高压-微波法提取花生根中白藜芦醇

陈琼玲，刘红芝，刘 丽，何轩辉，王 强*

(中国农业科学院农产品加工研究所，农业部农产品加工与质量控制重点开放实验室，北京 100193)

摘 要：对高压-微波法提取花生根中白藜芦醇工艺进行研究，在单因素试验的基础上，通过二次旋转回归设计试验确定最佳提取工艺。结果表明：影响白藜芦醇提取率的各因素显著程度为乙醇体积分数＞压力＞保压时间＞料液比；最佳提取条件为乙醇体积分数72%、料液比1:30(g/mL)、压力208MPa、保压时间4min、微波功率320W、微波时间90s，在此条件下白藜芦醇提取率为73.76%，为溶剂1次提取法(乙醇体积分数70%、料液比1:30、提取时间45min)的1.72倍。

关键词：花生根；白藜芦醇；高压-微波提取法；提取率

High Pressure-Microwave Assisted Extraction of Resveratrol from Peanut Roots

CHEN Qiong-ling，LIU Hong-zhi，LIU Li，HE Xuan-hui，WANG Qiang*

(Key Laboratory of Agro-products Processing, Ministry of Agriculture, Institute of Agro-products Processing Science and Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China)

Abstract：The extraction of resveratrol from peanut roots by means of high pressure treatment followed by microwave was optimized using response surface methodology based on a quadratic rotary regression design. Four factors in
decreasing order of their importance in influencing extraction efficiency were ethanol concentration, pressure,
pressure-holding time, solid/solvent ratio. The optimal conditions for resveratrol extraction were determined as 72%, 1:30 (g/mL),
208 MPa, 4 min, 320 W and 90 s for ethanol concentration, solid/solvent ratio, pressure, pressure-holding time,
microwave power and irradiation time, respectively. Under the optimized conditions, the yield of resveratrol was 73.76%, an 1.72-fold increase compared to the single solvent extraction using 70% ethanol as the extraction solvent with a solid/solvent ratio 1:30 for 45 min.

Key words：peanut roots；resveratrol；high pressure-microwave assisted extraction；extraction yield

中图分类号：TS201.1 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)20-0043-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201320009

白藜芦醇(resveratrol)又称芪三酚，化学名称为3,4’,5-三羟基二苯乙烯，是植物为抵抗外界刺激如紫外线、真菌、病毒感染或机械损伤而产生的一种植物抗毒素[1]，具有抗癌、抑菌、抗炎症、保护心血管、调节雌激素、保护神经和肝脏等多种生理功能[2]。目前国内外白藜芦醇主要提取原料为虎杖和葡萄，其资源十分有限。据文献报道，花生根中白藜芦醇含量约为葡萄的908倍[3]，且资源丰富、成本低廉，因此开发花生根中白藜芦醇具有良好的经济效益和广阔的市场前景。

目前白藜芦醇的提取方法主要为溶剂提取法和纤维素酶法。溶剂提取法设备简单，操作容易，但存在生产周期长、有机溶剂用量大、温度高、提取率低等问题[4-5]。纤维素酶法可充分释放细胞内含物，加速有效成分的溶出，但其提取条件苛刻、过程难以控制、生产成本高[3,6]；高压提取法作为一种新型提取技术，具有能耗低、提取率高、可在常温条件下进行等优点[7]；而微波提取法具有操作简便、生产周期短、成本低等优点[8]。廖国平等[9]采用高压法提取虎杖中白藜芦醇，发现其提取率较溶剂法高67.5%。张初署等[10]比较微波法与溶剂法提取花生根中白藜芦醇的效果，发现微波提取4.5min与溶剂法80℃提取2h时提取率相当。本实验采用高压-微波法提取花生根中白藜芦醇，并与溶剂提取法进行比较，以期获得一种环保、高效的白藜芦醇提取工艺，为其开发利用提供理论依据和实际指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

花生根收集于湖北省荆门市花生产区，洗净，烘干，粉碎，过筛(355μm)后备用(水分含量为3.52%)；白藜芦醇标准品 美国Sigma公司；乙腈、冰醋酸(色谱纯) 美国Fisher公司；无水乙醇(分析纯) 北京市化学试剂公司。

