酶联免疫吸附结合荧光分析法测定乳粉加速贮藏过程中的褐变产物 刘 玲1,2,杨双华1,纪淑娟1,Leif Horsfelt SKIBSTED2 (1.沈阳农业大学食品学院,辽宁 沈阳 110866;2.哥本哈根大学生命学部食品系,哥本哈根 2200)
摘 要:在65℃封闭的加速贮藏条件下,对3种不同类型乳粉(全脂乳粉、脱脂乳粉和酪乳粉)的褐变产物——末端糖基化产物(AGEs)进行研究和检测。在确立酶联免疫吸附(ELISA)法测定末端糖基产物含量的基础上,结合荧光分析测定乳粉中蛋白末端糖基化所产生的荧光物质。结果表明:AGEs产生的荧光物质和AGEs含量随着贮藏时间的延长而增加。酶联免疫吸附法采用初级抗体和酶标二抗稀释倍数均为2500倍时可以有效测定褐变乳粉中AGEs含量,其中加速贮藏20d后乳粉中AGEs含量最高,可达到0.61ng/mL。最低检出质量浓度达到0.006ng/mL,最大误差率在5%左右,重复性良好。因此,乳粉褐变的荧光强度和AGEs含量的ELISA检测可以作为评价乳粉质量的有效方法。 关键词:乳粉;非酶褐变;末端糖基化产物;酶联免疫吸附法;荧光分析
Determination ELISA Coupled with Fluorescence Spectroscopy of Browning Products of Milk Powder during Accelerated Storage
LIU Ling1, 2,YANG Shuang-hua1,JI Shu-juan1,Leif Horsfelt SKIBSTED2 (1. College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China; 2. Department of Food Science, Faculty of Life Sciences, University of Copenhagen, Copenhagen 2200, Denmark)
Abstract:This study aimed to determine the browning products—advanced glycation end products (AGEs) in milk powder stored under accelerated conditions at 65 ℃ for 20 days by ELISA coupled with fluorescence spectroscopy. Results indicated that higher amounts of AGEs and fluorescent compounds were formed with prolonged storage time. ELISA could effectively determine the content of AGEs in milk powder when the concentration of both primary antibody and HRP-labeled secondary antibody was diluted to 2500 times. The highest content of AGEs in whole milk powder was observed, reaching 0.61 ng/mL, after 20 days of storage, and the minimum detected concentration was 0.006 g/mL. The maximum relative error was around 5% and good repeatability was found. Therefore, fluorescence intensity and the level of AGEs could be applied to evaluate the quality of milk powder. Key words:milk powder;browning products;advanced glycation products;enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA);fluorescence analysis 中图分类号:TS201.2 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2013)18-0249-04 doi:10.7506/spkx1002-6630-201318051 乳粉是一种营养丰富的乳制品,由于其耐贮藏、食用方便,深受人们喜爱。自三聚氰胺事件之后,我国对于乳品安全的监管力度日益加强。乳粉在室温贮存过程中会发生不同程度的化学变化,导致营养价值降低并可能产生有毒物质。其中最容易发生的反应之一就是由蛋白质、乳糖和脂质作用产生的非酶褐变反应[1-6]。