DNA条形码技术在鱼肉及其制品鉴别中的应用

李新光1,2,王 璐1,3,赵 峰1,马丽萍1,2,孙 永1,周德庆1,*

(1.中国水产科学研究院黄海水产研究所,山东 青岛 266071;2.上海海洋大学食品学院,上海 201306;

3.中国海洋大学食品科学与工程学院,山东 青岛 266003)

 

要:为鉴别冷冻鱼、冻鱼片和烤鱼片中鱼肉成分的来源,用以判别其与食品标签是否相符,以COI基因为靶点,利用基因克隆和生物信息学方法建立鱼肉制品DNA条形码鉴别技术。对20种冷冻鱼、10种冻鳕鱼片和15种烤鱼片样品进行鉴定,结果表明:20种冷冻鱼鉴定的结果与形态学鉴定的结果一致;10种冻鳕鱼片样品主要以“狭鳕”为主(6/10),存在将“白鳕鱼”标识为“银鳕鱼”的现象;烤鱼片样品与其标签上所标识的原料多数不符,一些烤鱼片还检有月尾兔头鲀。DNA条形码技术是一种简单、有效的分子鉴别技术,可用于冷冻鱼、冻鱼片和烤鱼片中鱼肉成分的鉴定。

关键词:DNA条形码;物种鉴别;冻鳕鱼片;烤鱼片

 

Application of DNA Barcoding to Identify Commercial Fish and Fish Products

 

LI Xin-guang1,2,WANG Lu1,3,ZHAO Feng1,MA Li-ping1,2,SUN Yong1,ZHOU De-qing1,*

(1. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China;

2. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China;

3. College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

 

Abstract:A DNA barcoding technique for species identification of fish ingredients in frozen whole fish, frozen fish fillets and grilled fish fillets by using COI gen as the target was established for use in examining whether the identified species are in accordance with those indicated on the label or not. Twenty fresh fishes, ten frozen cod fillets and fifty grilled fish fillets were identified using the DNA Barcoding technique. The results showed that DNA barcoding identification of the twenty frozen fishes was identical to morphological identification. Out of the ten frozen cod fillets, six samples were identified as Theragra chalcogrammus and some samples of Merluccius productus were labeled as Anoplopoma fimbria. Most of the grilled fish fillets were identified to be not the same as indicated on the label and Lagocephalus lunaris ingredients were detected in some of them. DNA barcoding as a simple and effective molecular identification approach is useful for the identification of fish ingredients in frozen whole fish, frozen fillets and grilled fish fillets.

Key words:DNA barcoding;species identification;frozen cod fillets;grilled fish fillets

中图分类号:TS254.7 文献标志码:B 文章编号:1002-6630(2013)18-0337-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201318069

在生物物种鉴定领域,DNA条形码技术是发展最为迅速的一种新技术,其理论依据是使用一段标准DNA片段,对物种进行准确、快速的鉴定[1-3]。通常采用680bp长的COI序列,97%以上的鱼类可以鉴定到种的水平。DNA条形码鉴别技术要有专门的数据库作为支撑,含有较全面的生物学信息。DNA条形码技术能避免形态学分类的缺陷,对鉴定者的经验和专业知识背景要求较低,只需测序获得样品的线粒体COI序列,并与DNA条形码数据库(http://www. barcodinglife.org)或GenBank数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中该物种及其近似种序列进行比对,根据相互间的遗传距离或相似度即可确定待检样品种属。

目前,国外已将DNA条形码技术应用于食品分析。Haye等[4]利用DNA条形码技术对智利市场上7种螃蟹制品进行鉴别,发现一种螃蟹制品与其商品标签不符;Wong等[5]利用DNA条形码技术对市场上的91个海产品样品进行分析,推断出可能有25%的海产品的标签与实物不符,认为DNA条形码技术是一种经济、有效的可将海产品鉴定到种的分子鉴别技术。在我国,DNA条形码技术用于海洋生物的分类鉴定和动物性珍贵药材的鉴定,而用于食品鉴别的文献报道较少[6-9]。消费者在购买鲜活或冷冻鱼时,多是通过鱼的形态特征来判断鱼的种类,对于一些鱼肉制品(如鱼片、鱼丸等),不易通过形态特征来判断其所用的原料。据报道,近年来我国鱼肉制品的标签存在标识错误的问题,如油鱼冒充鳕鱼[10],严重损害了消费者的利益。

