莱克多巴胺人工抗原的合成与鉴定

邓发亮，刘晓云，唐时幸，王继华

(广州万孚生物技术股份有限公司，广东 广州 510663)

摘 要：为合成新的、稳定的莱克多巴胺人工抗原，对莱克多巴胺结构进行修饰，合成带羧基基团的莱克多巴胺半抗原，经碳二亚胺法与载体BSA蛋白偶联制备莱克多巴胺人工抗原，采用紫外光谱扫描法、蛋白质电泳法和胶体金免疫层析法检测偶联物。莱克多巴胺半抗原的结构经气相质谱联用仪确证。结果表明：莱克多巴胺人工合成抗原连接成功，与抗莱克多巴胺抗体有特异性反应，具有抗原性。该方法合成的莱克多巴胺人工抗原结构未见报道、稳定性优越，可作为莱克多巴胺免疫检测方法中包被抗原用于莱克多巴胺检测，也可作为免疫源性抗原用于制备抗莱克多巴胺抗体。

关键词：莱克多巴胺；半抗原；人工抗原；免疫检测

Synthesis and Identification of Stable Artificial Ractopamine Antigen

DENG Fa-liang，LIU Xiao-yun，TANG Shi-xing，WANG Ji-hua

(Guangzhou Wondfo Biotechnology Co. Ltd., Guangzhou 510663, China)

Abstract：A novel and stable artificial ractopamine hapten with the active group carboxyl group was designed and synthesized by chemical modification, and linked to bovine serum albumin through ethyl carbodiimide hydrochloride method to form artificial ractopamine antigen. The conjugation was confirmed by UV scanning method and protein electrophoresis. The binding reaction of the artificial ractopamine antigen with anti-ractopamine antibody was verified by gold immunochromatography assay. The ractopamine hapten was characterized by gas chromatography-mass spectrometry. The ractopamine-BSA conjugation was stable and active for at least 6 months at 4 ℃. Our results indicate that ractopamine-BSA can be successfully synthesized by the above method, and can be used as coating antigen in immunoassay for ractopamine detection. In addition, we found that the synthesized antigen could be used as an immunogen to produce anti-ractopamine antibody.

Key words：ractopamine；hapten；artificial antigen；ractopamine；immunoassay

中图分类号：TS202.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)18-0146-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201318029

莱克多巴胺(ractopamine，RAC)是化学合成苯乙醇胺类β-兴奋剂中的一种，临床上曾用于治疗支气管哮喘、慢性支气管炎和肺气肿等疾病。与其他β-兴奋剂一样，当莱克多巴胺的用量达到临床用量的5～10倍时，具有促进营养重分配、促进家禽肌肉生长、降低脂肪含量、增加瘦肉产量等作用[1-2]。但实验证明莱克多巴胺会在动物脏器中蓄积残留，可通过食物链进入人体，将对食用者的安全带来隐患[3-5]。目前，我国已经禁止生产和销售莱克多巴胺，但非法使用的现象依然存在。

经过十几年的发展和实践，免疫检测法已被广泛应用于各类毒物和毒品等小分子物质的检测[6]。与常用的兽药残留检测方法，如微生物法和仪器检测法[7]相比，免疫检测法具有操作简便、高效、灵敏、特异、适合大规模检测等优点。