1.2 仪器与设备

1525型高效液相色谱仪(配有紫外和示差检测器) 美国Waters公司；101A-2B型电热鼓风箱 上海实验仪器总厂；FDV粉碎机 日本佑崎有限公司；AS 200振动式筛分仪 德国Retsch公司；MX5型微量电子天平 梅特勒托利多仪器(上海)有限公司；THZ-82A恒温水浴振荡器 江苏金坛荣华仪器公司；HPP.L2型超高压处理设备 华泰森淼有限公司；WD800型微波炉 天津LG电子公司；LXJ-ⅡB型低速大容量离心机 上海安亭科学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 白藜芦醇提取工艺

花生根→烘干→粉碎→过筛→提取→离心(4500r/min，10min)→上清液

1.3.2 白藜芦醇提取率的测定

1.3.2.1 色谱条件

采用高效液相色谱对白藜芦醇含量进行测定，条件为：色谱柱：C18柱(150mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-水-冰醋酸(25:75:0.09，V/V)；流速0.7mL/min；检测波长306nm；进样量10μL；柱温30℃[11]。

1.3.2.2 标准曲线的绘制

精密称取12.5mg(精确至0.0001g)白藜芦醇标准品，用甲醇溶解并定容至250mL，得到50mg/L白藜芦醇标准储备液。准确移取1、2、4、6、8、10mL白藜芦醇标准储备液，用甲醇稀释并定容至50mL，得到一系列的标准工作溶液，以峰面积为纵坐标，白藜芦醇质量浓度(μg/mL)为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程：y=1.02×105x＋0.904×105(r2=0.9998)。

1.3.2.3 提取率的计算

白藜芦醇提取率/%=ρV/m×100

式中：ρ为提取液中白藜芦醇质量浓度/(μg/mL)；V为提取液体积/mL；m为原料中白藜芦醇总质量/μg。

1.3.3 花生根中白藜芦醇总量测定

准确称取5g花生根粉末于250mL具塞三角瓶中，加入100mL 70%无水乙醇，于恒温水浴振荡器(160r/min，80℃)中提取45min，离心取上清液，采用高效液相色谱测定白藜芦醇含量。剩余残渣中加入100mL 70%乙醇，搅拌均匀后置于水浴振荡器中继续提取，合并提取液，直至提取液中白藜芦醇含量无显著增加。

1.3.4 高压-微波法提取单因素试验

在其他因素相同的情况下，以白藜芦醇提取率为考察指标，分别研究不同乙醇体积分数(50%、60%、70%、80%、90%、100%)、料液比(1:10、1:20、1:30、1:40、1:50(g/mL))、压力(50、100、200、300、400、500MPa)、保压时间(1、2、3、4、6、8、10min)、微波功率(160、320、480、640、800W)、微波时间(30、60、90、120、150s)对提取效果的影响。其中单因素基本条件为乙醇体积分数70%、料液比1:30、压力200MPa、保压时间2min、微波功率320W、微波时间60s。

1.3.5 二次回归旋转组合设计试验

在单因素试验的基础上，选择乙醇体积分数、料液比、压力和保压时间4个因素进行四因素三水平二次回归旋转组合设计试验，以确定最佳提取条件。

1.3.6 分析方法

利用统计分析软件SAS v8.0专业版进行实验设计，并对实验结果进行分析。

2 结果与分析

2.1 花生根中白藜芦醇总量测定

图 1 花生根中白藜芦醇总量测定

Fig.1 Total resveratrol content in peanut roots

采用溶剂提取法对花生根进行反复多次浸提，测定花生根中白藜芦醇的总量。由图1可知，溶剂1次提取时白藜芦醇的提取率为43.28%，5次提取后合并液中白藜芦醇总量为165.28μg/g，9次提取后白藜芦醇含量无显著增加，因此确定花生根中白藜芦醇总量为165.64μg/g。

2.2 单因素试验

2.2.1 乙醇体积分数对白藜芦醇提取率的影响

在料液比1:30、压力200MPa、保压时间2min、微波功率320W、微波时间60s的条件下，考察乙醇体积分数对白藜芦醇提取率的影响，结果如图2所示。随着乙醇体积分数的增加，提取率明显增大，但当乙醇体积分数超过70%后，提取率逐渐下降。其主要原因是随着乙醇体积分数的增加，提取溶剂极性降低，导致其他脂溶性杂质与白藜芦醇竞争乙醇，从而使其提取率降低。因此确定乙醇体积分数为70%。

