hIgG. SRB-encapsulating liposomes had good stability in 10 days. The optimized condition was as follows: 60 μg of MB modified anti-IgG antibody and 0.2 μg of biotin-labeled anti-IgG antibody Results: The lowest detectable concentration of hIgG was 1 ng/mL (6.25 pmol/L), and the linear range was 1 to 200 ng/mL. Conclusions: This lable-free protocol can provide a rapid, simple and sensitive approach to detecting IgG.

Key words：liposomes；magnetic beads；immunoglobulin；biosensor；fluorescent analysis

中图分类号：Q511 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)18-0141-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201318028

脂质体是由磷脂双分子层构成的具有内水相核的脂质微囊，形状多为球形，膜壁厚度约为5～7nm，囊的直径一般在25～500nm之间[1-5]。脂质体因制备工艺简单，无免疫抑制作用，在非共价结合的情况下装载上万个信号分子，使其稳定性增加和非特异性吸附干扰降低。此外，溶解脂质体膜时，可瞬间释放大量信号分子，极大提高分析灵敏度。因此，脂质体作为放大载体在生物免疫分析中的研究已成为目前热点之一[6-9]。Zheng Yue等[6]将酶活性物质如辣根过氧化物酶包入免疫脂质体，当免疫脂质体与抗原结合后，通过改变脂质体膜通透性释放出辣根过氧化物酶，与脂质体外面的酶底物反应而实现抗原的含量检测；Egashira等[7]在将电化学物质钌复合物包裹在脂质体内，成功检测了真实样品中流感病毒感染后红细胞凝集素的含量变化。罗丹明B磺酸钠盐(sulforhodamine B sodium salt，SRB)是一种以氧蒽酮为母体、水溶性较好的荧光染料，荧光量子产率高、激发波长较长、适用的pH值范围宽，故在生物分析和DNA测序中已有广泛的应用[10-11]。

磁性微球是指微米级的超顺磁性颗粒。在生物分离中，针对要进行分离的物质如底物、抗体、蛋白质、特殊细胞等的特征，可对磁性微球进行功能性修饰，使之能很快结合在分离物质的表面，在外加磁场中有较强的磁响应，能被磁场吸引从而达到分离的目的；当除去外加磁场后，又可以均匀地分散在溶液中。故磁性微球在食品生物分析领域中具有极大的应用潜力[12-14]。

大量研究证明，口服外源性免疫球蛋白具有预防肠道疾病，调节免疫等功效，还可医治因肠道致病菌或因病毒引起的腹泻等症。因此，对免疫球蛋白进行开发应用于食品中受到科技工作者的普遍重视，近年来已成功开发出多种口服免疫球蛋白的功能性食品添加剂，这对于改善中老年及免疫力低下人群的健康具有重要意义。另外，有研究表明免疫球蛋白对龋齿有预防和治疗的作用，且已用于牙膏、口香糖等产品的生产中。由于免疫球蛋白含量所占比重较少，质量问题也随之产生，故产品中免疫球蛋白含量的高灵敏检测一直是亟待解决的问题。本实验利用微米级的磁性微球作为分离和富集载体，以包裹SRB的荧光脂质体作为检测标记物，采用酶联免疫反应模式针对免疫球蛋白中主要成分hIgG建立一种高灵敏度的荧光免疫分析技术，以期实现对hIgG的高灵敏度检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

DSPE-PEG2000-Biotin 美国Avanti公司；Sepharose CL-4B交联琼脂糖凝胶(分析纯) 瑞典Pharmacia公司；氢化大豆卵磷脂 德国Degussa公司；二硬脂酰磷脂酰甘油 德国Lipoid公司；山羊抗人抗体修饰磁性微球(1.6μm，5mg/mL) 德国Qiagen公司；罗丹明B磺酸钠盐、生物素化羊抗人抗体(1mg/mL)、hIgG、链霉亲和素(1mg/mL) 美国Sigma公司；牛血清白蛋白 上海爱紫特公司；Sephadex G-50葡聚糖凝胶(分析纯) 中国医药集团上海化学试剂公司；实验用水为Milli-Q高纯水。

1.2 仪器与设备

F-300型荧光分析仪 日本日立公司；NicompTM 380ZLS型纳米粒度及Zeta电位分析仪 美国PSS Nicomp公司；脂质体挤压器 美国Avanti公司；R系列旋转蒸发器 上海申生科技有限公司；HZ-9211K恒温振荡器 中国太仓市科教器材厂；Milli-Q基础型纯化水装置 美国Millipore公司；磁座分离器 美国Invitrogen公司；CM120型透射电镜 荷兰Philips公司。

