高效液相色谱分离与分析胡麻卵磷脂中磷脂酰胆碱 关 明,侯俊峰,古再丽努尔•阿尔肯,艾散江•艾海提 (新疆师范大学化学化工学院,污染监测与控制重点实验室,新疆 乌鲁木齐 830054)
摘 要:目的:建立胡麻卵磷脂样品中磷脂酰胆碱的高效液相色谱分离分析方法。方法:采用Platisil C18色谱柱(150mm×4.6mm,5µm),检测波长为215nm,流动相为乙腈-甲醇(50:50,V/V),流速为1mL/min,以磷脂酰胆碱峰面积定量。结果:胡麻卵磷脂样品中磷脂酰胆碱的含量为73.6%,平均回收率为103.3%,精密度(RSD)为0.28%,检出限为0.25µg。结论:建立的方法准确、高效,结果真实可靠。 关键词:高效液相色谱法;磷脂酰胆碱;胡麻卵磷脂
Separation and Analysis of Phosphatidylcholine in Flax Lethin by HPLC
GUAN Ming,HOU Jun-feng,GUZAILINUER•Aerken,AISANJIANG•Aihaiti (Key Laboratory of Pollution Monitoring and Control, College of Chemistry and Chemical Engineering, Xinjiang Normal University, Ürümqi 830054, China)
Abstract:Objective: To establish an HPLC method for the separation and analysis of phosphatidylcholin in flax lecithin. Methods: A Platisil C18 column (150 mm × 4.6 mm, 5 µm) was used for chromatographic separation using acetonitrile-methanol (50:50, V:V) as mobile phase at flow rate of 1 mL/min. The detection wavelength was set at 215 nm. Results: The content of phosphatidylcholin in flax lecithin was 73.6%, and the average spiked recovery rate was 103.3%. The precision RSD for 6 replicate determinations was 0.28%, and the detection limit was 0.25 µg. Conclusion: The method is accurate, efficient and can provide reliable results. Key words:high performance liquid chromatography (HPLC);phosphatidylcholine;flax lecithin 中图分类号:TS207.3 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2013)18-0223-04 doi:10.7506/spkx1002-6630-201318045 胡麻(Linum usitatissimum L.)是世界上仅次于大豆、油菜、向日葵和花生的油料作物[1]。在我国,胡麻主要分布在山西、内蒙古、河北、甘肃、宁夏和新疆等省(区)[2]。新疆地区在生产胡麻植物油的同时也生产出了胡麻油脚等副产品,油脚是生产卵磷脂的主要原料,但常被丢弃浪费,有待深度开发与利用。卵磷脂是一种混合物,包括磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酸(PA)等成分[3],也是一种天然表面活性剂,在食品、药品、油脂加工等领域有广泛的用途,市场前景广阔[4]。磷脂酰胆碱是卵磷脂的主要成分,能增强婴儿智力,提高学习效率,尤其是胎儿,在生长发育中对磷脂酰胆碱的需求极大[5]。以高纯度药用大豆磷脂研制的抗癌新药139针剂,目前在国内市场供不应求[6]。 目前,卵磷脂的分析方法有紫外-可见吸收光谱分析法[7-9]、柱层析法[10]、核磁共振光谱分析法[11]、薄层色谱法[12-14]、氧弹燃烧-灰化分光光度法[15]、高效毛细管电泳法[16]、高效液相色谱法[3,5,17-20]、微波消解-可见分光光度法[21]等,其中,常用高效液相色谱法对卵磷脂样品中的磷脂酰胆碱进行分离分析,但在报道的色谱条件下,流动相成本相对较大,磷脂酰胆碱出峰较慢,分离效率与分离效果有待改善。 本实验以课题组从胡麻油脚原料中精制得到的胡麻卵磷脂为研究对象,拟利用高效液相色谱法,考察检测波长、流动相配比对分离效果的影响,对胡麻卵磷脂样品中的磷脂酰胆碱进行分离分析。