褐变程度随着贮藏时间的延长而加强,因此乳粉的质量也随之不断下降。褐变的最重要终产物之一是末端糖基化产物(advanced glycosylation end products,AGEs),它是蛋白质在无酶条件下,自发地与单糖反应所产生的多种不同化学结构交联的不稳定棕色有荧光特性的混合物[7]。目前,关于AGEs的研究主要集中在医学方面,在糖尿病并发症、动脉粥样硬化、白内障、脊髓侧索硬化症等病变和衰老的发展中AGEs均有重要作用。AGEs在人体正常的新陈代谢过程中形成,随着年龄的增加血液中的AGEs的含量也随着增加[8-9]。在食品加工贮藏过程中,AGEs往往是因热处理发生非酶褐变时形成,相关的研究正在引起食品研究工作者的关注[10-12]。因此,检测人体内中及食品中的AGEs含量对多种疾病的预防都有重要的意义。AGEs具有多种不同存在形式,目前已知的结构形式包括戊糖苷素(pentosidine)、Versperlysine、羧乙基赖氨酸(CEL)、羧甲基赖氨酸(CML)、咪唑赖氨酸(imidazolysine)、Pyrraline及Crossline等[13-15]。 酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)法是近30年发展起来的一种综合性酶免疫化学分析方法,目前已广泛应用于临床医学、生物学和分析化学等领域,但该方法在我国的食品领域的应用主要集中在农药残留、毒素检测、病原微生物检测等方面[16-17],食品成分检测应用较少,主要原因是食品自身体系较为复杂。从理论上分析,食品体系的一切物质都可直接或间接地作为抗原,因此可以应用ELISA分析方法。与传统的成本高、耗时费力的高效液相色谱和气相色谱等方法比较,ELISA分析具有简单、快速、处理样品量大、灵敏度高且廉价等优点。目前我国用于乳品中的ELISA检测主要是测定乳中的免疫球蛋白、乳铁蛋白、农残和毒素,尚未见用于AGEs检测的报道。本实验利用ELISA方法检测乳粉贮藏过程中产生的AGEs,并结合AGEs产生的荧光变化来确定乳粉发生非酶褐变的程度,以期为评定乳粉的质量提供一种简单有效的检测方法。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 乳粉于2010年9月28日丹麦Arla乳品公司生产车间采集,采集后取500g密封真空包装,冷库(-18℃)保存;使用时间为2011年11月。 牛血清白蛋白(BSA)、兔抗AGE多克隆抗体、HRP-羊抗兔IgG、明胶 美国Sigma-Aldrich公司;AGE 德国Biologo公司;TMB底物液 丹麦Kem-En-Tec公司;其他试剂均为分析纯。 包被液:0.1mol/L碳酸盐缓冲液,pH9.6;稀释液:0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS),pH7.4;洗涤液(PBST):磷酸盐缓冲液(PBS)+0.05% Tween-20;封闭液:磷酸盐缓冲液(PBS)+0.5%明胶;终止液:0.3mol/L浓硫酸。 1.2 仪器与设备 电子分析天平 德国Sartorius公司;台式离心机 丹麦Ole Dich公司;旋涡混匀器 意大利VELP Scientifica公司;LS5荧光光谱仪 美国Perkin Elmer公司;酶标检测仪 瑞士Tecan公司;96孔酶标板 丹麦VWR公司;纯净水制备仪器 美国Millipore公司。 1.3 方法 1.3.1 乳粉的加速贮藏 为诱导乳粉尽快发生非酶褐变反应,将约10g鲜乳粉装入20mL玻璃瓶并用铝制盖密封,放入65℃烘箱贮藏20d,每隔一段时间取出样品3瓶进行平行测定。样品有3种类型:全脂乳粉(whole milk powder,WMP)、脱脂乳粉(skimmed milk powder,SMP)和酪乳粉(butter milk pwder,BMP)。 1.3.2 乳粉褐变反应产物AGEs波长扫描分析 1.3.2.1 乳粉的前处理 准确称取不同贮藏期的1.0mg乳粉定容至10mL纯水中,用0.1mol/L盐酸调整溶液至pH4.7,稀释定容至100mL,室温静置30min,过滤样液。 1.3.2.2 波长扫描分析条件 激发波长347nm;扫描范围300~500nm;扫描速率200nm/min;λex为5.0nm;λem为5.0nm。 1.3.3 乳粉贮藏过程中AGEs含量的测定 1.3.3.1 乳粉样品制备 准确称取不同贮藏期的2.5mg乳粉定容至5mL磷酸缓冲液(pH9.6)中,涡旋混合器振荡1h制备成混合液,3000r/min离心10min,留取上清液,得到待测样品。 1.3.3.2 间接酶联免疫吸附法测定 用包被液稀释抗原,100μL/孔加入待测样品或抗原(BSA-AGE或BSA)于酶标板中,4℃冰箱过夜。恢复至室温倾去包被液,加入洗涤液PBST洗板3次,每次2min,洗涤之后将洗涤液除去,扣过来拍打至无残留液滴出(扣干)。