1.3 方法

1.3.1 SRB脂质体的制备

精密称取物质的量比为10:1的氢化大豆磷脂与胆固醇置于50mL 茄形瓶中，加入2mL氯仿，另加入少量的二硬脂酰磷脂酰甘油的甲醇液，超声溶解，置于茄形瓶；60℃条件下经减压旋转蒸发使之在瓶内壁上形成均匀的透明脂膜，氮气吹干，真空干燥2h；加入SRB的磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.2)，60℃条件下恒温旋转，使脂膜完全脱落，60℃条件下超声水化分散；分别通过0.45µm微孔滤膜3次和0.2µm微孔滤膜11次进行整粒；经Sephadex G-50柱除去磷脂碎片和游离的SRB分子，得到粒径为200nm左右的小单室脂质体；将脂质体和生物素化功能材料(DSPE-PEG2000-Biotin)在37℃条件下孵育12h，制备成生物素化SRB脂质体；4℃条件下保存，备用。

1.3.2 SRB脂质体粒径和Zeta电位的考察

取少量制备好的SRB脂质体溶液，高纯水稀释200倍，转移至测量杯(1cm×1cm，4cm)，用粒度电位分析仪进行粒径测定。Zeta电位测定：SRB脂质体溶液用高纯水稀释200倍, 用粒度电位分析仪测定其Zeta电位。测定参数为He-Ne激光；测定角度90°；温度23℃；黏度0.996cP；折光系数1.333。

1.3.3 SRB脂质体稳定性的考察

取制备好的SRB脂质体少量，平均分成10管，置于24℃条件下保存，每天取1管，通过Sephadex G-50柱去除泄漏的游离SRB小分子(过柱前加入空白脂质体，使Sephadex G-50柱预饱和以消除填柱材料对脂质体吸附造成的误差)，用荧光法测定考察其泄漏程度。

1.3.4 SRB脂质体生物传感器的制备

将一定量的生物素化SRB脂质体与链霉亲和素(1mg/mL，1:500稀释倍数)混合于PBS液中，置25℃的恒温振荡器中反应30min，为消除填柱材料对脂质体的影响，在过柱前加入空白脂质体，经Sepharose CL-4B柱去除游离的链霉亲和素分子，收集连接有链霉亲和素的SRB脂质体。

取360μg磁性微球置小管中，100μL的PBS吐温洗涤液进行3次洗涤，磁座分离，吸去上清液；再加入100μL含有10%牛血清白蛋白的PBS液；在37℃条件下进行封闭反应30min；重复磁座洗涤，平均分成6管，吸去上清液，分别将不同质量浓度的hIgG(0、1、10、50、100、200ng/mL)PBS液100μL加入，37℃中反应1h，重复洗涤，加入生物素化抗体在37℃条件下反应1h，经洗涤后，将连接有链霉亲和素的SRB脂质体PBS液(每管100μL)加入，24℃条件下进行酶联免疫反应1h，使SRB脂质体连接在磁性微球上，用200μL的PBS液对磁性微球进行3次洗涤，磁座分离，吸去上清液，即制备好SRB脂质体生物传感器。

1.3.5 荧光检测

SRB在乙醇中为强荧光物质，在一定浓度时，荧光强度与SRB浓度呈正比：

If＝Kc

式中：If为荧光强度；K为发光系数；c为SRB浓度/(nmol/L)。

测定一系列浓度的SRB乙醇液荧光强度，每管中加入同样量的空白脂质体(假设磷脂材料在制备过程中没有损失)以消除影响，SRB浓度范围为0.425～16.163nmol/L，以荧光强度F为纵坐标对SRB浓度S做标准曲线，得线性回归方程F=33.855S＋6.7501，R2=0.9995，测量条件：λex=554nm；λeM=569nm；狭缝10nm。

取制备好的SRB脂质体生物传感器，用无水乙醇溶解，脂质体破膜释放出来内水相中大量的SRB分子，包封在脂质体的内水相中大量SRB分子故而释放出来，通过磁座分离弃去磁性微球，收集富含释放出SRB分子的上清液，重复3次，合并定容在1mL，用荧光分析仪进行检测。基于SRB脂质体的荧光免疫检测hIgG原理图见图1。

图 1 基于SRB脂质体的荧光免疫检测hIgG原理图

Fig.1 Schematic representation of fluorescence detection of hIgG based on SRB liposomes

2 结果与分析

2.1 SRB脂质体表征

在透射电镜下观察经1%磷钨酸染色的SRB脂质体，可见其脂质双分子层规整、均一、连续，呈椭圆形或圆形球体(图2)。取高纯水稀释200倍的SRB脂质体溶液，用粒度电位分析仪进行粒径测定和Zeta电位测定，平行测定6次，SRB脂质体的平均粒径为(201.4±12.1)nm，Zeta电位为(－12.4±2.9)mV，结果表明，SRB脂质体粒径分布均一性较好(图3)。

a

800nm

b

200nm

图 2 透射电镜下SRB脂质体的形态结构

Fig.2 Morphology of SRB-encapsulating liposomes examined by transmission electron microscope (TEM)