本研究参照Ivanova[11]和柳淑芳[12]等的文献,筛选了COI基因的通用引物,采用基因克隆技术和生物信息学技术用于市场上购买的冷冻鱼、冻鱼片和烤鱼片的鉴别,旨在建立准确、高效的鱼肉制品的鉴定方法,为鱼肉制品的溯源和安全监管提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

2012年5月,从市场上随机抽取45个样品。其中,20种冷冻鱼样品、10种冻鳕鱼片样品、15种烤鱼片样品(7种烤鳕鱼片、8种其他标识的烤鱼片),冷冻鱼及冻鳕鱼片置于-30℃冰箱保存备用,烤鱼片置于常温条件下备用。

无水乙醇、氯仿、异戊醇和异丙醇(分析纯) 上海国药集团化学试剂有限公司;Tris-平衡酚(pH8.0) 北京索莱宝科技有限公司;10×Buffer缓冲液、Taq DNA聚合酶、Top10感受态细胞、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒 天根生化科技(北京)有限公司;dNTPs(2.5mmol/L)、DNA Marker(DL2000)、克隆试剂盒 宝生物工程(大连)有限公司;蛋白酶K 德国Merck公司;Gene Finder核酸染料 厦门百维信生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

Sigma 1-14冷冻离心机 德国Sigma公司;PCR仪 德国Biometra公司;DYCP-31E电泳仪 北京六一仪器厂;凝胶成像系统 法国Vilber Lourmat公司;NanoPhotometerTM微量核酸蛋白测定仪 德国Implen公司。

1.3 方法

1.3.1 冷冻鱼片DNA提取

采用改良后的高盐法[13]。用灭菌的手术刀片取冻鱼片150mg于1.5mL的离心管中,再分别加入400µL的TE(含10mmol/L Tris-HCl和1mmol/L EDTA)、40µL 10% SDS以及8µL 20mg/mL的蛋白酶K,涡旋30s,充分混匀;将离心管置于55~65℃的恒温水浴槽中消化4h,加入300µL 6mol/L饱和的NaCl溶液,高速涡旋30s,12000r/min离心30min;取上清液至新的1.5mL离心管中,加入等体积的酚-氯仿-异戊醇(25:24:1,V/V),缓慢振荡1min,12000r/min离心10min;取上清液至新的离心管中,加氯仿-异戊醇(24:1,V/V)缓慢振荡至乳白色,12000r/min离心10min;取上清液至新的离心管中,加入1/10体积3mol/L NaAc溶液,等体积的异丙醇,冰浴30min,12000r/min离心10min;然后加入800µL 70%乙醇进行洗涤,弃去乙醇,在56℃的烘箱中烘干,然后加入50µL双蒸水,-20℃条件下保存。

1.3.2 烤鱼片DNA提取

1.3.2.1 脱脂前处理

取3g烤鱼片置于50mL的离心管中,用消毒过的剪刀剪碎,然后加入5mL正己烷(氯仿-甲醇、无水乙醇作为对比),涡旋1min;将离心管置于45℃的恒温水浴槽2~3h,然后8000r/min离心5min;弃油脂层,加入10~15mL 70%乙醇溶液,涡旋1~2min,8000r/min离心5min(可视情况重复几次);加入无水乙醇10mL,涡旋1~2min,8000r/min离心10min;弃乙醇溶液,将处理后的鱼肉制品置于60℃热风干燥箱中烘干,研磨成细小颗粒即可用于DNA提取。

