冷藏期间草鱼肌肉脂质降解的影响因素分析

王建辉，刘冬敏，刘永乐*，王发祥，俞 健，李向红，杨 晶

(长沙理工大学化学与生物工程学院，湖南 长沙 410114)

摘 要：分别以酸价(AV)、过氧化值(POV)、硫代巴比妥酸值(TBARs)作为脂肪的水解、初期氧化和终期氧化指标，结合脂肪酶和脂肪氧化酶活性的动态变化，研究冷藏(2～4℃)条件下草鱼肌肉脂肪的水解、氧化变化规律，探讨光照、脂肪酶及脂肪氧化酶对冷藏草鱼肌肉脂质的影响。结果表明：冷藏过程中，草鱼肌肉脂肪不断发生水解和氧化。避光组和光照组草鱼肌肉脂肪分别从第6天和第4天开始大量水解，肌肉内游离脂肪酸大量积累；脂肪水解的同时，脂肪酸开始氧化，避光组和光照组鱼肉中氢过氧化物大量积累，分别于冷藏的第6天和第8天达最大值；随着氧化进程的发展，体系TBARs值不断升高。光照显著增加了冷藏草鱼肌肉脂肪POV及TBARs值(P＜0.05)，脂肪酶、脂肪氧化酶明显加速了脂质的水解和氧化降解。冷藏条件下草鱼肌肉脂肪的水解和氧化加快，脂肪劣变程度加深。因此，对新鲜草鱼肌肉进行避光和酶钝化处理有利于减少冷藏期间草鱼肌肉脂质的降解，保证肌肉较高的营养价值及加工品质，延长其货架期。

关键词：草鱼；脂质；氧化；水解；光照；脂肪酶；脂肪氧化酶

Factors Influencing Lipid Degradation of Grass Carp Muscle during Cold Storage

WANG Jian-hui，LIU Dong-min，LIU Yong-le*，WANG Fa-xiang，YU Jian，LI Xiang-hong，YANG Jing

(School of Chemistry and Bioengineering, Changsha University of Science and Technology, Changsha 410114, China)

Abstract：The effect of light, lipase and lipoxygenase on lipid oxidation in frozen grass carp muscle during cold storage was investigated. Acid value (AV), peroxide value (POV) and thiobarbituric acid reactive substances (TBARs) were measured as indicators of lipid hydrolysis and initial and final lipid oxidation. During cold storage, the hydrolysis and oxidation of lipids in fish muscle continued. Lipid hydrolysis in large quantities began on the 6th and 4th days of storage in the light and in the dark, respectively, leading to the accumulation of large amounts of free fatty acids. This was accompanied by the occurrence of lipid oxidation and thus the accumulation of large amounts of hydrogen peroxide. The peroxide value (POV) reached maximum during storage on day 6 in the dark and on day 8 in the light. The TBARs value increased as the lipid oxidation continued. The POV and TBARs value became significantly higher during storage in the light (P ＜ 0.05). Both lipase and lipoxygenase were able to considerably accelerate the hydrolytic and oxidative degradation of lipids. In addition, this phenomenon and consequent lipid deterioration were also observed during cold storage. Therefore, dark storage and enzyme inactivation can help reduce the lipid oxidation in grass carp muscle during cold storage, maintain its high nutritive value and processing quality and prolong its shelf life.

Key words：grass carp；fat；oxidation；hydrolysis；light；lipase；lipoxidase

中图分类号：TS254.4 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)18-0276-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201318057

脂肪的水解和氧化是导致水产品腐败变质的主要原因之一[1]。光敏氧化是一种重要的脂肪氧化方式，其速度千倍于脂肪的自动氧化，对不饱和脂肪酸的氧化起决定性作用[2-5]，不同的光谱范围、光强、食物组成及包装材料等均会对食品造成不同程度的影响[6-8]。脂肪酶和脂肪氧化酶是影响脂质降解的主要酶类，脂肪酶催化甘油酯水解成脂肪酸、甘油和其他不完全降解产物；脂肪氧化酶(lipoxidase，LOXs)专一催化具有顺，顺-1,4-戊二烯结构的不饱和脂肪酸及酯的氧化，形成具有共轭双键的过氧化氢衍生物，加速食品中脂质的氧化进程[9]。

