葡萄籽提取物包合物的制备及其表征

巫春宁，林向阳*，王长春，郑为东，叶南慧，吴 佳

(福州大学生物科学与工程学院，福建 福州 350108)

摘 要：以包合率为指标，用羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)制备葡萄籽提取物(GSE)包合物，在单因素基础上，利用正交试验对包埋工艺进行优化，结果显示：最优工艺条件为HP-β-CD质量分数20%、包合温度40℃、包合时间2.0h，此时包合率为98.23%；通过傅里叶红外光谱分析(FI-IR)、场发射扫描电子显微镜(FESEM)、X射线衍射仪表征证明了包合物的形成。GSE通过包合，其稳定性明显提高，在水中的溶解度由87.91μg/mL提高到251.5μg/mL。

关键词：葡萄籽提取物；羟丙基-β-环糊精；包合物

Synthesis and Identification of HP-β-CD Inclusion Complex of Grape Seed Extract

WU Chun-ning，LIN Xiang-yang*，WANG Chang-chun，ZHENG Wei-dong，YE Nan-hui，WU Jia

(College of Biology Science and Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350108, China)

Abstract：The preparation of inclusion complex of grape seed extract (GSE) with HP-β-CD was optimized by orthogonal array design based on one-factor-at-a-time experiments. Incubation in a 20% aqueous solution of HP-β-CD at 40 ℃ for 2 h was found optimal for the preparation of GSE inclusion complex. The interaction between HP-β-CD and GSE was analyzed by IR spectroscopy (FT-IR), field emission scanning electron microscopy (FESEM) and X-ray diffraction (XRD). The aqueous solubility of GSE was increased to 251.5 μg/mL from 87.91 μg/mL as a result of this inclusion treatment, which was accompanied by a remarkable improvement in its stability.

Key words：grape seed extract (GSE)；HP-β-CD；inclusion complex

中图分类号：TS209 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)20-0007-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201320002

我国是葡萄生产大国，每年有500多万吨的产量，其中近一半用作酿造葡萄酒，在酿造过程中会产生大量的废弃残渣，其中包括葡萄籽[1]。葡萄籽提取物(grape seed extraction，GSE)中的主成分——原花青素是目前为止所发现的最强的抗氧化剂和自由基清除剂，能预防许多疾病，流行病学和生物学证实，其有益健康，能防癌、抗心血管紊乱[2]、肥胖、糖尿病[3]及神经组织退化[4]，可减少因低密度脂蛋白的氧化造成的动脉硬化风险[5-6]。它水溶性好，极易被机体吸收，生物利用度高达90%以上，其在体内抗氧化能力是VE的50倍、VC的20倍[7-8]，但原花青素性质不稳定，见光易分解，吸潮，单独添加到食品中较困难，应用包合或微胶囊化技术，使其与外界隔离，可提高其稳定性，最大限度的保持其原有性质和生物活性[9]，扩大在食品领域的使用。

羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)是β-环糊精(β-CD)化学改性而得到的醚化衍生物[10]，不仅具有β-CD良好的包合效果，而且水溶性好，对人体无害[11]，对热稳定[12-13]，GSE被包埋后，可以提高其稳定性和生物利用度。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

羟丙基-β-环糊精 山东滨州志源生物科技有限公司；葡萄籽提取物(原花青素含量为51.94%[14]) 实验室自制；原花青素(C30H26O12)标准品 阿拉丁试剂(上海)有限公司；香草醛、盐酸、乙醇、甲醇等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Nova Nan SEM 230场发射扫描电子显微镜 美国FEI公司；Nicolet-380智能傅里叶红外光谱仪 美国热电公司；X’Pert Pro MPD X射线衍射仪 荷兰飞利浦公司；UV-1100型紫外分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；SC-3612型低速离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；BL150型电子天平 德国Sartotius公司；SIM FD-2.5E 型冷冻干燥机 美国西盟国际公司；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司。

1.3 方法

1.3.1 包合物制备方法

称取一定量的羟丙基-β-环糊精配成所需浓度的水溶液，将定量的葡萄籽提取物(GSE)缓慢加入溶液中，在设定温度的恒温磁力搅拌器下搅拌一段时间，过滤，将滤液置于－20℃冰箱冷冻24h后，置于冷冻干燥机中冻干24h，得到蓬松的包合物固体粉末[15-16]。