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯) 美国Fisher公司;胡麻卵磷脂样品 本课题组精制;磷脂酰胆碱标准品(P3556,纯度≥99%) 美国Sigma公司。 1.2 仪器与设备 Agilent-1100高效液相色谱系统 美国安捷伦公司;TU-1800双光束紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司。 1.3 方法 1.3.1 色谱条件 色谱柱:Platisil柱(150mm×4.6mm,5µm);流动相:乙腈-甲醇(50:50,V/V);检测波长215nm;流速1.0mL/min,进样量10µL;柱温25℃;以峰面积定量。 1.3.2 标准品溶液的制备 准确称取磷脂酰胆碱标准品0.0052g,采用色谱纯甲醇溶解于5mL容量瓶中,制得质量浓度为1.04mg/mL的标准溶液,摇匀置于冰箱冷藏待用。 1.3.3 供试品溶液的制备 准确称取卵磷脂样品0.1357g溶解于25mL容量瓶中,制得质量浓度为5.428mg/mL的溶液,取2mL稀释至10mL容量瓶中,制得质量浓度为1.087mg/mL的样品溶液,摇匀置于冰箱待用。 2 结果与分析 2.1 检测波长的选择 紫外扫描表明,标准品溶液在207、228、271nm的波长处有较大吸收,207nm波长处有最大吸收,但考虑到溶剂甲醇在207nm波长处也有较大的吸收,为了减小基线噪音,选择207、215、228、271nm 4个波长分别进行了色谱分离,如图1所示。
a~d.检测波长分别为207、215、228、271nm。 图 1 不同检测波长处标准品溶液色谱分离情况 Fig.1 Chromatographic separation of standard solution at different detection wavelengths 图1表明,不同检测波长处标准品溶液色谱分离情况均良好。但是,207nm波长处溶剂甲醇也有较大吸收,会导致基线噪音很大,且杂质峰较多;而271nm波长处响应信号过小,不利于定量分析;215、228nm波长处,色谱图中杂质峰明显减少,且可以避免溶剂甲醇的吸收干扰,相对于228nm波长而言,215nm与最大吸收波长207nm最为接近,最终,选定215nm为检测波长。 2.2 流动相配比的选择 为了进一步优化分离效果,获得最佳色谱条件,建立适于卵磷脂中磷脂酰胆碱的色谱分离分析系统,实现最佳分离和准确定量,考察不同配比流动相的分离情况,并进行了分离效果对比,如图2所示。
A.甲醇
B.乙腈
C.甲醇-水(90:10,V/V)
D.乙腈-甲醇(30:70,V/V)
E.乙腈-甲醇(50:50,V/V) 图 2 不同配比流动相下供试品溶液色谱分离情况 Fig.2 Chromatographic separation of sample using different mobile phases 图2表明,甲醇-水为流动相的分离效果优于单独使用甲醇、乙腈为流动相的分离效果;乙腈-甲醇为流动相的分离效果优于甲醇-水为流动相的分离效果;乙腈-甲醇(30:70,V/V)为流动相的分离效果较好,但PC峰与右侧相邻的小峰未能完全分离;乙腈-甲醇(50:50,V/V)为流动相的分离效果最佳,磷脂酰胆碱峰的保留时间为4.812min,分离度大于2,满足高效液相色谱的分离要求。 2.3 标准曲线的绘制与检出限 取标准品溶液,按照3、5、7、9、11μL不同进样量的方法,分别进样3次,以卵磷脂中磷脂酰胆碱的质量浓度为横坐标,磷脂酰胆碱平均峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,结果表明,在3.12~11.44μg范围内,磷脂酰胆碱的质量浓度与峰面积呈现良好的线性关系,线性回归方程为A=90.97ρ-0.8742,回归系数r=0.9999。 取1.3.2节所制备的标准品溶液,稀释至原质量浓度的1/100,按1.3.1节色谱条件,测得磷脂酰胆碱的检出限(RSN=3)为0.25μg,略大于文献[19]报道的0.20μg。 2.4 精密度实验 取标准品溶液连续进样6次,每次5μL,分别测得峰面积,计算RSD。如表1所示。 表 1 精密度实验结果 Table 1 The results of precision experiments
结果表明,RSD为0.28%,精密度良好,满足实验要求。 2.5 样品测定 取供试品溶液进样,重复6次,每次10μL,分别测得峰面积,带入标准曲线计算得供试品中的磷脂酰胆碱的含量,已知样品母液质量浓度为5.43mg/mL,稀释5倍的测量溶液质量浓度为1.09mg/mL,计算出样品磷脂酰胆碱的平均含量为73.6%,如表2所示。 表 2 样品测定结果 Table 2 The results of sample determination
2.6 回收率实验 采用加标回收法,分别取200、160、120μL的标准品溶液加入到200μL的供试品溶液中,进样,每次10μL,每组平行测定两次,计算平均回收率及RSD值,如表3所示。 表 3 回收率实验结果 Table 3 The results of recovery experiments