草鱼是我国主要的淡水养殖鱼类，富含不饱和脂肪酸，即使在很低的温度条件下鱼体脂质也会发生水解和氧化，光照、脂肪酶、脂肪氧化酶对这些变化起到促进作用[10-13]，它们对淡水产品在加工、储运和销售过程中的不良影响越来越突出[8,14-16]。国内外同时开展光照、脂肪酶以及脂肪氧化酶对淡水鱼类制品的影响作用的研究甚少，本实验主要针对当前市面上诸多冷藏鱼制品多为透明包装，且原料鱼预处理不足的现状，通过对草鱼肌肉脂肪水解、氧化指标的测定，研究2～4℃冷藏过程中影响脂肪降解的重要因素，为草鱼脂肪降解机理、产品质量控制及现代工艺改进提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜草鱼20条(每条质量约2kg左右) 市购。

石油醚(30～60℃沸程)、乙醚、乙醇、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾 天津市光复精细化工研究所；2-硫代巴比妥酸 上海雅吉生物科技有限公司；氢氧化钾、盐酸、酚酞、碘化钾、三氯甲烷、冰乙酸、硫代硫酸钠、可溶性淀粉、乙二胺四乙酸(EDTA) 国药集团化学试剂有限公司；硼酸 汕头西陇化工厂有限公司。

1.2 仪器与设备

UV 2600紫外-可见分光光度计 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；BS124S电子天平 德国赛多利斯集团；FD-1冷冻干燥机、RE-52A旋转蒸发器、SHZ-DIII循环水真空泵、HH-Z1多孔数显水浴锅 西安予辉仪器有限公司；DZX180生化培养箱 上海艾测电子科技有限公司；DS-1高速组织捣碎机 上海标本模型厂；DELTA 320 pH计 上海诚铭科技有限公司；JYL-C012料理机 九阳股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 草鱼肌肉样品的制备

新鲜草鱼经冰水预冷后去鳞、内脏及头、尾，剔除脊骨及主刺，将鱼肉切成3cm2的小块，混匀后随机分成10份，其中5份用透明塑料袋封装，作为光照组，另外5份用不透明塑料袋封装，作为避光组。两组鱼肉置于同一透明玻璃门冰箱，于2～4℃条件下冷藏。实验过程中按期取样，去皮，绞碎备用。

1.3.2 脂肪的提取

每2d取冷鲜保藏切块鱼肉样，去皮，绞碎。冻干后，添加2倍于干肉质量的石油醚(1:2，g/mL)，混匀后密封，于2～4℃冷藏室中浸提48h，抽滤，45℃条件下低压浓缩，挥干溶剂，即得鱼油样。

1.3.3 脂肪总含量的测定

按GB/T 9695.7－2008《肉与肉制品总脂肪含量测定》。

1.3.4 酸价(AV)、过氧化值(POV)的测定

按GB/T 5009.37－2003《食用植物油卫生标准的分析方法》测定。

1.3.5 硫代巴比妥酸值(TBARs)的测定

准确称取0.100g提取的鱼油，测定方法参照路昊等[15]的方法实施。

1.3.6 脂肪酶活性的测定

将1.3.1节处理好鱼肉分别在2～4℃条件下冷藏的第0、2、4、6、8、10天取出避光组和光照组鱼肉样品，按照GB/T 5523－2008《粮油检验：粮食、油料的脂肪酶活动度的测定》中的方法测定草鱼肌肉脂肪酶的活性。

1.3.7 脂肪氧化酶(LOXs)活性的测定

将1.3.1节处理好鱼肉分别在2～4℃条件下冷藏的第0、2、4、6、8、10天取出避光组和光照组鱼肉样品，主要按照Sumner[9]、Fu Xiangjin[11]等的方法测定脂肪氧化酶活性，并作适当修改。具体步骤如下：用pH6.5、0.05mol/L的磷酸钠缓冲液(含1mmol/L EDTA和1mmol/L DTT)提取草鱼肌肉LOXs，经40%饱和度硫酸铵盐析后冷冻离心，再透析得粗酶液；于粗酶液中加入7.5mmol/L亚油酸(含量10%)，25℃条件下反应30min后终止酶促反应，取反应上清液于234nm波长处测定吸光度(钝化的酶液作空白对照液)。

2 结果与分析

2.1 光照对冷藏过程中草鱼肌肉总脂肪含量的影响

冷藏条件下(2～4℃)10d内避光组和光照组草鱼肌肉总脂肪含量的变化如表1所示。冷藏过程中，光照组和避光组的草鱼肌肉总脂肪均随冷藏时间的延长而逐渐降低，特别是冷藏2d后总脂肪含量显著下降(P＜0.05)，冷藏10d后，二者分别比新鲜鱼肉降低20.46%和27.39%。由此说明，冷藏条件下，草鱼肌肉脂肪仍然逐渐降解，光照会加速冷藏草鱼肌肉脂肪的降解。

