高效液相色谱串联质谱法同时测定蜂王浆中氟胺氰菊酯、三唑醇和蝇毒磷残留

周 萍1,李英华2,胡福良3,*,赵 焕1,吴 捷4,梁世君4

(1.杭州蜂之语蜂业股份有限公司,浙江 桐庐 311500;2.浙江经贸职业技术学院,浙江 杭州 310018;

3.浙江大学动物科学学院,浙江 杭州 310029;4.桐庐县质量计量监测中心,浙江 杭州 311500)

 

摘 要:建立一种使用高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS-MS)仪同时测定蜂王浆中的氟胺氰菊酯、三唑醇和蝇毒磷等药物残留量的方法。采用碱性条件下的乙腈萃取,并用HLB小柱净化,经HPLC-MS-MS电喷雾电离源,正离子多反应检测模式检测,外标法定量。结果表明:蝇毒磷的检出限为2μg/kg,三唑醇和氟胺氰菊酯的检出限为1μg/kg,在5~100μg/kg之间线性关系良好,相关系数均大于0.9940,对于5、10、50μg/kg水平添加回收率范围在78.9%~102.1%之间,变异系数范围在2.1%~13.6%之间。该分析方法适合蜂王浆中氟胺氰菊酯、三唑醇和蝇毒磷的同时测定,相对标准偏差和回收率测定结果符合对食品和农产品中痕量药物的测定要求。

关键词:蜂王浆;氟胺氰菊酯;蝇毒磷;三唑醇

 

Simultaneous Determination of Tau-Fluvalinate, Triadimenol and Coumaphos Residues in Royal Jelly Using

High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

 

ZHOU Ping1,LI Ying-hua2,HU Fu-liang3,*,ZHAO Huan1,WU Jie4,LIANG Shi-jun4

(1. Hangzhou Beewords Apiculture Group Co. Ltd., Tonglu 311500, China;2. Zhejiang Economic and Trade Polytechnic,

Hangzhou 310018, China;3. College of Animal Science, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China;

4. Measurement Center of Tonglu County, Hangzhou 311500, China)

 

Abstract:A method for the determination and quantification of tau-fluvalinate, triadimenol and coumaphos in royal jelly was established by HPLC-MS-MS. Tau-fluvalinate, triadimenol and coumaphos residues were extracted by acetonitrile under alkaline condition, and clean-up of the extracts was carried out using HLB solid phase extraction (SPE) column. Quantification was conducted by HPLC-MS-MS coupled with multiple reaction-monitoring (MRM) system using electron spray ionization source in an external standard mode. The detection limits for coumaphos, triadimenol and tau-fluvalinate residues were 2, 1 μg/kg and 1 μg/kg, respectively. The recovery rates of tau-fluvalinate, triadimenol and coumaphos residues at three spiked levels (5, 10 μg/kg and 50 μg/kg) in different samples were in the range of 78.9%–102.1% with relative standard deviation of 2.1%–13.6%. The linear range of detection was 5–100 μg/kg (r > 0.9940). This method can be successfully applied to the qualitative and quantitative analysis of royal jelly samples.

Key words:royal jelly;tau-fluvalinate;triadimenol;coumaphos

中图分类号:O657.63;S896.8 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2013)18-0180-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201318036

农药的广泛应用,在给人类带来增产增收利益的同时也给环境造成了严重污染,大量食用含有三唑醇等农药残留的食物会导致机体正常生理功能的失调,引起病理改变和毒性危害。因此,农药残留的问题日益受到人们的关注,动物源性食品中的农药残留检测技术研究已经成为解决贸易技术壁垒的关键所在。

氟胺氰菊酯、三唑醇和蝇毒磷等农药在农业生产中广泛应用,是蜂王浆出口日本时有明确限量要求的3种农药残留。关于农药残留检测方法已有许多报道,如气相色谱法测定蝇毒磷和氟氰胺菊酯[1-2],气相色谱质谱联用法测定食品中的三唑醇、氟氰胺菊酯[3-4],高效液相色谱质谱联用法测定蜂王浆中的氟氰胺菊酯[5-6]以及气相色谱串联质谱检测蝇毒磷[7]等。多种农药残留量同时测定方法可以提高检测效率,降低检测成本,是众多检测工作者的研究热点[8-10]。蜂王浆基质复杂,样品净化困难,目前对蜂王浆中多农药残留同时测定的检测技术研究较少[10-12],迄今为止,同时测定蜂王浆中氟胺氰菊酯、三唑醇和蝇毒磷尚未见相关文献报道。

