超高效液相色谱-串联质谱法测定粮谷中6种植物生长调节剂残留

徐生坚，曹 慧*，陈小珍

(浙江省质量检测科学研究院，浙江 杭州 310013)

摘 要：建立粮谷中多种植物生长调节剂残留量检测的超高效液相色谱-串联质谱的分析方法。样品经甲醇-水(90:10，v/v)提取，浓缩后经WAX小柱净化，采用Waters C18色谱柱分离，以乙腈和2mmol/L甲酸铵溶液为流动相进行梯度洗脱，采用电喷雾-负离子多反应监测模式，外标法定量。在5～150μg/L的质量浓度范围内，各种植物生长调节剂相关系数均大于0.9995，该方法的检出限在0.5～1.5μg/kg之间，定量限在1.5～5.0μg/kg之间。添加5.0、10.0μg/kg和25.0μg/kg三个不同水平时，6种植物生长调节剂的回收率在70.4%～119.0%之间，日内和日间相对标准偏差在1.68%～8.25%之间。该方法简单、灵敏度高、分析时间短，适用于多种植物生长调节剂的测定。

关键词：超高效液相色谱-串联质谱；植物生长调节剂；残留；粮谷

Determination of Plant Growth Regulator Residues in Grains by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

XU Sheng-jian，CAO Hui*，CHEN Xiao-zhen

(Zhejiang Institute of Quality Inspection Science, Hangzhou 310013, China)

Abstract：A method was established for determining plant growth regulator residues in grains by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS). Samples were extracted with methanol-water (90:10, V/V), and cleaned up on a WAX cartridge. The target analytes were separated on a Waters C18 column with gradient elution using a mobile phase made up of acetonitrile and 2 mmol/L ammonium formate. Detection was carried out using negative electrospray ionization and multiple reaction monitoring (MRM), and the external standard method was used for quantification. In the linear range 5–150 μg/L, the correlation coefficient was larger than 0.9995 for each plant growth regulator. The limits of detection (LOD) were 0.5–1.5 μg/kg, and the limits of quantitation (LOQ) were 1.5–5.0 μg/kg. The spiked recovery rates at three levels of 5.0, 10.0 μg/kg and 25.0 μg/kg were in the range of 70.4%–119.0%. The relative standard deviation (RSD) of intra-day and inter-day assays was 1.68%–8.25%. The method proved to be simple, sensitive, rapid and suitable for the determination of plant growth regulator residues in grains.

Key words：ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS-MS)；plant growth regulator；residue；grains

中图分类号：O657.63 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)18-0218-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201318044

植物生长调节剂是一类对植物生长和发育阶段具有重要调控作用的化合物，有促进植物生长、提高作物产品质量和品质、增强果实抗病力和延缓果实成熟等作用[1-4]。2,4-二氯苯氧乙酸、脱落酸、3-吲哚丁酸、赤霉素、4-氯苯氧乙酸和2-萘氧乙酸是6种常用的植物生长调节剂。

随着植物生长调节剂使用情况的增多，特大草莓和爆炸西瓜等事件屡见不鲜，植物生长调节剂的使用的安全性受到广泛关注。目前关于植物生长调节剂的检测方法及标准主要为气相色谱法[4-5]和液相色谱法[6-10]，且主要集中于单一组分的植物生长调节剂检测[11-15]，很少有关于多组分植物生长调节剂检测的方法报道[16]。单一的气相色谱和液相色谱检测方法干扰严重，以保留时间进行定性，易出现假阳性。由于植物生长调节剂在植物体内的含量不高，性质不稳定，虽然有少量文献报道了部分植物生长调节剂的检测方法，但多组分植物生长调节剂的国家检测标准尚未建立，因此，选择合适的提取方法和分析手段解决多组分植物生长调节剂的同时测定显得尤为重要。液相色谱-串联质谱具有高灵敏度和高选择性的优势增加了定性和定量的可靠性，是近年来常用的色谱检测手段[17-20]。应用液相色谱-串联质谱技术测定植物生长调节剂，不仅可以实现多种植物生长调节剂的同时测定[21-24]，而且可以对其结构进行确证。

本实验采用超高效液相色谱-串联质谱技术(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS-MS)对粮食和谷物中6种植物生长调节剂同时进行分析测定。对仪器条件、前处理技术和方法学作了相关探讨研究，应用该技术分析粮食和谷物中多种组分植物生长调节剂，具有简单、灵敏度高、选择性好、分析时间短、回收率高等优点，完全满足日常检测的需求。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大米、小米、荞麦、小麦和玉米渣均为市售。

2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)标准品(纯度≥99.9%)、脱落酸(abscisic acid)标准品(纯度≥98.5%) 美国Sigma公司；标准品：3-吲哚丁酸(4-(3-indolyl)-butyric acid，纯度≥99.0%)、赤霉素(gibberellic acid，纯度≥98.0%)、4-氯苯氧乙酸(4-chlorophenoxyacetic acid，纯度≥99.0%)、2-萘氧乙酸(2-naphthoxy acetic acid，纯度≥96.5%) 德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司。