图 2 乙醇体积分数对白藜芦醇提取率的影响

Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction efficiency

2.2.2 料液比对白藜芦醇提取率的影响

在乙醇体积分数70%、压力200MPa、保压时间2min、微波功率320W、微波时间60s条件下，考察料液比对白藜芦醇提取率的影响，结果如图3所示。随着提取溶剂的增加，白藜芦醇溶出量迅速增加，在料液比为1:30时达到最大。溶剂量继续增加时，白藜芦醇提取率略有下降。可能是由于提取溶剂用量过大时，其他杂质溶出干扰白藜芦醇的提取，造成提取率下降。因此确定料液比为1:30。

图 3 料液比对白藜芦醇提取率的影响

Fig.3 Effect of solid/solvent ratio on extraction efficiency

2.2.3 压力对白藜芦醇提取率的影响

图 4 压力对白藜芦醇提取率的影响

Fig.4 Effect of pressure on extraction efficiency

在乙醇体积分数70%、料液比为1:30、保压时间2min、微波功率320W、微波时间60s条件下，考察压力对白藜芦醇提取率的影响，结果如图4所示。在50～200MPa时白藜芦醇提取率逐渐增加，200MPa时达到最大，200～500MPa逐渐降低。因为随着压力的升高，花生根细胞壁与细胞膜受到破坏程度逐渐增大，促进了白藜芦醇的溶出，而压力过大时，导致白藜芦醇结构破坏，同时其他杂质溶出增加，使白藜芦醇提取率降低。因此确定压力为200MPa。

2.2.4 保压时间对白藜芦醇提取率的影响

在乙醇体积分数70%、料液比为1:30、压力200MPa、微波功率320W、微波时间60s条件下，考察保压时间对白藜芦醇提取率的影响，结果如图5所示。随着保压时间的延长，白藜芦醇的提取率增加，4min时达到最大，继续增加保压时间，提取率逐渐降低。因此，确定保压时间为4min。

图 5 保压时间对白藜芦醇提取率的影响

Fig.5 Effect of pressure-holding time on extraction efficiency

2.2.5 微波功率对白藜芦醇提取率的影响

在乙醇体积分数70%、料液比1:30、压力200MPa、保压时间2min、微波时间60s条件下，考察微波功率对白藜芦醇提取率的影响，结果如图6所示。白藜芦醇提取率随着微波功率的增加而增加，在320W时达到最大值。但微波功率在320～800W范围内时，提取率随着微波功率的增加而降低，因为微波功率过大时，强烈的热效应会对有效成分产生破坏作用[12]。因此确定微波功率为320W。

图 6 微波功率对白藜芦醇提取率的影响

Fig.6 Effect of microwave power on extraction efficiency

2.2.6 微波时间对白藜芦醇提取率的影响

在乙醇体积分数70%、料液比1:30、压力200MPa、保压时间2min、微波功率320MPa条件下，考察微波时间对白藜芦醇提取率的影响，结果如图7所示。随着微波时间的延长，白藜芦醇提取率逐渐增加，当微波时间为90s时提取率达到最大。微波处理时间继续增加，导致提取温度过高，使白藜芦醇受热分解，提取率逐渐降低。因此确定微波时间为90s。

图 7 微波时间对白藜芦醇提取率的影响

Fig.7 Effect of microwave irradiation time on extraction efficiency

2.3 二次回归旋转组合设计试验

在单因素试验基础上，选择乙醇体积分数(X1)、料液比(X2)、压力(X3)、保压时间(X4)进行四因素三水平二次回归旋转组合设计试验，因素与水平见表1，试验设计及结果见表2。

表 1 二次回归旋转组合设计试验因素与水平

Table 1 Factors and levels used in quadratic regression rotation combination design

表 2 二次回归旋转组合设计试验设计及结果

Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.3.1 回归方程的建立及检验

运用SAS软件进行数据分析，以白藜芦醇提取率为响应值，在α=0.01水平剔除不显著项，得到多元二次回归方程为：

Y= 73.90667＋4.470833X1＋1.216667X3＋0.315X4－12.92833X12－1.0775X1X3－1.0025X1X4－3.840833X22＋0.8375X2X4－6.674583X32＋3.57X3X4－3.622083X42

表 3 方差分析表

Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

注：*.差异显著；**.差异极显著。

由表3可知，回归模型失拟性检验P=0.1888＞0.05，差异极不显著，可以认为所选用的二次回归模型是适当的，所得方程能对响应值进行很好地预测；回归方程的显著性检验P=0.0001＜0.01，差异极显著，且回归模型R=0.9961，说明模型成立且可靠。