本实验采用高效液相色谱串联质谱法检测蜂王浆样品中的氟胺氰菊酯、三唑醇、蝇毒磷3种农药残留量,研究样品的提取、净化以及分析方法并用于实际样品的检测,以期建立准确、高效的蜂王浆中氟胺氰菊酯、三唑醇、蝇毒磷3种农药残留的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

氟胺氰菊酯、三唑醇、蝇毒磷标准品(纯度>99%) 德国Dr. Ehrenstorfer公司;无水硫酸钠、氨水、正丙醇均为分析纯;甲酸为优级纯;乙腈、甲醇、乙酸铵为色谱纯;双重蒸馏水。

API3200串联四极杆质谱仪 美国ABI公司; 1200高效液相色谱仪(配有二元泵、在线脱气机、自动进样器、Analyst数据处理软件) 美国安捷伦科技公司; BS224S万分之一分析天平 德国Sartorius公司;RJ-TDL-40B低速台式大容量离心机 江苏太仓仪器设备厂;RE-52CS-1旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;HLB固相萃取小柱(200mg/6mL) 美国Waters Oasis公司。

1.2 方法

1.2.1 氟胺氰菊酯、三唑醇、蝇毒磷标准溶液的制备

按标准物质证书标示含量进行计算,分别称取标准品10mg,精确至0.0001g,于10mL容量瓶中用乙腈溶解分别定容至刻度,摇匀,则各标准品的储备液质量浓度为1000mg/L。

分别吸取氟胺氰菊酯、三唑醇、蝇毒磷标准储备液,用乙腈稀释成质量浓度为10mg/L的混合标准中间液,0.2mL分装,-18℃保存。

取混合标准中间液,用乙腈分别配制100µg/L和1000µg/L的混合标准使用液。

1.2.2 阴性样品基质混标标准曲线

分别称取5份2.0g阴性蜂王浆样品,用以制作阴性样品基质混标标准曲线,分别加100µg/L的混合标准使用液100、200、500,1000µg/L,旋涡混合3min,静置15min,标准系列含量分别为5、10、25、50µg/kg和100µg/kg。

1.2.3 质量控制

每天检测阴性样品回收率:2g王浆样品中添加质量浓度100µg/L的混合标准液200µL,以满足添加质量浓度为10µg/L的要求,回收率要求在70%~120%之间,添加标准液后应充分混合,然后静置15min,再进行样品处理。当试剂变动时对试剂进行干扰实验。

1.2.4 样品前处理

称取(2±0.02)g试样,精确至0.001g。置于50mL塑料离心管中,加入5mL水,分散均匀(干粉样品需分散至成均匀的浆状),加入300µL氨水,分散均匀,加入10mL乙腈,充分振摇提取3~5min,加入8g无水硫酸钠,充分振摇提取3~5min,6000r/min离心5min,吸取上清液于另一50mL离心管中,残渣中加入5mL乙腈,用力振摇提取1~3min,6000r/min离心5min,合并上清液,加入5mL正丙醇,40℃减压浓缩至干。加入10mL 50%乙腈超声波溶解残渣,用0.22µm膜过滤至10mL注射器,注射器与HLB固相萃取小柱连接。HLB固相萃取小柱先用5mL甲醇、5mL水活化,样液以自然速度过柱,再用3mL水洗柱,真空抽干柱子15min。用10mL乙腈洗脱,收集洗脱液,40℃减压浓缩至干,按体积比80:20加入1mL乙腈溶液溶解,溶解液用0.22µm膜过滤,待测。

1.2.5 色谱条件

经过优化的液相色谱条件:IntersiL ODS C8-3色谱柱(2.1mm×150mm,3μm);进样量20µL;流速:0.4mL/L;柱温30℃;分析时间20min;梯度洗脱,洗脱液A为含0.1%甲酸的甲醇溶液,洗脱液B为含0.1%甲酸和0.5mmol/L乙酸铵的甲醇溶液,洗脱程序见表1。

表 1 液相梯度洗脱程序表

Table 1 Gradient elution program for HPLC

序号

洗脱时间/min

体积分数配比/%

A

B

 

0

0.00

3.0

97.0

1

0.10

3.0

97.0

2

5.00

70.0

30.0

3

7.50

95.0

5.0

4

12.00

95.0

5.0

5

12.10

3.0

97.0

6

16.00

3.0

97.0

 

 

1.2.6 质谱条件

表 2 3种药物残留的质谱参考条件

Table 2 Mass spectral reference conditions for tau-fluvalinate, coumaphos and triadimenol residues