甲醇、乙腈(色谱纯) 德国Meker公司；乙醇、二氯甲烷、甲酸铵(均为色谱纯) 美国Tedia公司；水为Milli-Q系统纯化水。

标准溶液的配制：分别准确称取10mg 2,4-二氯苯氧乙酸、脱落酸、3-吲哚丁酸、赤霉素、4-氯苯氧乙酸和2-萘氧乙酸标准品于10mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成1mg/mL的储备液，密封储存于4℃冰箱中。分别吸取1mg/mL的2,4-二氯苯氧乙酸、脱落酸、3-吲哚丁酸、赤霉素、4-氯苯氧乙酸和2-萘氧乙酸标准溶液10μL于10mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成1μg/mL的混合标准溶液，用时稀释成一系列质量浓度的标准溶液，待测。

1.2 仪器与设备

AcquityTM超高效液相色谱仪和XevoTM TQ-MS质谱仪(配有电喷雾电离(electrospray ionization，ESI)接口及Masslynx数据处理系统)、固相萃取装置 美国Waters公司；MilliQ超纯水器 美国Millipore公司；高速离心机 美国Thermo公司；氮气吹干仪 天津市恒奥科技有限公司；涡旋混合器 太仓市华利达实验设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1mm×100mm，1.7μm)；柱温：35℃；样品温度：25℃；进样体积：5μL；流速：0.2mL/min；流动相：乙腈(A)，2mmoL甲酸铵溶液(B)；洗脱程序：0～2min，90% B，2～4min，90%～40% B，4～6min，40% B，6～7min，40%～90% B，7～8min，90%B。

1.3.2 质谱条件

离子源：ESI；扫描方式：负离子模式；检测方式：多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)；毛细管电压：2.80kV；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：500℃；脱溶剂气流量：1000L/h。

1.3.3 前处理方法

1.3.3.1 提取

称取2g粉碎试样于50mL离心管中，加入10mL甲醇-水(90:10，v/v)提取液，涡旋1min，超声提取10min，离心后取出上清液，再加入5mL甲醇-水(90:10，V/V)提取液，重复上述操作，合并提取液，在45℃条件下氮吹至近干，加5mL水溶解残渣，涡旋。

1.3.3.2 净化

WAX柱用3mL甲醇、3mL水活化，将上述5mL溶解液上样，依次用3mL水和3mL 2%的甲酸溶液淋洗，抽至近干后，分别用3.0mL甲醇和3.0mL 5%的氨水甲醇溶液洗脱，于45℃条件下氮吹至干，再加1mL乙腈-水(10:90，V/V)溶解，涡旋混合1min，过0.22μm微孔滤膜后，于UPLC-MS-MS仪上分析。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

高效的色谱柱是多组分分析的前提条件，本实验选用Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1mm×100mm，1.7μm)色谱柱来分离6种植物生长调节剂，此色谱柱对各化合物具有较强的保留，各色谱峰峰形较好，并得到了有效地分离，减少了杂质的干扰。

分别选择甲醇和乙腈作为强洗脱流动相。实验证明：当甲醇作流动相时，离子化受到不同程度的抑制，丰度明显降低，导致灵敏度下降，而乙腈的离子化效率明显优于甲醇，故本实验采用乙腈强洗脱流动相。在流动相中加入甲酸铵能增加各种化合物在ESI－模式下的离子化效率，改善各化合物的峰形。本实验分别配制1、2mmol/L和5mmol/L的甲酸铵溶液作为流动相，经实验表明2mmol/L的甲酸铵溶液体系能提供最佳离子化条件，峰面积信号最强，灵敏度最高。图1为多种植物生长调节剂混合标准溶液的MRM色谱图。

图 1 植物生长调节剂的MRM色谱图

Fig.1 MRM chromatograms of plant growth regulators

2.2 质谱条件的优化

在电喷雾质谱、负离子监测模式下，分别对毛细管电压、锥孔电压、碰撞能量和选择离子等进行了充分的优化，选取经碰撞后所得丰度较高的两个子离子作为定量和定性离子，并确定其最佳碰撞能量的电压值。最终所选择确定的母离子、子离子和碰撞能量等参数见表1。

表 1 植物生长调节剂的质谱分析参数

Table 1 LC-MS/MS parameters for plant growth regulators

2.3 萃取溶剂的选择

为使各种植物生长调节剂有较好的提取效率，分别采用乙腈、甲醇、乙醇、二氯甲烷、甲醇-水、乙腈-水、水作为萃取溶剂，其中甲醇-水的提取效果较好，当甲醇-水的体积比为90:10时，干扰物质少，提取效率高。因而，采取甲醇-水(90:10，V/V)作为萃取溶剂。

