光电型传感法快速检测食品中大肠杆菌

叶雨丹，柴春彦*，刘国艳，王艺如

(上海交通大学农业与生物学院，上海 200240)

摘 要：大肠杆菌可在异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导下分泌β-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶特异性的催化氯酚红-β-D-吡喃半乳糖苷(CPRG)生成氯酚红(CPR)发生显色反应，而反应颜色的深浅和大肠杆菌的浓度具有一定的对应关系，从而建立检测大肠杆菌的光电型传感方法。结果表明：用光电传感方法检测大肠杆菌，最适反应时间4h、最适反应pH7.5。样品中细菌浓度的对数与反射光信号值之间呈现良好的对应关系(R=－0.98944，P＜0.01)，线性方程为Y=1426.10485－97.23368X，检测限可达104CFU/mL。基于颜色反应的光电传感方法检测大肠杆菌具有快速、简便、成本低廉等优点，具有良好的研发和应用前景。

关键词：大肠杆菌；光电型传感器；β-半乳糖苷酶；光电型试纸条

Development of Photoelectric Sensor for Detection of E. coli

YE Yu-dan，CHAI Chun-yan*，LIU Guo-yan，WANG Yi-ru

(School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China)

Abstract：E. coli secretes β-galactosidase under the induction of isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG). The β-galacosidase catalyzes chlorophenol ReD-β-D-galactopyranoside (CPRG) to form chlorophenol red (CPR) along with a color reaction. Based on the significant correlation between intensity of the color change from the reaction and the concentration of E. coli, a photoelectric sensor for detecting E. coli was developed. The results showed that the optimal pH for the reaction system was 7.5 and the optimal time for enzymatic reaction was 4 h. The logarithm value of bacterial concentration in samples presented a significant correlation with the reflected light signal value (R = －0.98944, P ＜ 0.01), the linear equation was Y = 1426.10485 － 97.23368X. The detection limit was 104 CFU/mL. The photoelectric sensor based on color reaction can provide a quick, simple and cheap way to detect E. coli in food samples and therefore deserves further development and application.

Key words：E.coli；photoelectronic sensor；β-galactosidase；photoelectric test strip

中图分类号：O657.1 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)18-0185-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201318037

饮水和食品中大肠杆菌(E.coli)污染的监测是目前食品卫生安全控制过程中必检的指标[1]。当前大肠杆菌的检测技术有传统的细菌检测方法如细菌直接计数法、微生物培养法，检测效果准确，但是检测方法操作繁琐、耗时长；生物学法如ATP生物发光法、免疫学方法、PCR技术等，特异性强、灵敏度高，但需要专业人员和专业设备，且无法满足食品中常见大肠杆菌污染菌大批量快速检测的需要[2-3]。对于食品中大肠杆菌的检测，首先要满足方法的可靠性和检测的灵敏度，如果能够快速检测，同时价格低廉、操作简便，则更加实用和易于普及推广等[4-7]。近年来，国内外在研究使用电化学生物传感法检测微生物方面取得了很大的进展，本实验旨在探索一种快速检测大肠杆菌的光电型生物传感方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大肠杆菌 实验室自行分离、鉴定；氯酚红(CPR)、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG) 美国Sigma公司；肉汤培养基、麦康凯琼脂 上海伊华医学科技有限公司；细菌冻存液 上海碧云天生物技术有限公司；Na2HPO4、NaH2PO4、HCl、NaOH等化学试剂均为分析纯 中国医药集团上海试剂公司；实验用水均为二次蒸馏水。

1.2 仪器与设备

ELX800酶标仪 美国Bio-Tex公司；微型光电型生物传感仪由本实验室与上海交通大学电子与信息学院袁景淇教授实验室合作开发；pHS-3C精密pH计 上海精密仪器仪表有限公司；玻璃纤维 上海统笙有限公司。