2.3.2 各因素影响程度分析

各因素的F值可反映出其对试验指标的重要性，F值越大，表明对试验指标的影响越大。由表3可知，F(X1) = 576.84，F(X2) = 0.22，F(X3)= 42.72，F(X4)= 2.86，即各因素对白藜芦醇提取率的影响程度大小顺序为：乙醇体积分数＞压力＞保压时间＞料液比。

2.3.3 双因素交互作用分析

a.乙醇体积分数和压力

b.乙醇体积分数和保压时间

c.料液比和保压时间

d.压力和保压时间

图 8 各两因素交互作用对白藜芦醇提取率影响的响应面和等高线图

Fig.8 Interactive effect of selected parameters on extraction efficiency

由表3可知，试验所建立的数学模型中X1X3、X1X4、X3X4的交互作用极显著，X2X4交互作用显著。根据分析结果分别绘制双因素交互作用的曲面图和等高线图。由图8可知，4个交互作用响应面均为开口向下的凸性曲面，即在试验范围内存在响应值的极高值。其中，乙醇体积分数响应曲面最陡峭，椭圆形等高线排列最密集，对白藜芦醇提取率影响最大，与F值分析结果相符。

由图8a可知，料液比1:30、保压时间4min时，X1X3交互作用中影响提取率的主要方面是乙醇体积分数(X1)，其曲面呈现陡峭地先增高后降低的趋势。提取压力(X3)接近中心点时提取率最大，而压力偏离中心点越远，提取率越低。

由图8b可知，料液比1:30、压力200MPa时，X1X4交互作用中影响提取率的主要方面是乙醇体积分数(X1)，随着乙醇体积分数的增加，提取率急剧增加后减小。随着提取压力(X3)的增加，提取率逐渐增加后减小，接近中心点时达到最大，但变化较缓慢。由等高线呈椭圆形密集排列可知，二者交互作用十分显著。

由图8c可知，乙醇体积分数70%、压力200MPa时，X2X4交互作用中二者均对响应值起着二次影响作用。随着料液比(X2)的减小与保压时间(X4)的延长，提取率逐渐增加后减小，接近中心点时达到最大。其等高线接近圆形，且分布稀疏，表明其交互作用较弱。

由图8d可知，乙醇体积分数70%、料液比1:30时，X3X4交互作用中影响提取率的主要方面是压力(X3)，其曲面呈逐渐升高后降低的趋势。二者交互作用等高线呈椭圆形且排列密集，因此二者交互作用十分显著。

2.3.4 提取条件优化及验证

对回归方程进行分析，取一阶导数等于零，解方程组可得提取白藜芦醇的最佳理论工艺参数为：乙醇体积分数72%、料液比1:30、压力208MPa、保压时间4min，在此条件下白藜芦醇理论预测提取率为73.91%。为检验响应面法所得结果的可靠性，在上述条件下进行3次重复验证实验，得白藜芦醇提取率为(73.76±0.60)%，与预测理论值相符。

3 结 论

3.1 通过单因素试验和响应面分析研究，确立高压-微波法提取花生根中白藜芦醇最佳工艺条件为：乙醇体积分数72%、料液比1:30、压力208MPa、保压时间4min、微波功率320W、微波时间90s，在此条件下白藜芦醇提取率为(73.76±0.60)%。建立了白藜芦醇提取工艺的多元二次回归模型，拟合程度高，准确有效。各因素对白藜芦醇提取率影响的主次顺序为：乙醇体积分数＞压力＞保压时间＞料液比。

3.2 比较溶剂法与高压-微波法对花生根中白藜芦醇的提取效果可见，溶剂1次提取时间45min，提取率为43.28%，而高压-微波法提取时间5.5min，提取率为73.76%，为溶液1次提取的1.72倍。单辉君等[5]采用溶剂法提取花生根中白藜芦醇，最佳条件下白藜芦醇提取率为0.32%。张初署等[13]采用纤维素酶法提取花生根中白藜芦醇，提取率为0.012%。可见高压-微波法提取时间短、提取率高，是一种高效环保的提取方法。现已有将高压-微波法用于提取牛蒡苷[14]、黄芩苷[15]、银杏叶黄酮[16]等活性物质的实例。该提取法采用全物理过程，提取时间短、温度低、提取率高，达到省时、节能、避免热敏性物质降解的目的，具有良好的应用前景。