1.3.2.2 DNA提取

称取经研磨的鳕鱼片粉末30mg于1.5mL的离心管中,分别加入400µL TE、50µL 10% SDS以及15µL 20mg/mL蛋白酶K,涡旋30s,充分混匀;将离心管置于55~65℃的恒温水浴槽中消化过夜,随后步骤同1.3.1节中所述,结果分析采用SPSS 17软件。

1.3.3 样品DNA 纯度及质量浓度的测定

吸取稀释后的DNA模板2μL,以不含DNA的去离子水作为空白对照,使用微量核酸蛋白测定仪测定DNA模板的质量浓度及A260nm/A280nm。其中A260nm/A280nm用于估测DNA的纯度,而DNA的质量浓度根据以下公式计算:

DNA的质量浓度/(ng/μL)= A260nm×50×稀释倍数

1.3.4 通用引物设计及PCR扩增

COI序列的通用引物设计参照Ivanova[11]和柳淑芳[12]等的方法,目的片断是COI基因靠近5’末端长度为680bp左右的序列,其通用引物由华大基因合成。上游引物FishF1:5’ TCA ACC AAC CAC AAA GAC ATT GGC AC 3’,上游引物FishF2:5’ TCG ACT AAT CAT AAA GAT ATC GGC AC 3’;下游引物FishR1:5’ TAG ACT TCT GGG TGG CCA AAG AAT CA 3’,下游引物FishR2:5'ACT TCA GGG TGA CCG AAG AAT CAG AA 3’。将引物分别混合均匀,终浓度为25μmol/L,-20℃冰箱保存备用。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)采用50μL的体系,DNA模板100~500ng,10×缓冲液(含Mg2+)5μL,dNTPs(各2.5mol/L)4μL,混合的上游引物与下游引物(25μmol/L)各0.6μL,Taq DNA聚合酶(2.5U/mL)0.6μL,加去离子水至50μL。PCR扩增采用升式PCR,反应程序为:94℃、4min;94℃、30s,53℃、40s,72℃、1min,8个循环;94℃、30s,54℃、40s,72℃、1min,8个循环;94℃、30s,55℃、40s,72℃、1min,16个循环;72℃、10min。PCR扩增完成后,经1%琼脂糖凝胶进行电泳分离后,使用数码凝胶成像系统分析扩增产物。

1.3.5 克隆、测序及序列比对

挑选阳性扩增的PCR产物,按照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书的操作步骤,对PCR产物进行纯化,随后与pMD T-18载体连接,导入Top10感受态细胞中,36℃培养过夜,经过蓝-白斑筛选后,挑取3个不同的白色单菌落于LB液体培养基(含有100μg/mL氨苄青霉素)中,在36℃、180r/min的摇床上培养6~8h,经PCR检测后,吸取阳性克隆菌液1mL,送到华大基因进行测序。然后,应用DNAMAN 5.2.2进行多序列比对,绘制同源树。同时,使用BOLD(http://www.boldsystems.org)以及NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)网站的数据库对样品的COI序列进行鉴定以及相似度分析。

2 结果与分析

2.1 冷冻鱼鉴定分析

2.1.1 冷冻鱼COI序列的扩增

348611.jpg 

M. DL2000 Marker;1~20.不同冷冻鱼;空白.以双蒸水代替DNA。

图 1 不同冷冻鱼COI基因的扩增条带

Fig.1 COI gene amplification from different commercial fish

由图1可知,冷冻鱼COI序列均可以用通用引物扩增出来,说明通用引物的通用性高,可用于鱼肉中COI基因的扩增。这可能是由于线粒体DNA在细胞中比细胞核DNA拷贝量大[3]。

2.1.2 冷冻鱼COI测序结果分析

在分析种内种间的遗传距离时,生物条形码联盟推荐使用K-2-P(Kimura-2-parameter)模型计算。同时指出,基于K-2-P模型构建的系统发育树,不是用来做系统发育的研究,仅仅是为了验证物种的单源性和聚类关系[3]。对于物种序列同源性较高的COI序列,DNA条形码技术多采用基于遗传距离的Neighbor Joining法构建进化树[2-3]。虽然这种方法处理较多的COI序列时,速度快又能反映出物种间的亲缘关系,但绘制的进化树难以理解又不能读出物种COI序列间的相似度。为了克服这些缺点,又能验证物种的单源性和聚类关系,本实验采用同源树对样品的COI序列进行聚类分析。