1.3.2 包合率计算

精密称取1.00g包合物，加入5.00g甲醇振荡，4000r/min离心20min后，取0.5mL上清液测定吸光度。通过原花青素标准曲线y=1.1752x＋0.0002，R2=0.9981(式中：x为原花青素标品质量/mg，y为吸光度)，得出包合物中原花青素含量。

包合率/%=包合物中原花青素量/投入量×100

1.3.3 单因素试验

按1.3.1节制备方法，以包合率为指标，分别考察温度、转速、时间、HP-β-CD质量分数、GSE投入量对包合率的影响。

1.3.4 正交试验

通过分析，得出对包合率影响较为显著的三因素，HP-β-CD质量分数、温度、时间，以包合率为指标，进行L9(34)正交试验。

表 1 正交试验因素水平表

Table 1 Factors and levels for orthogonal array design

1.4 包合物的表征

1.4.1 傅里叶红外光谱分析(FI-IR)

傅里叶红外光谱法是通过比较客体分子包合前后在红外区吸收的特征差异，来表征包合物是否形成[17]。若形成包合物，主客分子间的非共价键作用，如疏水作用、范德华力和氢键，其键能会减低，相应基团的吸收强度会减弱[18]。由此来表征主客体分子是否产生了包合作用。

分别取适量GSE、HP-β-CD、GSE/ HP-β-CD物理混合物和包合物样品，用KBr压片，扫描波数400～4000cm-1，累积扫描次数32次，进行红外扫描和分析。

1.4.2 场发射扫描电子显微镜(FESEM)

扫描电镜是一种定性的方法，用于观察主分子、客分子、包合物的形态变化[19]。客体分子进入主分子空腔后，其结晶性会降低，或失去结晶性；同时，主分子本身也会因包合了客分子而使自身结构的特定位置、空间结构以及分子晶格等发生改变，因此可通过扫描电镜，初步判断是否形成了包合物。

将GSE、HP-β-CD、GSE/HP-β-CD物理混合物和包合物样品适量经镀金预处理后，用Nova NanoSEM 230场发射扫描电子显微镜观测其形态学特征[20-21]。

1.4.3 X射线衍射法

X射线衍射法是鉴定晶体化合物的常用技术，各晶体物质在相同的角度具有不同的晶面间隔，从而显示不同的衍射峰。通过药物与包合物显示出不同的衍射峰和衍射图谱，验证包合物是否形成。

1.5 包合物溶解度测定

分别将一定量的GSE、GSE/HP-β-CD包合物溶于5mL水中，25℃振荡溶解，4000r/min离心20min，称取1mL上清液，于500nm波长处测定其吸光度，根据GSE的标准曲线计算GSE和包合物在水中的溶解度[22]。

1.6 包合物稳定性实验

1.6.1 光稳定性实验

准确称取一定量的GSE/HP-β-CD包合物和GSE，分别置于透明的培养皿中隔氧，室温(20±5)℃放置，自然光照射，每48h取样测定吸光度变化。

1.6.2 热稳定性实验

准确称取一定量的GSE/HP-β-CD包合物和GSE，分别置于透明的培养皿中，放于50、60、70、80、90℃烘箱内烘20min，测定其吸光度变化。

1.6.3 抗氧化性实验

准确称取一定量的GSE/HP-β-CD包合物和GSE，分别置于透明的培养皿中，避光静放置，每48h取样测定吸光度变化。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 温度对包合效果的影响

图 1 温度对包合率的影响

Fig.1 Effect of temperature on inclusion efficiency

将0.3g葡萄籽提取物缓慢加入40g的HP-β-CD溶液中，固定HP-β-CD溶液质量分数为20%，在1500r/min的恒温磁力搅拌器上包合0.5h，考察不同温度(20、30、40、50、60℃)对葡萄籽提取物包合影响。

图1显示，随着温度的逐步升高(20～40℃)，包合率也随之上升，但当超过40℃时，呈现平缓下降趋势，主要是因为低温下，主分子(HP-β-CD)还未完全舒展开，客分子(GSE)进入HP-β-CD腔体里量较少，但随着温度的升高，分子扩散速度加大，故包合率会上升，后趋于略微下降的平缓趋势，一方面由于包合达到饱和，高温可能会造成包合物的分解，另一方面葡萄籽提取物主要为多酚类物质，受高温会降解[23]。

2.1.2 时间对包合效果的影响

将0.3g葡萄籽提取物缓慢加入40g的HP-β-CD溶液中，固定HP-β-CD溶液质量分数为20%，在1500r/min的恒温25℃磁力搅拌器上包合，考察不同时间(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h)对葡萄籽提取物包合影响。