每孔加300μL封闭液,37℃保温2h,再以PBST洗涤3次,扣干。加100μL/孔经过稀释的初级抗体,于37℃孵育1h。用PBST洗板3次,扣干。再加入100μL/孔经过稀释酶标二抗,37℃孵育1h。用PBST洗板3次,扣干。加入TMB显色液100μL/孔,37℃暗处反应15min,显示蓝色。最后每孔加100μL 0.3mol/L浓硫酸以终止反应,颜色变黄。比色检测波长450nm处测定各孔吸光度。实验重复3次。 1.3.3.3 标准曲线的建立 配制质量浓度分别为0.5、0.25、0.125、0.063、0.031、0.016、0.008ng/mL的BSA-AGE标准液,酶联免疫测定方法同1.3.3.2节。以BSA-AGE标准液的质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。 2 结果与分析 2.1 ELISA法测定AGEs含量的标准曲线 以BSA-AGE标准液的质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标,得回归方程:y=5.511x+1.148,R2=0.994。 制备标准曲线时,标准BSA-AGE的含量确定是在实验中选择了3个不同的标准质量浓度,分别为50、5ng/mL和0.5ng/mL。结果表明,0.5ng/mL范围的标准曲线线性最好。这是由于当标准溶液质量浓度过高时,蛋白质分子间相互作用力较大,因而影响载体对蛋白质的吸附,同时造成最终显色过快,没等全部加入显色剂都已经反应完成,使得反应不均匀,结果不准确。在确定的标准曲线范围内,对乳粉样品进行稀释实验,得到合适的样品质量浓度。 2.2 初抗和酶标二抗质量浓度范围的确定 根据仪器的检测范围,抗原抗体反应吸光度在0.5~3.0左右最佳,故选择吸光度在此范围内的稀释浓度作为工作范围。初级抗体的稀释倍数为1000~5000,乳粉抗原质量浓度为0.05~0.45ng/mL。酶标二抗按1:2000、1:4000、1:8000稀释。3次平行实验,取平均值,结果如表1所示。可知随包被乳粉溶液抗原质量浓度升高,反应吸光度升高。比较不同的初抗和二抗稀释度条件,初抗在1:1000~1:3000、酶标二抗在1:2000~1:4000的稀释度条件下,吸光度比较理想,因此选择稀释度为初抗1:2500、酶标二抗1:2500,在此范围的质量浓度作为工作范围。 表 1 初抗和酶标二抗最佳工作质量浓度的确定 Table 1 Selection of optimal concentration of antibody and HRP labeled goat anti-rabbit IgG
2.3 乳粉中AGEs的波长扫描图谱分析
图 1 全脂乳粉AGEs物质波长扫描谱图 Fig.1 Scanning spectra of AGEs in whole milk powder stored for different days 从图1可看出,随着贮藏时间的延长,全脂乳粉的荧光强度呈增强趋势。在415nm波长处,荧光强度从22.47上升到98.84。荧光强度的上升说明荧光物质的含量随着乳粉贮藏时间的延长而提高。这些荧光物质当中,主要为美拉德反应的产物,也有部分脂质氧化产物和其他荧光物质[18-19],荧光强度的增强说明美拉德反应主导物质AGEs大量累积。同时,随着贮藏时间的延长,谱峰的位置低波长方向迁移,说明其荧光物质的结构逐渐发生细微变化,因为AGEs是一系列交联聚合物质,随着高温贮藏时间的延长,美拉德反应生成的AGEs的结构会有一定变化。 2.4 3种乳粉AGEs荧光物质的对比分析
图 2 贮藏过程中3种乳粉荧光产物的荧光强度变化 Fig.2 Changes in fluorescent intensity of three types of milk powder during accelerated storage 从图2可以看出,3种乳粉的荧光强度都在贮藏过程中有比较明显的增加。其中全脂乳粉(WMP)和脱脂乳粉(SMP)在65℃的贮藏条件下AGEs物质的生成速度基本一致,在前10d,脱脂乳粉略快于全脂乳粉,但10d之后全脂乳粉加速反应超越脱脂乳粉,最后两者终产物的荧光强度基本持平。但是,酪乳粉(BMP)在贮藏过程中体现出特殊的反应速度,在贮藏之初就有一定的荧光物质,在20d的贮藏过程中AGEs荧光物质生成速度相对不高。最后酪乳粉的荧光强度与其他两种乳粉基本接近,3种乳粉最终产生的荧光物质含量相当。酪乳粉的这种变化主要是因为其加工过程比较特殊,它是搅拌脱去黄油后干燥制得,蛋白质含量相对稍高,在脱黄油加工过程中可能部分成分已经开始反应形成荧光物质,而随着蛋白质的变性,在贮藏过程中可以进一步生成AGEs荧光物质的成分就减少,最终反应产物没有量的优势。另一方面也说明,除了AGEs产生荧光物质之外,有其他荧光物质在此波长条件下存在,比如脂质氧化产生的终产物及乳糖所产生的荧光物质等[18-19]。由此可见,荧光分析可以用于评价贮藏终产物的增长趋势,但是直接从荧光物质的测定来确定非酶褐变可能会存在一定的偏差,因此结合AGEs含量的测定来确定褐变程度更为准确。 2.5 乳粉中AGEs含量的测定