2.4 净化条件的选择

图 2 5种固相萃取小柱的净化效果比较

Fig.2 Comparison of the effectiveness of 5 different solid-phase extraction cartridges

由于净化效果对基质效应具有较大的影响，为了获得较好的净化效果，本实验分别选用Waters公司MAX、MCX、WAX、WCX和HLB 5种类型的固相萃取小柱，分别考察净化效果和保留行为，由6种化合物在不同固相萃取小柱上的净化效果(图2)可知，WAX固相萃取小柱对各种植物生长调节剂具有较好的吸附作用，除脱落酸外，其余各化合物峰面积较其他固相萃取小柱大，净化效果较好，从6种化合物的综合保留与净化效果来看，WAX固相萃取小柱比其他4类固相萃取小柱更适合于6种植物生长调节剂的保留与净化，所以选择WAX固相萃取小柱进行净化。

2.5 方法学验证

2.5.1 线性范围和检出限

取质量浓度分别为5、10、20、50、80、100、150μg/L一系列基质标准溶液，以峰面积(y)对相应的质量浓度(x)作图，得标准曲线，并求出相应的线性回归方程及相关系数，结果见表2。结果表明：6种植物生长调节剂在5～150μg/L的质量浓度范围内具有良好的线性关系，相关系数r均在0.9995以上。按3倍信噪比计算得到样品中3-吲哚丁酸和赤霉素的检出限为1.5μg/kg，2,4-二氯苯氧乙酸、脱落酸、4-氯苯氧乙酸和2-萘氧乙酸的检出限为0.5μg/kg。按10倍信噪比计算得到样品中3-吲哚丁酸和赤霉素的定量限为5.0μg/kg，2,4-二氯苯氧乙酸、脱落酸、4-氯苯氧乙酸和2-萘氧乙酸的定量限为1.5μg/kg。

表 2 植物生长调节剂的线性方程、相关系数、检出限和定量限

Table 2 Linear equations, correlation coefficients, LOD and LOQ of plant growth regulators

2.5.2 精密度和稳定性实验

在阴性的荞麦样品中添加10μg/kg的6种植物生长调节剂标准溶液，按1.3.3节方法进行预处理，平行操作7次，以荞麦基质配制标准溶液进行校正分析，结果见表3，6种植物生长调节剂的RSD范围为1.68%～3.79%。按日内精密度的预处理方法，每天取样1份，连续7d测定，6种植物生长调节剂的RSD范围为2.44%～8.25%，结果表明，该实验重复性较好。

表 3 植物生长调节剂的精密度结果

Table 3 Precision (RSD) of the UPLC-MS/MS method

2.5.3 回收率实验

分别在阴性的大米、小米、荞麦、小麦和玉米渣样品基质中添加5、10、25μg/kg三种不同水平的植物生长调节剂标准溶液，以各种样品基质配制标准溶液进行校正分析，按1.3.3节方法进行预处理，回收率见表4。结果表明：2,4-二氯苯氧乙酸的回收率在71.9%～86.6%，脱落酸的回收率在82.6%～118.8%，3-吲哚丁酸的回收率在72.5%～104.1%，赤霉素的回收率在70.4%～119.0%，4-氯苯氧乙酸的回收率在75.5%～87.4%，2-萘氧乙酸的回收率在72.3%～99.3%。

表 4 植物生长调节剂的回收率结果(n=3)

Table 4 Recovery rates of plant growth regulators from spiked samples (n=3)

%

2.6 基质效应

本实验采用固相萃取净化的前处理程序以消除部分基质效应的影响，但是基质效应在药物残留分析中非常普遍，药物和样品本身的性质都是影响基质效应的因素，因此，本实验分别用流动相和空白样品溶液稀释了一系列的标准溶液，进行液相色谱-串联质谱对比检测。结果表明：各种植物生长调节剂的基质标样峰面积较流动相标样的峰面积小，说明基质对各v种植物生长调节剂仍存在一定的电离抑制作用。这是由于电喷雾离子源需通过一个去离子化和离子化的过程，该过程易导致待测成分响应信号损失。因而，在实际样品测试中，采用空白基质提取液配制标样以消除基质效应。

2.7 实际样品测试

在当地超市购买20批次粮谷食品(其中大米5批、小米4批、荞麦4批、小麦4批、玉米渣3批)进行分析测试，均未发现上述6种植物生长调节剂。

3 结 论

本实验建立了超高效液相色谱-串联质谱法同时测定粮谷中多种植物生长调节剂残留量的分析方法。该方法具有灵敏度高，前处理方法简单，回收率高且稳定，准确度和精密度高等优点，适用于多类粮食和谷物中植物生长调节剂残留量的检测和确证。此外，与传统的液相色谱和气相色谱检测方法相比，由于串联质谱有效地消除了由仪器检测所产生假阳性的可能，保证了定性和定量结果的可靠性。

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