图 3 SRB脂质体的粒径分布图

Fig.3 Size distribution by intensity of SRB-encapsulating liposomes

2.2 SRB脂质体稳定性分析

表 1 SRB脂质体稳定性分析

Table 1 Stability analysis of SRB-encapsulating lipsomes

由表1可知，SRB脂质体在前3d无明显泄漏，7d内SRB的泄漏率不到5%，说明该脂质体稳定性好，这为酶联免疫实验的重复性提供了保障。

2.3 免疫反应条件的优化

图 4 山羊抗人抗体修饰的磁性微球用量对荧光强度的影响

Fig.4 Fluorescence intensity versus the amount of MB modified

anti-IgG antibody

首先考察山羊抗人抗体修饰的磁性微球用量，选择其用量分别为15、30、45、60μg和75μg进行平行实验。由图4可知，在减去未加抗原的相应空白值后，60μg的磁性微球的荧光响应值比其他用量的荧光响应值高，故选择60μg作为最佳的磁性微球用量。

图 5 生物素化抗体的用量对荧光强度的影响

Fig.5 Fluorescence intensity versus the amount of biotin-labeled

anti-IgG antibody

其次，详细考察生物素化抗体的用量(0.02、0.05、0.1、0.2、0.4μg)对荧光信强度的影响，如图5所示。开始随生物素化抗体用量的增加，荧光强度也随之增加，当用量为0.1～0.2μg时，荧光信号增长趋势较缓，但超过0.2μg时荧光强度反而下降，这可能是过多的抗体不利于与脂质体上链霉亲和素的反应，从而导致荧光强度的降低。故选择0.2μg的生物素化抗体用量进行后续实验。

此外，对两步有关生物素与链霉亲和素结合反应的时间进行了考察。生物素化SRB脂质体与链霉亲和素反应时间分别为30、45、60、90min，将所得的4个荧光强度进行比较，无明显差别；当结合了链霉亲和素的脂质体与已连接在磁性微球上的生物素化抗体进行反应，60min时得到的信号响应值最大，所以这两步结合反应的时间分别选定为30min和60min。同时也对链霉亲和素用量(1mg/mL，100μL)进行考察，其稀释度在1:200～1:500之间的改变对测定结果均无明显差别，但当稀释度在1:1000时，荧光响应值开始下降，故选择稀释度为1:500的链霉亲和素用量进行实验。

2.4 线性与精密度

在选定的条件下，按图1的实验方法进行目标物hIgG的荧光检测。结果目标物hIgG的质量浓度在1～200ng/mL范围内，荧光强度呈线性增加(y=1.432x＋21.454，R2＝0.9952)，当hIgG的质量浓度超过200ng/mL，荧光信号呈S线态势，偏离工作曲线，且较高质量浓度的hIgG难以获得检测线性关系，原因可能是当检测物hIgG的质量浓度较大时，其所连接的SRB脂质体量也多，从而释放过多SRB分子产生荧光猝灭，线性关系受到破坏。用同一批制备的脂质体进行实验，重复测定6次，相对标准偏差为4.26%。

2.5 人血清中hIgG的检测

取正常人血清用PBS(pH7.2)稀释一定的倍数(约1×105倍)，进行hIgG的含量检测，测量结果均在人血清中hIgG含量的正常范围内(8～14g/L)，用标准加入法测定其回收率。结果表明，本方法在实际样品的检测中具有一定的可行性(表2)。

表 2 人血清中hIgG的检测结果

Table 2 Determination results of hIgG in human serum using the proposed immunosensor

表 3 IgG的最低分析检测值比较

Table 3 Comparison of the immunoassay methods developed for IgG

注：hIgG的测定线性范围为1～200ng/mL；最低检出质量浓度为1ng/mL(即6.25pmol/L)。

3 结论与讨论

本实验构建了基于磁性微球载体上的脂质体荧光免疫传感器，在继承传统免疫传感器的的基础上，应用脂质体能包埋大量信号物质SRB荧光分子的特性，通过磁性微球预先将未与抗体(或抗原)结合的脂质体分离，再采用化学试剂无水乙醇溶胞法溶解脂质体，避免了非特异性吸附的干扰，极大提高了荧光测定hIgG的灵敏度。

实验结果能在相对较大的检测范围得到较低的检测质量浓度，灵敏度较好。在该实验中发现，磷脂材料用量对SRB荧光检测结果没有明显影响；负载于脂质体内SRB的加入浓度为30mmol/L，接近其在磷酸盐缓冲液的饱和浓度，相对于浓度20mmol/L与10mmol/L的SRB脂质体的免疫检测结果较佳，最低检测质量浓度可达1ng/mL；对于破膜剂而言，无水乙醇比Triton X-100具有更加良好的荧光检测SRB结果；使用一周前制备好SRB脂质体进行实验，结果表明也能检测到质量浓度为1ng/mL的hIgG，而且荧光强度与hIgG质量浓度呈良好线性关系。随着今后脂质体结合新手段的研发以及新型信号物质的研制，脂质体作为放大的免疫传感器将更为广泛地应用于环境和食品中痕量物质的监测。

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