表 1 光照和避光冷藏条件下草鱼肌肉总脂肪含量的变化

Table 1 Effect of light during cold storage on the total fat content of grass carp muscle as a function of storage time

2.2 光照对冷藏过程中草鱼肌肉脂肪AV的影响

AV是评价油脂劣变程度的一项重要指标，反映脂质水解产生游离脂肪酸的净积累量。在水、脂肪酶、酸或碱的作用下，脂肪中的甘油酯和磷脂等结合脂质都能发生水解，生成大量游离脂肪酸，其水解速率还与水分、微生物污染程度及组织内源酶含量有关[17-18]。从图1可知，冷藏过程中光照组和避光组草鱼肌肉脂肪的AV均随冷藏时间的延长而显著增加(P＜0.05)，特别是冷藏第4天和第6天后，二者的AV均开始急剧升高。冷藏10d后，光照组的AV最高达37.73mg/g，明显高于避光组的18.24mg/g。但从整个冷藏过程来看，光照并对AV并无显著影响(P＜0.05)。由于脂质水解产生的游离脂肪酸容易氧化降解，影响游离脂肪酸的净积累量，最终导致冷藏的第6～8天和第8～10天，光照组和避光组草鱼肌肉脂肪AV增加缓慢。

图 1 光照和避光冷藏条件下草鱼肌肉AV的变化

Fig.1 Effect of light during cold storage on the AV of

grass carp muscle as a function of storage time

2.3 光照对冷藏过程中草鱼肌肉脂肪POV的影响

冷却鱼肉在贮藏过程中脂肪的氧化程度直接决定着鱼肉的品质。在光和水的作用下，脂肪氧化分解，产生很多过氧化物。过氧化物是脂肪氧化第一阶段的产物，是衡量脂肪酸氧化的一级氧化产物。但是过氧化物极不稳定，容易分解成小分子化合物，如醛、酮、酸和羟基酸等[19]，不仅会造成鱼肉色泽、质构、风味的劣变，还会降低鱼肉的营养价值和加工特性。POV主要用于测定系统中的氢过氧化物的含量，通常用POV反映油脂氧化初期的氧化程度。由于过氧化物是油脂氧化的中间产物，一方面随着脂肪的氧化不断形成，另一方面又不断降解，生成小分子的醛、酮等物质，所以在氧化初期，氢过氧化物的形成速度超过分解速度，过氧化值会呈上升趋势，到最高值前的这段时间称为氧化诱导期，随着氧化程度的不断加深，氢过氧化物不断分解，在氧化后期其分解速度超过形成速度，过氧化值则呈下降趋势[20]。

图 2 光照和避光冷藏条件下草鱼肌肉POV的变化

Fig.2 Effect of light during cold storage on the POV of

grass carp muscle as a function of storage time

冷藏条件下草鱼肌肉脂肪POV的变化如图2所示，避光组和光照组草鱼肌肉脂肪的POV都呈先升后降的趋势，二者分别在冷藏的第6天和第8天达到最大值(4.21meq/kg和12.07meq/kg)。随着贮藏时间的延长，氧化生成的初级产物(过氧化物)分解速度大于其生成速度，POV逐渐减少。整个冷藏期间，光照组的POV都显著高于避光组(P＜0.05)。由此说明，在草鱼肌肉脂肪的氧化初期，光照使脂肪氧化反应加速，鱼肉内氢过氧化物大量积累，脂肪的后期氧化加剧，对冷藏草鱼肌肉进行避光处理可减缓其脂肪氧化。

2.4 光照对冷藏过程中草鱼肌肉脂肪TBARs的影响

TBARs值的高低反映脂肪二级氧化产物即最终生成物的多少，它与油脂酸败呈定量相关[12,21]。脂肪氧化后期，过氧化物逐步分解生成低级的醛、酮、醇、羧酸及杂环化合物等，油脂TBARs值不断增大。从图3可知，冷藏条件下避光组和光照组草鱼肌肉脂肪的TBARs值随时间的延长而显著增大(P＜0.05)，并于冷藏的第10天达最大值(5.70mg/100g和8.65mg/100g)。冷藏期间，光照组的TBARs值显著高于避光组(P＜0.05)，且光照组草鱼肌肉脂肪氧化更快，第2天的TBARs值便已接近避光组第8天的TBARs值。由此可见，低温冷藏仍不能抑制草鱼肌肉脂肪的降解，而光照则会进一步加快脂质降解速度，加深脂质降解程度。