免疫学检测方法的建立，首先必须获得结构稳定、具有免疫源活性的莱克多巴胺全抗原[8]。莱克多巴胺全抗原的合成多是在盐酸莱克多巴胺的酚羟基位点进行改造，目前常用的合成方法有3种：方法1[9-13]是通过酸酐(戊二酸酐或丁二酸酐)作为连接臂，一端与莱克多巴胺的酚羟基形成酯键，和另一端与载体蛋白的氨基形成酰胺键，制备含酯键的莱克多巴胺人工抗原(图1)。该类抗原因酯键远离载体蛋白，容易受环境的影响而降解，因此其稳定性较差；方法2[14-16]是使用1,4-丁二醇二缩水甘油醚等连接臂，一端与小分子的酚羟基成醚，另一端在载体蛋白的氨基上氮烷基化，形成含醚键的莱克多巴胺人工抗原(图2)。单从结构的角度上考虑，醚键不易受环境pH值和离子强度的影响，其稳定性优于酯键，但报道的连接臂存在长度和性质不稳定等因素；方法3[15, 17]是在莱克多巴胺的苯环上进行改造，采用对氨基苯甲酸将莱克多巴胺与载体蛋白偶联形成含重氮键的莱克多巴胺人工抗原(图3)。重氮法方案的缺点是选择性差，副反应多且产物难以纯化分离，从而影响全抗原的纯度；莱克多巴胺酚羟基可被氧化剂氧化形成醌式结构，在对氨基苯甲酸重氮化过程中，具有氧化性的亚硝酸只要稍过量，将破坏莱克多巴胺的结构；最后，抗原中的重氮键易受环境的影响，发生氧化、还原反应而断裂。

本实验在方法2的基础上选择合适长度和稳定的连接臂，以期保证抗原在结构上稳定以及后期抗体制备时筛选出针对莱克多巴胺的特异性抗体，为莱克多巴胺残留免疫学检测方法的建立提供人工合成抗原。图4为本实验的莱克多巴胺人工抗原的合成路线。

图 1 含酯键的莱克多巴胺人工抗原

Fig.1 Artificial ractopamine antigens containing ester bonds

图 2 含醚键的莱克多巴胺人工抗原

Fig.2 Artificial ractopamine antigens containing ether bonds

图 3 含重氮键的莱克多巴胺人工抗原

Fig.3 Artificial ractopamine antigens containing diazo bonds

图 4 本实验莱克多巴胺人工抗原合成路线

Fig.4 Synthetic scheme of ractopamine antigen

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

盐酸莱克多巴胺(RAC) 上海晶纯试剂有限公司；抗莱克多巴胺抗体 广州万孚生物技术股份有限公司；4-溴丁酸乙酯、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、三乙胺、三氯甲烷、乙酸乙酯 广州化学试剂厂；牛血清白蛋白(BSA，MW 67000)、1-乙烷基-3-(3-二甲基胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

7890A-5975C气相-质谱联用仪 美国Agilent公司；UV-1601紫外分光光度计 日本岛津公司；DYY-Ⅲ型垂直电泳槽 北京六一仪器厂；GL20-C型高速冷冻离心机 中科院武汉科学仪器厂；DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱、SCZL-A型磁力搅拌器 河南巩义予华仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 莱克多巴胺人工抗原的制备

1.3.1.1 莱克多巴胺半抗原的合成

称取盐酸莱克多巴胺68mg(约0.2mmol)，置于25mL单口瓶中，加入DMF 5mL，搅拌溶解；加入无水碳酸钾固体69mg(0.5mmol)，混匀；10min后，加入4-溴丁酸乙酯32µL(约0.22mmol)，加干燥管隔绝外界水汽，控温55～60℃，搅拌反应6h，TLC法跟踪反应进程。反应完毕后，冷却至室温，加入冰水20mL搅拌均匀，用乙酸乙酯10mL萃取3次，合并有机相；用饱和食盐水20mL、水20mL各洗涤1次，收集有机相。无水硫酸钠干燥2h，过滤，减压回收溶剂，得浅黄色油状物80mg。

将上述浅黄色油状物溶于3mL无水乙醇中，加入饱和氢氧化锂溶液，室温搅拌反应3h。反应完毕，加入冰水30mL，搅拌均匀，用1mol/L 盐酸调pH6～6.5，用三氯甲烷10mL萃取3次，合并有机相，经洗涤，干燥，减压回收溶剂得莱克多巴胺半抗原62mg。半抗原的结构经气相色谱-质谱联用(gas chromatograph-mass spectrometry，GC-MS)仪确证。