编号

英文名称

中文名称

Q1扫描/Q3扫描

DP/V

EP/V

CEP/V

Dwell/msec/V

CE/V

CXP/V

1

tau-fluvalinate

氟胺氰菊酯

503.3/208.2,181.2

40.0

10.0

29.61

70

17.0

4.4

40.0

4.4

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2

coumaphos

蝇毒磷

363.1/227.1,307.1

50.0

7.5

23.91

70

33.00

1.50

25.00

4.00

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3

triadimenol

三唑醇

296.4/70.1,99.3

21.7

5.0

21.21

70

24.0

3.0

21.7

3.0

17.0

4.4

 

注:带下划线数字为定量离子;DP.去集簇电压;EP.射入电压;CEP.碰撞入口电压;Dwell/msec.锥孔电压;CE.激发碰撞电压;CXP.碰撞室射出电压。

 

离子源:电喷雾电离(electrospray ionization,ESI)源,正离子;扫描方式:多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM);雾化气、卷帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气,离子源雾化温度200℃;辅助加热气压强60psi;干燥气压强50psi;气帘气压强10psi;碰撞气压强5psi;电喷雾电压4500.00V。其他电压值、监测离子对、定量离子对等具体条件见表2。

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件的确定

2.1.1 样品提取条件的选择

根据文献[13-15]报道,选择正己烷、丙酮、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、环己烷等有机溶剂在酸性条件下对农药进行提取,并使用固相萃取小柱进行净化。发现样品均有肉眼可见的浅黄色色素干扰,杂质较多,基质干扰大,并污染仪器和色谱柱。分析产生杂质污染仪器和色谱柱的原因是酸性条件下用有机溶剂提取易引起色素、脂肪类等杂质被大量提出,而在碱性条件下用正己烷、二氯甲烷、丙酮等溶剂进行提取,也容易有较多的色素被提出,因此后续净化效果不佳。

乙腈作为AOAC法在有机磷、有机氯、拟除虫菊酯、氨基甲酸酯类等农药的分析中所采用的一种溶剂,对油脂和色素提取较少,是目前常用的一种提取溶剂。综合蜂王浆的理化特性与文献[16-20]报道情况,选择碱性条件下乙腈提取农药残留,使蜂王浆中的酸性物质与碱反应成盐,提高其极性而不被乙腈所提取,从而提高净化效果。并且在乙腈中加入少量的正丙醇,调节乙腈的极性,增强净化效果。通过比较氨水、氢氧化钠两种碱性溶剂的反应效果,发现用氨水的效果比较理想,浓缩时更容易干燥。提取后浓缩至干,用50%乙腈溶解时样液呈无色,样品的净化程度大为改善。因此本实验采用加入氨水的乙腈和正丙醇作为提取溶剂进行提取。

2.1.2 固相萃取小柱的选择

为了提高检测限,根据文献方法及目标物质的化学性质,选择了HLB固相萃取小柱和SupeLco C18固相萃取小柱,进行固相萃取净化。结果3种农药残留均在HLB固相萃取小柱被有效提取,在仪器上产生较大的响应,达到需要的检测灵敏度。并且在净化过程中,HLB固相萃取小柱不受样液pH值的影响,具有更好稳定性,因而选择了HLB小柱作为净化柱。

2.2 液相色谱条件优化

2.2.1 色谱柱的选择

为保证不同性质的多药物残留在色谱柱上的分离效率,选用HypersiL、AkasiL、VenusiL MP、Shim-pack VP、IntersiL等型号的色谱柱,以寻找分离度好、灵敏度高、峰形窄而对称、定量离子无干扰的色谱柱。结果发现,HypersiL柱的氟胺氰菊酯色谱峰分叉,对称性不好;AkasiL柱的氟胺氰菊酯和三唑醇的色谱峰对称性均不好;VenusiL MP柱的3个峰分离度不够;Shim-pack VP柱的对称性和分离度虽然也可以达到要求,但和IntersiL C8-3相比,峰形不够尖锐,分离度稍差。在所有色谱柱中,IntersiL C8-3色谱柱的灵敏度最好,峰形尖锐,分离度好,因此本实验选择IntersiL C8-3柱作为分析柱。

2.2.2 流动相及洗脱条件的选择

为确保所测农药和杂质能够最大程度的分离,且分析周期短,不干扰农药和杂质分离的检测,分别对甲醇、乙腈作流动相的分离效果进行比较,并研究流动相中不同浓度的甲酸或乙酸对分离效果的影响,选择合适的挥发性盐类,提高离子化效率,以期获得分离良好、峰形对称、信号强度大、灵敏度高的色谱图。结果表明,采用甲醇作为流动相中的有机相,加入0.1%甲酸和0.5mmol/L的乙酸铵作为流动相的信号最强,提高了灵敏度。本实验优选出的最佳色谱条件见表1。