3.3 花生根中白藜芦醇含量为46.7～94.3μg/g[17-19]，但均采用1次提取，难以确定花生根中白藜芦醇是否提取完全。且由于花生根中白藜芦醇总量的理论值不明确，现有相关文献报道中常将提取率、得率、提取量等概念混淆不清。本实验采用溶剂法多次提取，确定花生根中白藜芦醇总量为165.64μg/g，为花生根中白藜芦醇总量提供了理论参考值。

3.4 采用乙醇进行提取，清洁安全、易于回收且提取效果好。曹庸[20]比较了甲醇、乙醇、丙酮、异丁醇等28种溶剂对白藜芦醇的提取效果，发现饱和异丁醇为最佳提取溶剂，但其具有刺激性且易燃，工业化生产具有强危险性。因此选用乙醇作为提取溶剂符合生态环保要求，且适合于工业化生产。

参考文献：

[1] BERTEHI A A, GIOVANNNINI L, STRADI R, et al. Kinetics of trans-and cis-reaveratrol (3,4,5-trihydroxystiberne) after red wine oral administration rats[J]. International Journal of Clinical Pharmacology Research, 1996, 16(415): 77-81.

[2] PANDEY K B, RIAVI S I. Anti-oxidative action of resveratrol: implications for human health[J]. Arabian Journal of Chemistry, 2011, 4(3): 293-298.

[3] 高岩峰. 花生植株中白藜芦醇的提取纯化工艺[D]. 哈尔滨: 东北林业大学, 2009: 1-5.

[4] 刘大川, 刘强, 吴波, 等. 花生红衣中白藜芦醇、原花色素提取工艺的研究[J]. 食品科学, 2005, 26(7): 144-148.

[5] 单辉君, 张名位, 张瑞芬, 等. 花生根中白藜芦醇提取工艺的优化[J]. 农业机械学报, 2008, 39(2): 94-138.

[6] 刘树兴, 王轶钦. 响应面法优化虎杖中白藜芦醇提取工艺的研究[J]. 陕西科技大学学报, 2010, 28(1): 70-74.

[7] JUN X. Caffeine extraction from green tea leaves assisted by high pressure processing[J]. Journal of Food Engineering, 2009, 94(1): 105-109.

[8] PROESTOS C, KOMAITIS M. Application of microwave-assisted extraction to the fast extraction of plant phenolic compounds[J]. LWT Food Science and Technology, 2008, 41(4): 652-659.

[9] 廖国平, 贺帅, 张忠义. 均匀设计法优化超高压提取虎杖中虎杖苷和白藜芦醇[J]. 中国中药杂志, 2010, 35(24): 3282-3285.

[10] 张初署, 禹山林, 刘阳, 等. 微波辅助提取花生根中白藜芦醇工艺[J]. 食品科学, 2009, 20(24): 30-33.

[11] 全国粮油标准化技术委员会. GB/T 24903—2010 花生中白藜芦醇的测定高效液相色谱法[S]. 北京: 中国标准出版社, 2011.

[12] 周焕霞, 秦杰, 文连奎. 微波辅助提取花生红衣中白藜芦醇工艺的研究[J]. 农产品加工, 2010(2): 26-29.

[13] 张初署, 禹山林, 潘丽娟, 等. 响应面法优化花生根中白藜芦醇提取工艺研究[J]. 食品科学, 2009, 30(6): 34-38.

[14] 李超, 王卫东, 唐仕荣, 等. 高压微波辅助提取牛蒡中牛蒡苷的研究[J]. 食品科学, 2010, 31(16): 128-134.

[15] 王玉堂, 于永, 汪子明, 等. 高压微波辅助提取法提取牛黄上清丸中的黄芩苷[J]. 高等学校化学学报, 2006, 27(10): 1862-1864.

[16] 倪林, 叶明, 杨必伟, 等. 微波-高压提取银杏叶黄酮工艺条件优化[J]. 食品与生物技术学报, 2012, 31(2): 199-204.

[17] 向海燕, 周春山, 雷启福, 等. HPLC法测定花生根中白藜芦醇的含量[J]. 天然产物研究与开发, 2005, 17(2): 179-181.

[18] KOLISCHA R, PADMANB R. An integrated survey of deterministic project scheduling[J]. The International Journal of Management Science, 2001, 29(3): 249-272.

[19] 张烜, 胡君萍, 韩玫, 等. HPLC法测定花生不同部位中白藜芦醇的含量[J]. 新疆医科大学学报, 2003, 26(5): 440-441.

[20] 曹庸. 虎杖中白藜芦醇提取、纯化技术研究[D]. 长沙: 湖南农业大学, 2001: 25-30.