1.3.1.2 莱克多巴胺人工抗原合成

取莱克多巴胺半抗原12mg(0.031mmol)，溶于DMF 1.0mL中，加入EDC 0.03mmol、NHS 0.03mmol，于4℃搅拌活化4h，加入预先准备的BSA 24mg溶于3mL PBS(0.05mol/L，pH6.0)的溶液，室温搅拌反应24h。之后于蒸馏水中透析3d，换液3次，高速冷冻离心机离心，收集上清液，得莱克多巴胺人工抗原(RAC-BSA)。

1.3.2 莱克多巴胺半抗原GC-MS分析

该检测工作委托广州正孚检测技术有限公司完成。

1.3.3 莱克多巴胺人工抗原的鉴定

1.3.3.1 紫外光谱法

用0.01mol/L PBS(pH7.4)将蛋白质BSA、RAC-BSA和RAC半抗原配成0.5mg/mL待用，用0.01mol/L PBS(pH7)在波长190～400nm范围内进行基线平衡。然后分别对BSA、RAC-BSA和RAC半抗原进行扫描，记录各波段波长扫描OD值，绘制曲线观测结果，推测莱克多巴胺半抗原与BSA是否偶联成功[18-19]。

1.3.3.2 蛋白质电泳

参考文献[20]进行操作，下胶用10%聚丙烯酰胺，上胶用5%聚丙烯酰胺，上样量20μg。

1.3.4 莱克多巴胺人工抗原抗原性检测

利用胶体金免疫层析法(竞争法)对莱克多巴胺人工抗原进行抗原性检测。用喷膜机将合成的莱克多巴胺抗原喷到硝酸纤维素膜上，以抗莱克多巴胺抗体标记胶体金，结合玻璃纤维纸及吸水纸，组装成莱克多巴胺快速检测试纸条[21]，对试纸条进行检测。

1.3.5 胶体金免疫层析法(竞争法)评估莱克多巴胺人工抗原稳定性

本公司购买过多个厂家的莱克多巴胺人工抗原制备莱克多巴胺快速检测试纸条，但都无法通过常温或破坏稳定性实验，究其原因，是人工抗原的稳定性差。因此考察莱克多巴胺人工抗原的稳定性意义重大。

取1批具有抗原性的莱克多巴胺人工抗原(溶液)，用10mL带盖的离心管盛装，于冰箱4℃冷藏保存，间隔1个月从中取出部分抗原用于包被，制成胶体金试纸条，检测其灵敏度和特异性的变化，以评估抗原在4℃条件下的稳定性。

2 结果与分析

2.1 莱克多巴胺半抗原衍生化后GC-MS图谱解析

图 5 莱克多巴胺半抗原衍生化后的总离子峰图(A)和

24.455min离子峰裂解图(B)

Fig.5 GC－MS analysis of ractopamine hapten derivatized with trimethylchlorosilane under optimized conditions

从图5可以看出，莱克多巴胺半抗原不纯；经分析，24.455min组分的结构为本实验设计的莱克多巴胺半抗原的结构。

2.2 紫外扫描图谱

图 6 RAC-BSA、BSA和RAC半抗原紫外扫描图谱

Fig.6 UV spectra of RAC-BSA, BSA and RAC hapten

由图6可知，在波长260～300nm范围内，RAC-BSA在276nm波长处有最大吸收峰，OD值约为0.569，与BSA(OD值为0.35)和RAC半抗原(OD值为3.073)的特征吸收峰有明显区别，鉴于这一结果可推测RAC半抗原与BSA偶联成功[19]。