图 2 时间对包合率的影响

Fig.2 Effect of time on inclusion efficiency

图2显示，包合率会随着包合时间的延长而增大，而后趋于平缓，主要是后期客体分子大部分进入主分子空腔中，主分子包合达到了饱和状态。

2.1.3 转速对包合效果的影响

将0.3g葡萄籽提取物缓慢加入40g的HP-β-CD溶液中，固定HP-β-CD溶液质量分数为20%，恒温25℃磁力搅拌器上包合，考察在不同搅拌转速(600、1000、1500、1900r/min和2300r/min)对葡萄籽提取物包合影响。

图 3 转速对包合率的影响

Fig.3 Effect of rotational speed on inclusion efficiency

图3显示，较低转速(600～1000r/min)有利用主客体分子的充分接触，故随着转速的增大，包合率增大，但转速较大会破坏主分子的空腔结构，不利于包合。因此，综合考虑，选用1000r/min转速进行包合实验。

2.1.4 HP-β-CD质量分数对包合效果的影响

将0.3g葡萄籽提取物缓慢加入40g的HP-β-CD溶液中，固定在1000r/min的恒温25℃磁力搅拌器上包合0.5h，考察不同质量分数的HP-β-CD溶液(10%、15%、20%、25%、30%)对葡萄籽提取物包合影响。

图 4 HP-β-CD质量分数对包合率的影响

Fig.4 Effect of HP-β-CD concentration on inclusion efficiency

图4显示，包合率会随着HP-β-CD质量分数增大而上升，在15%～20%包合率趋于平衡，在20%处，包合率达到最大，而后下降。前期上升，主要是主分子疏水的空腔结构为客分子提供了空间环境，客体分子更容易进入主分子空腔里面；当达到20%时，对于一定量的客体分子而言，包合已经达到平衡，且主分子的不断增加加剧了分子之间的竞争作用，不利于客体分子的进入[24]。

2.1.5 葡萄籽提取物投入量对包合效果的影响

将不同质量的葡萄籽提取物(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g)分别缓慢加入40g的HP-β-CD溶液中，固定HP-β-CD溶液质量分数为20%，在1000r/min的恒温25℃磁力搅拌器上包合0.5h，考察葡萄籽提取物不同投入量对其包合影响。

图 5 葡萄籽提取物投入量对包合率的影响

Fig.5 Effect of grape seed extract amount on inclusion efficiency

图5显示包合率随着葡萄籽提取物投入量的增大而上升，当达到0.3g后趋于平衡，主要是因为一定主分子质量对于客体分子包合是有限的，再增大客体分子投入量对于包合率基本没影响。

2.2 正交试验

表 2 单因素-包合率方差分析

Table 2 Analysis of variance based on one-factor-at-a-time design for inclusion efficiency with various reaction conditions

由表2的单因素方差分析结果，得知HP-β-CD溶液质量分数、温度、包合时间、葡萄籽提取物投入量对包合率影响较为显著因素，但因葡萄籽提取物后期随着其投入量的增大，包合率趋于平稳，没有考察必要，故在葡萄籽提取物最佳投入量的前提下，选择HP-β-CD溶液质量分数、温度、包合时间这三因素进行L9(34)正交试验(表3)，优化包合条件。

表 3 正交试验设计及结果

Table 3 Orthogonal array design and results

由表4方差分析可知，对包合率影响显著的为HP-β-CD溶液质量分数、温度，包合时间的影响不显著。由表3的直观分析，得影响主次为A＞B＞C，即HP-β-CD、温度、包合时间。极差R的大小可知最佳包合工艺为A2B2C2，即HP-β-CD质量分数20%、包合温度40℃、包合时间2h。

表 4 方差分析表

Table 4 Analysis of variance based on orthogonal array design for inclusion efficiency with various reaction conditions

注：*.差异显著(P＜0.05)。

2.3 最佳工艺验证

在HP-β-CD质量分数20%、包合温度40℃、包合时间2h条件下，得出GSE的包合率为98.23%。

2.4 包合物的表征

2.4.1 傅里叶红外光谱分析(FI-IR)

a.羟丙基-β-环糊精；b.葡萄籽提取物；c.物理混合；d.葡萄籽提取物包合物。

图 6 傅里叶红外光谱图

Fig.6 Infrared absorption spectra of GSE, HP-β-CD and their physical mixture as well as inclusion complex