图 3 光照和避光冷藏条件下草鱼肌肉脂肪TBARs的变化

Fig.3 Effect of light during cold storage on the TBARs of

grass carp muscle as a function of storage time

2.5 脂肪酶对冷藏草鱼肌肉脂质降解的影响

图 4 光照和避光冷藏条件下草鱼肌肉脂肪酶活性的变化

Fig.4 Effect of light during cold storage on the lipase activity of

grass carp muscle as a function of storage time

脂肪酶是一类具有催化酯类水解、酯化、醇解、转酯化等多种反应的重要酶类[22]，其对草鱼肌肉脂质的作用取决于其在草鱼肌肉中存在的量、释放的时间及其最佳作用基质的量。避光和光照条件下，冷藏期间草鱼肌肉脂肪酶的活性变化如图4所示。冷藏过程中，脂肪酶活性逐渐升高，特别是冷藏4d后，脂肪酶活性显著升高(P＜0.05)，第10天避光组和光照组的酶活力分别达到37.32mg/g和44.75mg/g。这与图1所示的草鱼肉脂肪酸价的变化一致。说明从冷藏4d后，脂肪酶催化甘油三酯等结合脂质水解，释放出大量游离脂肪酸，使得草鱼肌肉脂肪的酸价自冷藏的第6天开始显著增大(P＜0.05)。

2.6 脂肪氧化酶(LOXs)对冷藏草鱼肌肉脂质降解的影响

脂肪氧化酶(LOXs)是一种含非血红素铁的双加氧蛋白酶，专一催化具有顺,顺-1,4-戊二烯结构的不饱和脂肪酸及酯的氧化，形成具有共轭双键的氢过氧化物[9,23]。避光和光照条件下，冷藏期间草鱼肌肉LOXs活性的变化如图5所示。冷藏过程中，草鱼肌肉LOXs活性随冷藏时间的延长而显著增大(P＜0.05)，之后又显著降低(P＜0.05)，避光组和光照组分别于第6天和第8天吸光度达最大值。草鱼肌肉LOXs的这一变化与图2中所示冷藏条件下草鱼肌肉脂肪POV的变化相吻合。冷藏的前6～8d，脂肪氧化酶催化脂肪酸，特别是游离的多不饱和脂肪酸氧化，产生大量氢过氧化物积累于鱼肉中，造成POV值的急剧升高，之后，可能缘于过氧化物的竞争性抑制、肌肉pH值和乳化性能等内环境的改变以及脂肪氧化酶稳定性下降等原因，草鱼肌肉LOXs的活性逐渐降低。这说明在2～4℃冷藏条件下，LOXs仍具有催化脂质氧化的作用，促进脂质的劣变。

图 5 避光冷藏过程中草鱼肌肉脂肪氧化酶活性的变化

Fig.5 Effect of light during cold storage on the lipoxygenase activity of grass carp muscle as a function of storage time

3 结 论

冷藏过程中草鱼肌肉脂质仍在不断水解和氧化降解。冷藏过程中，草鱼肌肉总脂肪含量逐渐下降，光照对其影响显著(P＜0.05)。草鱼肌肉脂肪的AV随冷藏时间的延长显著升高(P＜0.05)，光照组草鱼肌肉脂肪开始大量水解的时间比避光组提前2d(分别为6d和4d)。伴随着脂肪的水解，草鱼肌肉脂肪不断氧化酸败。光照条件下，草鱼肌肉内氢过氧化物的积累时间更长，积累量也明显高于避光组，光照显著促进了草鱼肌肉脂肪的初期氧化(P＜0.05)。随着冷藏时间的延长，草鱼肌肉脂肪的TBARs值显著升高(P＜0.05)，冷藏期间，光照组的TBARs值显著高于避光组(P＜0.05)。草鱼肌肉脂肪酶活性随冷藏时间的延长逐渐增强，脂质水解产生大量游离脂肪酸；脂肪氧化酶的活性先升后降，第6天达最大值，草鱼肌肉脂质的初期氧化加速。因此，即使低温条件下，草鱼肌肉脂肪仍不断水解和氧化，光照会加快其水解、氧化进程，加深脂肪的水解和氧化程度，同时，脂肪酶和脂肪氧化酶明显促进脂质的水解和氧化降解。因此，对新鲜草鱼肌肉进行避光包装与酶钝化处理有利于减少冷藏期间草鱼肌肉脂肪的降解或减缓其水解和氧化进程，减少肌肉营养损失，保证产品质量。

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