2.3 质谱条件的优化

配制1μg/mL各种残留标准溶液,用针泵以5μg/mL的流速进入质谱仪,以正离子模式进行Q1 MS(Q1)全扫描,确定分子离子峰,调节离子源电压、DP、EP参数,再以分子离子峰作为母离子,进行子离子扫描,调节CE参数,使母离子的强度占子离子强度的1/3~1/4为最佳,从质谱图中选择2~4个信号较强的子离子作为定性离子,离子丰度最强的子离子为定量离子,采用针泵流动注射标准溶液,手动运行RAMP进行参数优化。质谱参数确定后,连接液相色谱进样,由于各残留的离子源温度、辅助加热气、干燥气、气帘气、电喷雾电压等参数与在单纯质谱条件下发生变化,因此选择适中的一组参数在液相条件下进行再优化,进样5µg/kg的混标在以50%乙腈溶液为流动相,在2.2.2节中的液相条件下,再进行优化与微调,使各种物质的灵敏度、峰形达到最佳。经过多次调整得最佳质谱条件见表2。

2.4 标准曲线方程、相关系数与最低检出限

配制3种农药残留的系列标准溶液,按照本方法优化的色谱条件进样测定。以y表示峰面积,x表示农残含量,得回归方程和线性相关系数(表3)。以信噪比(RSN)为3对应的农残含量确定3种农药残留的最低检出限,蝇毒磷为2µg/kg,三唑醇和氟胺氰菊酯均为1µg/kg。蜂王浆中3种农药残留测定的总离子流图及提取离子流图见图1~4。

表 3 3种药物残留的线性范围和回归方程

Table 3 Linear ranges and regression equations for tau-fluvalinate, coumaphos and triadimenol residues

农药名称

线性范围/(µg/kg)

线性回归方程

相关系数

三唑醇

5~100

y=974x-133

0.9973

蝇毒磷

5~100

y=493x-276

0.9944

氟胺氰菊酯

5100

y=1290x+48.3

0.9961

 

 

431786.jpg 

图 1 阴性蜂王浆中添加氟胺氰菊酯、三唑醇和蝇毒磷的总离子图

Fig.1 Total ion chromatograms of blank royal jelly sample spiked with mixed standard solution of tau-fluvalinate, coumaphos and triadimenol

431799.jpg 

图 2 阴性蜂王浆中添加三唑醇的提取离子流图

Fig.2 Ion chromatogram of a single component in blank royal jelly sample spiked with triadimenol standard solution

431813.jpg 

图 3 阴性蜂王浆中添加氟胺氰菊酯提取离子流图

Fig.3 Ion chromatogram of a single component in blank royal jelly sample spiked with tau-fluvalinate standard solution

431826.jpg 

图 4 阴性蜂王浆中添加蝇毒磷的提取离子流图

Fig.4 Ion chromatogram of a single component in blank royal jelly sample spiked with coumaphos standard solution

2.5 方法的添加回收率与精密度

在蜂王浆阴性样品中,分别对3个添加量的残留标准品做6次平行,按本方法进行样品的处理与测定,确定本方法的添加回收率和精密度。添加回收率和精密度结果见表4。添加回收率在78.9%~102.1%之间,变异系数小于15%,完全满足国家规定的对痕量蝇毒磷、氟胺氰菊酯和三唑醇药物残留的同时测定需要。

表 4 3种药物残留的添加回收率和变异系数

Table 4 Recovery rates and RSDs of tau-fluvalinate, coumaphos and triadimenol residues in fortified royal jelly

药物

添加量/(µg/kg)

回收率/%

变异系数/%(n=6)

三唑醇

5

90.2

2.1

10

88.4

3.1

50

97.6

4.7

 

 

 

 

蝇毒磷

5

78.9

10.4

10

83.2

13.6

50

88.3

4.3

 

 

 

 

氟胺氰菊酯

5

97.8

6.9

10

102.1

11.5

50

94.3

5.9

 

 

3 结 论

本实验将高效液相色谱串联质谱法用于蜂王浆中蝇毒磷、氟胺氰菊酯和三唑醇药物残留的同时测定。利用一种样品净化方法,同时检测3种农药残留,提高了检测效率,降低了检测成本,并且该样品净化方法谱图比较干净,在分析复杂样品且农药含量较低时有一定的优势。该方法的检出限、回收率及精密度完全满足对进出口贸易中蜂王浆残留限量测定的需要。

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收稿日期:2012-08-26

基金项目:国家蜂产业技术体系建设专项(CARS-45);国家星火计划项目(2010GA701004)

作者简介:周萍(1968—),男,工程师,本科,研究方向为蜂产品检测。E-mail:tdbjhn@126.com

*通信作者:胡福良(1964—),男,教授,博士,研究方向为蜜蜂科学。E-mail:flhu@zju.edu.cn