图 3 加速贮藏过程中3种乳粉AGEs含量的变化 Fig.3 Changes in the contents of AGEs in three types of milk powder during accelerated storage 由图3可知,3种乳粉在加速贮藏过程中,其AGEs含量均呈上升趋势,新鲜乳粉中AGEs的含量经检测为0.006ng/mL,接近0,加速贮藏20d后的AGEs含量上升至0.14~0.61ng/mL,其中全脂乳粉的AGEs生成量最大,反应速度最快,在16d时反应误差较大,达到5%,其他阶段反应误差在1%~2%之间,重复性良好。在贮藏前5~10d,全脂乳粉中AGEs生成速度增长得很快,之后速度减慢,最后3天又大幅度增加,这一现象与感官检测到的乳粉的颜色改变基本一致,说明在加速贮藏到一周之后,乳粉已经大比例发生非酶褐变的美拉德反应,多数蛋白质和乳糖、甚至部分脂质都参与了美拉德反应。这种主要成分的参与也改变了乳粉的营养价值。 3种乳粉中,全脂乳粉含有较高含量的脂肪(约26%),脱脂乳粉和酪乳粉都含低于5%的脂肪;酪乳粉的蛋白质含量略高于全脂乳粉和脱脂乳粉,但差别不大。由图3可知,全脂乳粉形成AGEs的速度最快,可见脂质的存在是形成AGEs的重要条件。脂质氧化和美拉德反应依附存在[20],脂质的氧化加速了美拉德反应的速度,导致AGEs反应加速。而脂质氧化和美拉德反应造成食品营养成分的大量损失,在人体内则会诱发各种老年性疾病。因此,通过研究检测AGEs的含量变化不仅可以应用在医学领域中老年性疾病的鉴定,也可以应用于食品劣变的质量评价。 3 结 论 本研究通过建立ELISA方法鉴定美拉德褐变产物AGEs的含量,配合糖基化产物荧光物质的含量检测来确定乳粉加速贮藏过程中非酶褐变物质的含量,从而确定乳粉化学劣变的程度。通过实验,随着贮藏时间延长褐变产物含量增加,乳粉劣变加速。采用ELISA方法鉴定AGEs的含量,具有特异性强、简便、高效的优势。在本实验中,标准曲线的最低质量浓度取值0.008ng/mL,最低检出质量浓度达到0.006ng/mL,误差率在5%左右,重复性良好。采用ELISA方法可以同时做多个样品,具有处理量大节约时间的优点。ELISA方法结合糖基化产物的荧光物质检测鉴定AGEs含量,为乳粉贮藏过程中的劣变化学反应检测提供了一种简便准确的方法。 参考文献: [1] MORGAN F, NOUZILLE C, BAECHLER R, et al. Lactose crystallisation and early Maillard reaction in skim milk powder and whey protein concentrates[J]. Dairy Science and Technology, 2005, 85(4/5): 315-323. [2] GONZALES A, NARANJO G, LEICA G, et al. Maillard reaction kinetics in milk powder: effect of water activity at mild temperatures [J]. International Dairy Journal, 2010, 20(1): 40-45. [3] THOMSEN M, LAURIDSON L, SKIBSTED L, et al. Temperature Effect on lactose crystallization, Maillard reactions, and lipid oxidation in whole milk powder[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005, 53: 7082-7090. [4] 马志玲, 王延平, 吴京洪, 等. 乳及乳制品加工中的美拉德反应[J]. 中国乳品工业, 2002, 30(3): 8-10. [5] 王惠英, 孙涛, 周冬香, 等. L-赖氨酸与D-核糖的模式美拉德反应及其产物抗氧化性能研究[J]. 食品科学, 2008, 29(5): 112-115. [6] 张曦, 李琦, 景浩. 乳清蛋白-木糖美拉德反应产物的成膜性及其膜包裹对核桃仁脂质过氧化的抑制作用[J]. 