对市场上常见的20不同种属的冷冻鱼,先进行形态学鉴定,然后利用DNA条形码技术进行验证,结果显示:DNA条形码技术鉴定的结果和鱼类形态学鉴定的结果完全一致,且COI序列鉴定后的相似度均大于97.7%(表1)。说明DNA条形码技术很容易将市面上常见的20种鱼类区分开来,可用于冷冻鱼和冷冻鱼肉制品鱼肉成分的种属鉴定。

表 1 不同冷冻鱼在BOLD数据库的鉴定结果

Table 1 Identification of different commercial fish in the BOLD database

样品

拉丁文学名

中文学名

中文

俗名

物种

相似度/%

形态学

鉴定名

鉴定是

否相符

1

Scomberomorus niphonius

蓝点马鲛

鲅鱼

99.5

蓝点马鲛

2

Trichiurus lepturus

白带鱼

带鱼

100

白带鱼

3

Larimichthys crocea

大黄鱼

黄鱼

100

大黄鱼

4

Nemipterus japonicus

金线鱼

黄线

99.6

金线鱼

5

Acanthopagrus latus

黄鳍鲷

黄鳍棘鲷

99.0

黄鳍鲷

6

Hamnaconus hypargyreus

绿鳍马面鲀

马面鱼

100

绿鳍马面鲀

7

Lateolabrax maculatus

花鲈

鲈鱼

99.8

花鲈

8

Rhynchoconger ectenurus

黑尾吻鳗

鳗鱼

99.9

黑尾吻鳗

9

Hypophthalmichthys molitrix

鲢鱼

白鲢

100

鲢鱼

10

Trachinotus ovatus

金鲳鱼

金鲳

99.0

金鲳鱼

11

Scomber japonicus

日本鲭

鲐鱼

100

鲐鱼

12

Thunnus obesus

大眼金枪鱼

金枪鱼

100

大眼金枪鱼

13

Ammodytes personatus

玉筋鱼

面条鱼

99.8

玉筋鱼

14

Collichthys lucidus

棘头梅童鱼

梅童鱼

97.7

棘头梅童鱼

15

Cololabis saira

秋刀鱼

秋刀鱼

99.7

秋刀鱼

16

Pollachius virens

绿青鳕

蓝鳕

100

绿青鳕

17

Theragra chalcogrammus

狭鳕

狭鳕

99.8

狭鳕

18

Larimichthys polyactis

小黄鱼

小黄花

99.4

小黄鱼

19

Psenopsis anomala

刺鲳

南鲳

100

刺鲳

20

Oncorhynchus mykiss

虹鳟

虹鳟鱼

100

虹鳟

 

注:1~20为市面上常见的冷冻鱼,物种相似度以BOLD数据库鉴定的结果为准。

 

2.2 冻鳕鱼片鉴定分析

2.2.1 冻鳕鱼片COI测序分析

对鳕鱼片的COI序列和GenBank数据库收录的常见鳕鱼的COI序列进行聚类分析(图2),结果显示各种鳕鱼均形成独立的分支,其中,鳕鱼与其易混淆鱼类COI序列的相似度为79%,在种的水平上同一种鳕鱼COI序列的相似度为99%或100%,说明在种的水平上狭鳕、太平洋鳕鱼、大西洋鳕鱼、裸盖鱼、小鳞犬牙南极鱼与异鳞蛇鲭及棘鳞蛇鲭很容易区分开来。样品D10、D1可以初步鉴定为小鳞犬牙南极鱼;样品D2、D4、D5、D6、D8和D9可以明确地鉴定为狭鳕;样品D3可以明确地鉴定为大西洋鳕鱼。

348624.jpg 

图 2 食品标签为冻鳕鱼片样品的COI序列与GenBank或BOLD数据库收录的COI序列的聚类同源树

Fig.2 Homology tree based on COI sequences of commercial frozen cod fillets and its related sequences from GenBank or BOLD