由图6(a线)可知，羟丙基-β-环糊精在于3394cm-1处存在O—H的伸缩振动峰，于2929cm-1处存在C—H键的伸缩振动峰，1156、1082、1032cm-1处存在C—H、C—O键伸缩振动；而葡萄籽提取物(b线)于3385cm-1处存在O—H键的伸缩振动峰，其特征骨架振动主要集中在1000～1650cm-1和700～850cm-1区域。物理混合的红外图谱(c线)具有加和性，是GSE和羟丙基-β-环糊精的重叠，没有显著变化。而包合物的红外图谱(d线)则发生了变化，葡萄籽提取物特征吸收峰消失，强度明显减弱，其 1711cm-1的特征峰在包合物图谱中消失，且包合物基本表现出HP-β-CD的吸收峰，两者谱图相似，这表明葡萄籽提取物进入了HP-β-CD空腔中，证明了包合物的生成。

2.4.2 FESEM分析

葡萄籽提取物、羟丙基-β-环糊精、两者物理混合及包合物的场发射扫描电镜图(图7)表明，葡萄籽(图7a)形态学上为无定形的球状颗粒，而羟丙基-β-环糊精(图7b)为无定形有空腔的球形，物理混合物(图7c)中都有两种颗粒的存在，而包合物(图7d)中，则出现不规则的完全不同于葡萄籽提取物和HP-β-CD的形态，主客体的形态消失，有一些小的无定形不规则的小聚集体的存在，这也初步证明了包合物的生成[17, 25]。

a

b

c

d

a.葡萄籽提取物；b.羟丙基-β-环糊精；c.物理混合；d.葡萄籽提取物包合物。下同。

图 7 场发射扫描电镜图

Fig.7 FESEM micrographs of GSE, HP-β-CD and their physical mixture as well as inclusion complex

2.4.3 X射线衍射分析

图 8 XRD衍射图

Fig.8 XRD curves of GSE, HP-β-CD and their physical mixture

as well as inclusion complex

从图8a、b可知GSE和HP-β-CD在10°～20°衍射角范围内，都有两个宽峰，说明两者都为无定形，而非晶体结构；由图8c可知，其为两者的峰的简单重叠，未形成新的物相；图8d在15°～30°之间只有一个宽峰，也说明了GSE与HP-β-CD发生了作用，形成了新的物相，证实了包合物的形成。

2.5 包合物溶解度

通过实验可得GSE在水中的溶解度为87.91μg/mL，GSE/HP-β-CD在水中的溶解度为251.5μg/mL，包合物在水中的溶解度GSE的3倍，形成的包合物在一定程度上提高了GSE的溶解度，从而提高了其生物利用度。

2.6 稳定性实验

图 9 自然光照对GSE、GSE/HP-β-CD稳定性影响

Fig.9 Effect of sunlight at room temperature on the stability of GSE and GSE/HP-β-CD inclusion complex

由图9可知，GSE对光不稳定，吸光度随着放置时间延长而降低，主要是由于原花青素见光分解，见光时间越长，原花青素降解得越多，由图9知GSE/HP-β-CD包合物提高了GSE的稳定性。

图 10 温度对GSE、GSE/HP-β-CD稳定性影响

Fig.10 Effect of temperature on the stability of GSE and

GSE/HP-β-CD inclusion complex

由图10可知，GSE通过HP-β-CD的包合，热稳定性提高了许多，主要是因为GSE被包合在热稳定好的HP-β-CD空腔中，避免了GSE的直接受热。

图 11 氧气对GSE、GSE/HP-β-CD稳定性影响

Fig.11 Effect of oxygen on the stability of GSE and GSE/HP-β-CD inclusion complex

由图11可知，将GSE和GSE/HP-β-CD避光敞口放置，GSE吸光度的降低速率高于GSE/HP-β-CD包合物，从这点说明了包合提高了GSE的抗氧化稳定性。

综合比较上述可知，GSE/HP-β-CD包合物的光稳定性、热稳定性、抗氧化性能相对于GSE均有提高。

3 结 论

利用溶液法制备包合物，通过正交试验对HP-β-CD包埋GSE条件进行优化，得到包合的主次因素为HP-β-CD溶液质量分数、包合温度、包合时间；最佳包合工艺为HP-β-CD溶液质量分数20%、包合温度40℃、包合时间2.0h。借助FI-IR、场发射扫描电镜、X射线衍射等方法证明了GSE/HP-β-CD包合物的生成。GSE通过包合，其稳定性明显提高，在水中的溶解度也由87.91μg/mL提高到251.5μg/mL.

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