食品科学, 2011, 32(5): 58-64. [7] GOLDIN A, BECKMAN J, SCHMIDT A, et al. Advanced glycation end products[J]. Circulation, 2006, 114(5): 597-605. [8] FREIDJA M, TARHOUNI K, TOUTAIN B, et al. The AGE-breaker ALT-711 restores high blood flow-dependent remodeling in mesenteric resistance arteries in a rat model of type 2 diabetes[J]. Diabetes, 2012, 61(6): 1562-1572. [9] WANG Lingjie, LU Lin, ZHANG Fengru, et al. Increased serum high-mobility group box-1 and cleaved receptor for advanced glycation endproducts levels and decreased endogenous secretory receptor for advanced glycation endproducts levels in diabetic and non-diabetic patients with heart failure[J]. European Journal of Heart Failure, 2011, 13(4): 440-449. [10] SHOICHI Y, SEIJIi U, SEIYA O. Food-derived advanced glycation end products (AGEs): a novel therapeutic target for various disorders[J]. Current Pharmaceutical Design, 2007, 13(5): 2832-2836. [11] GOLDBERG T, CAI Weijing, PEPPA M, et al. Advanced glycoxidation end products in commonly consumed foods[J]. Journal of the American Dietetic Association, 2004, 104(8): 1287-1291. [12] AHMED N, BAHAR M, KENNISH L, et al. Assay of advanced glycation endproducts in selected beverages and food by liquid chromatography with tandem mass spectrometric detection[J]. Molecular Nutrition & Food Research, 2005, 49(7): 691-699. [13] 郑文华, 许旭. 美拉德反应的研究进展[J]. 化学进展, 2005, 17(1): 122-129. [14] 刘志强, 侯凡凡, 王力. ELISA法检测人血清晚期糖基化终产物及在血液透析病人的应用[J]. 解放军医学杂志, 2000, 25(6): 391-393. [15] PISCHETSRIEDERB M, MORALESC C, LECLEREA F, et al. Assessment of protein glycation markers in infant formulas[J]. Food Chemistry, 2004, 87(2): 253-259. [16] 肖韦华, 买娜, 王旭峰, 等. 酶联免疫吸附法在植物性食品安全检测中的应用[J]. 食品科学, 2006, 27(12): 920-923. [17] 王守法, 阚春月, 许学书. 酶联免疫吸附试验在食品检测中的应用[J]. 食品科学, 2009, 30(23): 489-493. [18] LIANG Jiehour. Kinetics of fluorescence formation in whole milk powders during oxidation[J]. Food Chemistry, 2000, 71(4): 459-463. [19] BOEKE M. Effect of heating on maillard reactions in milk[J]. Food Chemistry, 1998, 62(4): 403-414. [20] ZAMORA R, HIDALGO F. Coordinate contribution of lipid oxidation and Maillard reaction to the nonenzymatic food browning[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2005, 45(1): 49-59. 收稿日期:2012-08-28 作者简介:刘玲(1973—),女,副教授,博士,研究方向为食品化学与分析。E-mail:liuling4568@sina.com |
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