2.2.2 冻鳕鱼片鉴定结果

10个冻鳕鱼片样品的鉴定结果均为鳕鱼,存在将“白鳕鱼”标识为“银鳕鱼”的现象,其他冻鳕鱼片样品的鉴定主要以“狭鳕”为主(6/10),只有1个样品为大西洋鳕鱼,说明冻鳕鱼片主要是以价格便宜的狭鳕为原料加工而成的。

表 2 冻鳕鱼片在BOLD数据库的鉴定结果

Table 2 Identification of commercial frozen cod fillets in the BOLD database

样品

拉丁文学名

中文学名

中文

俗名

物种

相似度/%

商品标

签名称

标识是

否相符

D1

Dissostichus eleginoides

小鳞犬牙南极鱼

白鳕鱼

99.9

银鳕鱼片

D2

Theragra chalcogrammus

狭鳕

狭鳕

100

野生狭鳕片

D3

Gadus morhua

大西洋鳕鱼

大头腥

99.9

格林兰真鳕

D4

Theragra chalcogrammus

狭鳕

狭鳕

99.7

鳕鱼片

D5

Theragra chalcogrammus

狭鳕

狭鳕

100

鳕鱼片

D6

Theragra chalcogrammus

狭鳕

狭鳕

99.8

鳕鱼片

D7

Pollachius virens

绿青鳕

蓝鳕

100

鳕鱼片

D8

Theragra chalcogrammus

狭鳕

狭鳕

99.8

鳕鱼片

D9

Theragra chalcogrammus

狭鳕

狭鳕

99.0

鳕鱼片

D10

Dissostichus eleginoides

小鳞犬牙南极鱼

白鳕鱼

100

鳕鱼片

 

注:D1~D10为市面上常见的冻鳕鱼片;物种相似度以BOLD数据库鉴定的结果为准。

 

2.3 烤鱼片鉴定分析

2.3.1 前处理试剂对烤鱼片DNA质量浓度及纯度的影响

为了提取高质量浓度和高纯度的DNA,用3种不同的有机试剂(氯仿-甲醇、正己烷、无水乙醇)对烤鱼片脱脂处理。通过对烤鱼片DNA质量浓度和纯度进行单因素方差分析(表3),发现3种不同的脱脂溶液对DNA质量浓度具有极其显著的差异(P=0.003<0.01),而对烤鱼片DNA的纯度没有显著性差异(P=0.093>0.05)。采用Duncan法对烤鱼片DNA质量浓度和纯度进行分析[14],发现使用氯仿-甲醇(2:1,V/V)和正己烷作为样品的前处理试剂所获得的DNA质量浓度较高,且纯度间没有显著性差异(P=0.058>0.05)。虽然使用氯仿-甲醇作为前处理试剂可获得较高的DNA质量浓度(表4),但氯仿-甲醇混合液具有致癌作用,处理样品后油层不易分离且残留多;而正己烷低毒,通常作为食用植物油的浸提剂,处理样品后油层容易分离且残留少,故选正己烷作为烤鱼片的前处理试剂。

表 3 烤鱼片DNA质量浓度和纯度的方差分析表

Table 3 Variance analysis table for DNA concentration and purity from grilled fillets

变异来源

因变量

平方和

自由度

均方

F

P

试剂

纯度

0.018

2

0.009

2.722

0.093

质量浓度

250416

2

125207

8.074

0.003

误差

纯度

0.060

18

0.003

 

 

质量浓度

279145

18

15508

 

 

 

 

表 4 烤鱼片DNA质量浓度和纯度的Duncan分析表

Table 4 Duncan analysis table for DNA concentration and purity of grilled fish fillets

去油

试剂

样品数

质量浓度/(ng/µL)

纯度/(A260nm/A280nm)

1组

2组

无水乙醇

8

529.063

 

1.95625

正己烷

8

 

701.625

1.96275

氯仿-甲醇

8

 

772.250

2.01763

P

 