2.3 莱克多巴胺人工抗原电泳图谱

1.莱克多巴胺人工抗原；2.Marker蛋白。

图 7 莱克多巴胺人工抗原蛋白质电泳图

Fig.7 SDS-PAGE of RAC–BSA conjugate

由图7可知，莱克多巴胺人工抗原的分子质量比BSA蛋白的稍大，说明载体蛋白连接了莱克多巴胺小分子，进一步证实莱克多巴胺与蛋白偶联成功；同时表明合成的莱克多巴胺人工抗原的纯度高。

2.4 抗原抗原性检测

将RAC-BSA用作包被抗原，组装成莱克多巴胺快速检测试纸条，对阴性、阳性样本进行检测，结果如图8所示。

T.测试线；C.标准线；N-17、N-63、N-68为正常猪的尿液属阴性样本；阳性标准液3ng/mL和5ng/mL的配制，是在阴性样本中添加一定量莱克多巴胺标准品；C4、C8+、B等表示检测区域(T)紫红色条带的显色深、浅程度，分为10个梯度，用C1～C9和B(空白)表示，每个梯度显色程度都有相对应的标准色卡，显色最深为C1，不显色为B，“＋”表示显色程度浅介于两个梯度之间。

图 8 莱克多巴胺快速检测试纸条的阳性(A)和阴性(B)结果

Fig.8 Positive and negative results from rapid ractopamine test strip

由图8A可知，检测3组阴性样本时，试纸条检测区域均出现紫红色色带，且深、浅程度均一，表明制备的RAC-BSA与广州万孚生物技术股份有限公司提供的抗RAC抗体可特异性地结合，具有抗原性；图8B中试纸条检测3ng/mL的阳性样本时，检测区域出现较浅紫红色色带，检测5ng/mL的样本时，检测区域未出现紫红色色带，呈阳性结果，说明该快速检测试纸条的灵敏度约为5ng/mL。

2.5 莱克多巴胺人工抗原4℃放置稳定性

在指定的日期，将4℃放置的莱克多巴胺人工抗原用作包被抗原，组装成莱克多巴胺快速检测试纸条，检测其特异性和灵敏度，结果如表1所示。

表 1 莱克多巴胺人工抗原4℃放置稳定性实验结果

Tabble 1 The stability of RAC-BSA conjugate at 4 ℃

由表1可知，检测区域显色深度相差半个梯度，无明显差别，表明半年间莱克多巴胺快速检测试纸条的特异性和灵敏度无明显变化，其稳定性优。所以，在忽略抗莱克多巴胺抗体稳定性变化的条件下，RAC-BSA的稳定性优，在4℃保存的保质期大于6个月。

3 结 论

Wie等[22]认为，引入长度合适的连接臂有助于半抗原结构的暴露和特异性抗体的产生，连接臂过长易被细胞识别而产生“桥抗”，连接臂过短则载体蛋白的空间位阻将影响细胞对半抗原的识别，不产生特异性抗体，最好的间隔臂是3～6个直链碳，长度以5～8Å为宜。本实验选择区别文献报道方法合成含醚键和合适长度连接臂的RAC抗原，即保证了RAC抗原保存和使用过程中的稳定性，又使莱克多巴胺分子的特征结构远离偶联位点(—COOH)，与载体蛋白偶联后，不易受载体蛋白空间位阻的影响。

本实验合成的RAC半抗原结构经GC-MS确证，虽然半抗原的纯度不高，但经过后处理，杂质中不含带羧基的物质，不参与偶联反应，在透析过程中被除去，保证了RAC人工抗原的纯度。

设计合成具有抗原性的RAC人工抗原是制备抗RAC抗体和建立RAC免疫检测方法的前提。RAC人工抗原的结构相当大程度上决定了由其免疫动物产生的抗RAC抗体的性质和自身的稳定性，RAC人工抗原的稳定性又将影响RAC免疫检测方法的实施和推广。本实验合成的RAC人工抗原具有很好的抗原性和稳定性，此外，该RAC人工抗原也可用作免疫原，用于抗RAC抗体的制备。

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