表3表明,平均回收率为103.3%,RSD为1.40%,方法准确,满足实验要求。 3 讨 论 卵磷脂组分比较复杂,在检测过程中影响因素较多,本实验采用高效液相色谱法对卵磷脂样品中磷脂酰胆碱进行了分离及含量测定,其分离效果好、准确度高、重复性好,为卵磷脂质量分析与控制提供了借鉴和参考。流动相极性与配比的不同对样品的分离有着至关重要的作用,文献[3,18-19]报道采用硅胶柱,正已烷-异丙醇-醋酸为流动相,但磷脂酰胆碱的保留时间超过10min,分析时间增加;还有文献[5]报道采用甲醇-1%磷酸(50:1,V/V)为流动相,但磷脂酰胆碱的保留时间长达13min,且峰形对称性稍差;与文献报道比较,本实验采用极性较强的流动相,磷脂酰胆碱出峰时间明显缩短,保留时间减少一半以上,分析时间得以节省,分析效率得到提高;此外,通过添加乙腈使峰形突显,达到了改善峰形的目的,同时也减少了色谱峰的拖尾现象,分离效果得到改善,但随着乙腈比例的增大,磷脂酰胆碱的分析效率降低,且成本增加,最终,本实验采用甲醇-乙腈(50:50,V/V)为流动相,有效地对胡麻卵磷脂样品中的磷脂酰胆碱进行了分离,达到了较为满意的分离效果。 参考文献: [1] 河北省张家口地区坝上农业科学研究所胡麻课题组. 胡麻[M]. 石家庄: 河北农业出版社, 1989. [2] 胡晓军, 李群, 梁霞. 胡麻籽综合利用研究进展[J]. 农产品加工: 学刊, 2008(2): 38-40. [3] 王瑛瑶. 大豆磷脂中PE、PC、PI测定方法及研究[J]. 中国油脂, 2008, 33(2): 73-76. [4] 宋国安. 磷脂的开发与应用前景[J]. 辽宁化工, 1997, 28(4): 1-3. [5] 王雅蕾, 黄建国, 马建春. 高效液相色谱法测定鸡蛋中的脑磷脂和卵磷脂[J]. 仪器分析, 2010(3): 34-37. [6] 王凤玲, 刘爱国, 朱宏吉, 等. 注射用大豆卵磷脂的提取纯化与质量分析[J]. 食品科学, 2005, 26(4): 183-186. [7] 陈卫涛. 紫外分光光度法测定保健品中卵磷脂含量[J]. 中国粮油学报, 2006, 6(3): 189-191. [8] 关明, 李燕, 赵淑贤. 紫外分光光度法测定卵磷脂胶囊中的磷脂酰胆碱[J]. 中国酿造, 2008(23): 95-97. [9] 王永平, 谭永霞, 肖飞. 卵磷脂保健食品中磷脂酰胆碱的含量测定[J]. 食品科学, 2005, 26(6): 208-209. [10] 韩雪, 汪勇, 刘元法, 等. 柱层分析法分离纯化大豆磷脂酰胆碱[J]. 食品研究与开发, 2010, 31(3): 19-23. [11] 郑卫琴, 沈艳, 陆文达. 核磁共振法测定高纯大豆卵磷脂HLB值[J]. 粮食与油脂, 2007(7): 39-41. [12] 郭京, 徐桂云, 常理文. 大豆磷脂组成的薄层色谱分析[J]. 分析化学, 1998, 26(1): 81-84. [13] 王岩, 关明, 陈坚. 双波长扫描法测定卵磷脂中乙酰胆碱的含量[J]. 新疆医科大学学报, 2003, 26(6): 546-547. [14] 邵荣, 吴丽芹, 云志, 等. 薄层扫描测定大豆卵磷脂中磷脂酰胆碱的含量[J]. 食品科学, 2008, 29(12): 618-621. [15] 关明, 马红雄. 氧弹燃烧-灰化分光光度法测定胡麻卵磷脂的含磷量[J]. 食品科学, 2006, 27(10): 450-452. [16] 肖玉秀, 梅洁, 何秀峰, 等. 磷脂的分离纯化及高效毛细管电泳分析[J]. 色谱, 2006, 24(1): 30-34. [17] 吴丽芹, 邵荣, 云志. 高效液相色谱测定大豆卵磷脂中磷脂酰胆碱的含量[J]. 化学时刊, 2008, 22(11): 35-37. [18] 章慧芳, 陆娅. 大豆磷脂中卵磷脂检测方法的研究[J]. 中国油脂, 2007, 32(7): 70-73. [19] 刘静, 宋航, 付超, 等. 卵磷脂中PE及不同种类PC的高效液相色谱分析[J]. 化学研究与应用, 2005, 17(1): 134-136. [20] 何新霞, 郑孝华, 郊海燕, 等. HPLC法测定大豆磷脂中卵磷脂含量[J]. 食品科学, 2000, 21(2): 57-59. [21] 葛庆联, 吴敏, 张小燕, 等. 微波消解-可见分光光度法测定禽蛋中卵磷脂含量[J]. 食品科学, 2011, 32(8): 194-196. 收稿日期:2012-09-25 基金项目:新疆维吾尔自治区自然科学基金资助项目(2011211A031) 作者简介:关明(1974—),男,副教授,博士,研究方向为资源植物化学。E-mail:guanm@xjnu.edu.cn |
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