1.3 方法

1.3.1 光电型传感方法检测食品中大肠杆菌的实验设计原理

大肠杆菌本身含有多种酶，在外界条件诱导下能分泌一些酶[8-9]。大肠杆菌在IPTG的诱导下可以分泌β-半乳糖苷酶，是较为典型的大肠杆菌诱导酶。β-半乳糖苷酶作用于氯酚红-β-D-吡喃半乳糖苷(chlorophenol red-β-D-galactopyranoside，CPRG)发生氧化还原反应，使黄色的CPRG生成红色的氯酚红(chlorophenol red，CPR)，是明显的颜色反应[10-14]，该反应颜色变化的深浅与大肠杆菌的浓度之间呈明显的相关性。根据此反应原理，参考相关文献并结合本实验的实际情况，使用本实验室自行研制的光电检测仪，测定不同浓度的大肠杆菌标准液对应的光反射强度值的大小，绘制标准曲线，并优化反应条件，建立检测大肠杆菌浓度的光电型生物传感方法。

1.3.2 光电型传感器的检测

1.3.2.1 检测大肠杆菌试纸条的组装

试纸条组装如图1所示。

图 1 快速检测大肠杆菌的试纸条设计图

Fig.1 The design of test strip for E. coli detection

1.3.2.2 检测过程

精确称取CPRG 0.01g，用pH7.5的PB缓冲液10mL将其溶解，将已被诱导产生半乳糖苷酶的大肠杆菌样品滴入96孔酶标板中，加入配制好的CPRG溶液，反应4h，将显色后的混合液3滴滴在试纸条上，放入光电传感器的检测窗口，测定并记录显示数据。

1.3.3 大肠杆菌的筛选与培养

1.3.3.1 无菌培养基的制备

取营养肉汤22g、蒸馏水1000mL，于121℃温度条件灭菌15min。

1.3.3.2 大肠杆菌的筛选与培养[15]

用无菌注射器吸取豆腐浸出液1mL接种到20mL无菌培养基，37℃摇床培养12h，利用麦康凯培养基筛选，挑取粉红色菌落，接种于20mL无菌培养基，37℃增菌培养。

1.3.4 大肠杆菌标准曲线的绘制

将大肠杆菌菌悬液用0.01mol/L B-R缓冲液(pH6)配成浓度梯度为104～109CFU/mL，然后进行半乳糖苷酶的诱导：首先取5mL营养肉汤制作的菌悬液，加入400μL浓度10mmol/L的IPTG溶液，37℃水浴培养45min诱导β-半乳糖苷酶，然后终止反应10min。4000r/min离心10min，收集大肠杆菌，加入100μL PB制成悬浮液作为待测液[16-19]。将100μL待测液加入96孔酶板中，再加入等量CPRG溶液，混合均匀后于室温条件下反应。4h后出现显色反应，滴加两滴待测液至试纸条上，将试纸条置于测试孔检测后记录光电传感器显示的吸光强度。根据不同浓度大肠杆菌标准液所对应的不同光反射强度，建立标准曲线，用Origin 6.0求出回归方程。

1.3.5 反应条件的优化

1.3.5.1 最适反应时间的确定

配制细菌群落数为105、106、107CFU/mL的大肠杆菌进行半乳糖苷酶的诱导，用光电型传感器进行显色反应的检测，每组做5个平行，结果取平均值。当光反射强度随着时间发生变化时，反射强度达到最小时说明反应进行充分，随后反射光信号基本不变，以此确定反应最适时间。

1.3.5.2 最适反应pH值的确定

用酸碱缓冲液，即1mol/L的HCl-NaOH溶液将产生半乳糖苷酶的大肠杆菌诱导待测液的pH值分别调节为4、5、6、7、7.5、8、9、10，分别滴入检测试纸条，用光电型传感器进行显色反应的检测，每个pH值做5个平行，结果取平均值。当光反射强度随着pH值的变化而发生变化时，光反射强度达到最小时说明对应的pH值为反应最适pH值。

1.3.5.3 准确性的测定

使用光电型传感器检测已知含有大肠杆菌的50个阳性样品与不含大肠杆菌的50个阴性样品，按照公式(1)计算该方法的准确率。

准确率/%= ×100

检出阳性样品数＋检出阴性样品数

样品总数

(1)

1.3.5.4 回收率的测定

配制细菌群落数为105CFU/mL的大肠杆菌溶液，在光电型传感器上进行检测，平行10次，记录光反射信号强度并计算用光电传感法测得的大肠杆菌浓度，按照公式(2)计算该方法检测大肠杆菌浓度的回收率。