1.000

0.272

0.058

 

注:1、2组为统计学的显著性水平分组。

 

2.3.2 烤鱼片COI序列的扩增

348637.jpg 

M. DL2000 Marker;K1~K15. 不同烤鱼片;空白. 以双蒸水代替DNA。

图 3 不同烤鱼片COI基因的扩增条带

Fig.3 COI gene amplification from different commercial baked fish fillets

据相关文献报道,加热和氧化是导致DNA降解的两个重要因素[15-16]。烤鱼片在加工时,经过烘烤处理(150~250℃,3~7min)可能会导致DNA严重的降解。但由图3可以看出,COI基因的通用引物均可将烤鱼片的目的基因扩增出来,说明短时间高温处理不足以破坏烤鱼片全部的线粒体DNA。

2.3.3 烤鱼片鉴定结果

在BOLD和GenBank数据库对15个不同烤鱼片的COI序列进行鉴定(表5),结果表明,绝大多数的烤鱼片与其食品标签不符。其中,7个食品标签为“烤鳕鱼片”的样品均未检出鳕鱼的成分,其鉴定结果共涉及3种鱼类,分别是细纹狮子鱼、花斑蛇鲻、月尾兔头鲀;其他标识的烤鱼片也存在类似的情况,只有“针良鱼片”的鉴定结果与其食品标签相符,其余的都不相符,鉴定结果涉及的鱼类更多,分别是花斑蛇鲻、多齿蛇鲻、龙头鱼、针良鱼、多鳞鱚和黑鳃兔头鲀。由于黑鳃兔头鲀(南方产)和月尾兔头鲀的鱼肉和内脏含有毒素[17],人食用了以黑鳃兔头鲀或月尾兔头鲀为原料生产的烤鱼片,可能会出现中毒症状。

表 5 烤鱼片在BOLD数据库的鉴定结果

Table 5 Identification of commercial frozen cod fillets and grilled fillets in the BOLD database

样品

拉丁文学名

中文学名

中文俗名

物种

相似度/%

商品标

签名称

标识是

否相符

K1

Liparis tanakai

细纹狮子鱼

蓑鲉

99.9

鳕鱼片

K2

Saurida sp.1

花斑蛇鲻

狗母鱼

97.5

鳕鱼片

K3

Liparis tanakai

细纹狮子鱼

蓑鲉

99.9

鳕鱼片

K4

Lagocephalus lunaris

月尾兔头鲀

粟色河鲀

99.9

鳕鱼片

K5

Liparis tanakai

细纹狮子鱼

蓑鲉

99.9

鳕鱼片

K6

Liparis tanakai

细纹狮子鱼

蓑鲉

99.5

鳕鱼片

K7

Lagocephalus lunaris

月尾兔头鲀

粟色河鲀

99.5

鳕鱼片

K8

Lagocephalus inermis

黑鳃兔头鲀

光兔头鲀

99.4

马面鱼片

K9

Saurida sp.1

花斑蛇鲻

狗母鱼

97.7

鰩鱼片

K10

Saurida n.sp.

多齿蛇鲻

丁鱼

99.7

鰩鱼片

K11

Saurida n.sp.

多齿蛇鲻

丁鱼

99.2

马鲛鱼片

K12

Harpadon nehereus

龙头鱼

狗母鱼

99.9

马布鱼片

K13

Hyporhamphus sajori

针良鱼

丁鱼

100

针良鱼片

K14

Sillago sihama

多鳞鱚

船丁鱼

97.8

金梭鱼片

K15

Saurida n.sp.