回收率/%= ×100

测得的大肠杆菌浓度

已知大肠杆菌浓度

(2)

1.3.6 光电传感方法与传统平板法检测大肠杆菌效果的对比

平板划线法是一种菌种的分离纯化技术，可以把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，是一种传统测定细菌个数的方法。选取市场上销售的豆腐样品，取其浸出液，121℃灭菌15min，吸取人为稀释的102 CFU/mL大肠杆菌菌悬液接种至灭菌的豆腐浸出液中进行增菌培养，做5个平行样本，每隔0.5h进行检测，并对平板划线法和光电型生物传感器法的检测效果进行比较。

2 结果与分析

2.1 光电试纸条的制备

图 2 光电型试纸条实物图

Fig.2 The photoelectric test strip

由于大肠杆菌含量越高，诱导出的β-半乳糖苷酶越多，催化反应越完全，产生红色的CPR越多。随着样品中大肠杆菌浓度的不断增减，颜色由黄色到紫红色变化(图2表示浅灰色至深黑色)。

2.2 最适反应时间的确定

3条曲线从上到下细菌浓度分别为104、105、106CFU/mL。

图 3 反应时间对光反射强度的影响

Fig.3 The curve of strip light reflection intensity versus time after color reaction of different concentrations of E. coli

由图3可知，当光反射强度达到最低点时反应充分，随后曲线趋于平稳。同时可以看出向试纸条滴加不同浓度的大肠杆菌溶液后，显色反应的速度随着大肠杆菌浓度的增加有所加快。在反应4h之后，反应基本完成，因此选取4h为最佳反应时间。

2.3 最适反应pH值的确定

图 4 反应pH值对光反射强度的影响

Fig.4 The curve of strip light reflection intensity versus time after color reaction at different pH levels

由图4可以看出，当用pH7.5的缓冲液配制大肠杆菌溶液时，所得到的光反射率最小，说明在此pH值条件下反应最为充分，当反应pH值偏小或偏大时，都会对酶的催化活性产生影响。β-半乳糖苷酶在pH7.5，即在中性略碱性条件有最强催化能力，可以得到较理想的显色效果，因此选取pH7.5为最适反应pH值。

2.4 光电型传感器检测大肠杆菌的标准曲线

随着大肠杆菌浓度的增加，显色试纸条的反射率逐渐降低。而且光反射率与相应细菌浓度的对数呈现较好的线性关系，回归方程为Y=1426.10485－97.23368X，R=－0.98944(P＜0.01)，检测限为104CFU/mL。

2.5 准确率及回收率的检测结果

用本实验建立的检测大肠杆菌的光电型传感方法检测50个阳性样品和50个阴性样品，结果有46个阳性样品检测结果为阳性，50个阴性样品检测为阴性，其准确率达到了96%。当大肠杆菌浓度较低时，也可通过增菌的方式来提高检测的准确性，大约增菌3h即可达到检测标准。另外，用光电型传感器检测已知浓度的大肠杆菌标准样品，经统计其回收率为91.4%。

2.6 光电传感方法与传统平板法检测大肠杆菌效果的对比

表 1 生物传感法与平板计数法对人为增菌处理的豆腐样品的

检测结果对比

Table 1 Comparison of the results obtained by biosensor method and plate count method for artificially enriched

注：CM.传统计数方法；OPS.传感法；*.差异显著(P＜0.05)。

从表1可以看出，在增菌3h后，可以根据样品在传感器检测时反射光强度与标准曲线相应的强度对应的细菌含量值对比，从而较为准确地检测到大肠杆菌含量。并且利用生物传感法与平板计数法无显著性差异(P＞0.05)，但是时间却大大短于平板计数法所需的48h[20-21]。因此，与传统的平板法相比，光电传感法具有更快速、简便，检测费用更低等优点。

3 结 论

本实验探索了一种检测大肠杆菌的新方法，即使用光电型传感器对大肠杆菌进行检测。该法的最适反应时间4h、最适反应pH7.5，准确率和回收率都达到了90%以上。当大肠杆菌浓度较低时，可通过增菌的方式来提高检测的准确性，大约增菌3h 即可达到检测标准，优于传统划平板的48h 。样品中细菌浓度的对数与光反射强度之间呈现良好的对应关系(R=－0.98944，P＜0.01)，线性方程为Y=1426.10485－97.23368X，检测限可达104CFU/mL。该方法简便易行，为大肠杆菌的检测提供了一种新途径。

参考文献：

[1] 陈炳卿, 孙长颇. 食品污染与健康[M]. 北京: 化学工业出版社, 2002: 34-37.

[2] 马冬, 宋宏新, 李明亮, 等. PCR检测乳品中大肠杆菌的研究[J]. 食品科学, 2009, 30(4): 260-263.

[3] 巢强国, 杨学明, 葛宇, 等. PCR检测牛乳中大肠杆菌O157:H7[J]. 食品科学, 2010, 31(8): 212-215.

[4] 程欲晓, 金利通. 电化学/生物传感器快速检测大肠杆菌的研究进展[J]. 化学传感器, 2009, 29(1): 3-8.

[5] PARK C H, VANDEL N M, HIXON D L. Rapid immunoassay for detection of Eseheriehia coli O157 directly from stool specimens[J]. Journal of Clinical Microbiology, 1996, 34(4): 988-990.

[6] 李杜娟, 王剑平, 应义斌, 等. 检测食源性致病菌的生物传感器[J]. 中国生物化学与分子生物学报, 2007, 23(3): 194-199.

[7] 刘素芹, 戴高鹏, 王启会. 快速检测牛奶中大肠杆菌的压电生物传感器研究[J]. 食品科学, 2009, 30(4): 207-209.

[8] 崔建东, 张云峰, 李艳. 苯丙氨酸解酶重组大肠杆菌产酶条件研究[J]. 食品科学, 2009, 30(7): 181-185.

[9] 庞敏, 李朝生, 冯瑞彩, 等. 大肠杆菌色氨酸酶的制备及酶学性质[J]. 食品科学, 2011, 32(1): 189-192.

[10] SU Xiaoli, LI Yanbin. A self-assembled monolayer-based piezoelectric immunosensor for rapid detection of Escherichia coli O157:H7[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2004, 19(6): 563-574.

[11] HAN Shubo, LI Xi, GUO Guangmei, et al. Voltammetric measurement of microorganism populations[J]. Analytica Chimica Acta, 2000, 405(1/2): 115-121.

[12] BANG G S, KIM B G. A novel electrochemical detection method for aspartamebBiosensors[J]. Bioelectron, 2005, 21(6): 863-870.

[13] WUTOR V C, TOGO C A, LIMSON J L, et al. A novel biosensor for the detection and monitoring of β-D-galactosidase of fecal origin in water[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2007, 40(6): 1512-1517.

[14] LOAIZA O A, COMPUZANO S, PEDRERO M J, et al. DNA sensor based on an Escherichia coli gene probe immobilization at self-assembled monoalayers-modified gold electrodes[J]. Talanta, 2007, 73(5): 838-844.

[15] 赖卫华, 冯贻泽, 白熙安•克罗泽道森. 大肠杆菌O157:H7快速培养的初步研究[J]. 食品科学, 2009, 30(7): 145-147.

[16] 商璟, 柴春彦, 张洪才, 等. 快速检测痕量镉的光电型传感器的建立[J]. 食品科学, 2011, 32(18): 82-285.

[17] 刘海峰, 柴春彦, 刘国艳. 光电型传感器在快速检测食品中过氧化氢中的应用[J]. 食品科技, 2008(11): 278-282.

[18] 商璟, 柴春彦, 张洪才, 等. 痕量铜光电型传感器检测方法建立[J]. 中国公共卫生, 2011, 27(11): 1498-1499.

[19] 商璟, 翁芝莹, 柴春彦, 等. 快速检测痕量汞的光电型传感方法的建立[J]. 上海交通大学学报: 农业科学版, 2012, 29(2): 56-59.

[20] GB/T 4789.2—2008 食品卫生微生物学检测: 菌落总数测定[S].

[21] LEE Y G, WU H Y, HSU C L, et al. A rapid and selective method for monitoring the growth of coli forms in milk using the combination of amperometric sensor and reducing of ethylene blue[J]. Sensor Actuators, 2009, 141(2): 575-580.