多齿蛇鲻

丁鱼

99.2

烤鱼片

 

注:K1~K15为市售常见的烤鱼片;物种相似度以BOLD数据库鉴定结果为准。

 

3 讨 论

3.1 鳕鱼与易混淆鱼类的鉴别

鱼类分类学上,“鳕鱼”泛指鳕科鱼类及属于鳕形目相关的品种。根据粮农组织和FishBase两个机构的资料,鳕科约60个品种,鳕形目约500个品种。市面场上常见的鳕鱼有狭鳕、绿青鳕、黑线鳕、大西洋鳕鱼和太平洋鳕鱼等。通常冒充鳕鱼的油鱼为鲈形目蛇鲭科鱼类,其学名是异鳞蛇鲭或棘鳞蛇鲭,俗名为龙鳕鱼、水鳕鱼、玉梭鱼。市场上,鳕鱼还包含一些俗名中带有“鳕”字但亲缘关系较远的名贵鱼类,如裸盖鱼(银鳕鱼)、小鳞犬牙南极鱼(白鳕鱼)和鳞头犬牙南极鱼(白鳕鱼)[18-19]。其中,狭鳕较为常见且价格最为便宜;大西洋鳕鱼、太平洋鳕鱼及裸盖鱼常见价格处于中档水平;小鳞犬牙南极鱼和鳞头犬牙南极鱼稀少价格最为昂贵。根据COI序列的相似度区分,不同品种的鳕鱼与其易混淆鱼COI序列的相似度在78.1%~80.6%之间。

3.2 加工原料和加工条件对DNA条形码技术的影响

通过研究发现,DNA条形码技术适用于含有单一肉类成分鱼肉制品的鉴别,如冷冻鱼片、烤鱼片、罐头制品中鱼肉成分的鉴别。若鱼肉制品含有多种肉类成分,从理论上可以挑选多个单克隆菌体去测序,以达到鉴定多种肉类成分的目的,但这样目的性不强,还会增加检测的费用,如鱼丸(含有多种杂鱼或掺入鸡肉、猪肉)中肉类成分的鉴别。此外,样品DNA模板的获取也是影响鱼肉制品鉴别的另一个重要因素,尤其是一些经过高温高压或深度油炸加工后的鱼肉制品,线粒体DNA出现严重的降解,如一些罐头制品在加工过程中,要经过高温高压灭菌工序,可能使DNA断链或降解,导致DNA提取率降低。此外,罐头制品中还加入了糖、植物油以及各种食品添加剂,这些物质也可能降低DNA的提取率或抑制PCR反应。因此,DNA条形码技术存在局限性,适用于加工条件比较温和、肉类成分单一的鱼肉制品的鉴别。

3.3 DNA条形码技术的优势

目前,鱼肉制品的鉴定技术主要有近红外光谱技术、DNA条形码技术、AFLP(扩增片段长度多态性)技术、SSR标记(微卫星标记)技术等[20-21]。通常近红外光谱技术鉴别鱼肉制品的优点是较为快速,缺点是需要建模、适用范围窄;AFLP 优点是比较可靠、操作简便,但AFLP的谱带可能发生错配或缺失、成本高等[21];SSR标记具有呈共显性遗传,可区分杂合子和纯合子,但在采用SSR 技术时必须知道重复序列两端的DNA 序列的信息,而SSR 标记的等位基因数目多,带型复杂,难以判型,给DNA 指纹识别自动化和规模化带来困难[20-21]。而DNA条形码鉴别技术是以COI基因作为鉴定物种的靶基因,能避免形态学分类的缺陷,对鉴定者的经验和专业知识背景要求较低,此外,DNA条形码鉴别技术还有专门的数据库作为支撑,含有的较全面的生物学信息,截止到2012年6月23日,鱼类条形码的序列库已有49条公开的COI扩增引物,75249条COI序列,8795种被编码的鱼类[19]。随着研究的深入,DNA条形码鉴别技术还可以与基因芯片技术、RFLP(限制性片段长度多态性)、TTGE(时间温度梯度电泳)相结合,达到对肉类成分单一的鱼肉制品更准确、更快速的鉴别[22-24]。

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收稿日期:2012-07-30

基金项目:中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(20603022013018)

作者简介:李新光(1985—),男,硕士研究生,研究方向为水产品质量与安全。E-mail:lixinguang0102@163.com

*通信作者:周德庆(1962—),男,研究员,博士,研究方向为水产品加工与质量安全。E-mail:zhoudq@ysfri.ac.cn